首医大临床生物化学实验课件17钙镁磷的测定

实验十七偶氮胂Ⅲ法测血钙

【目的要求】1.掌握比色法测血钙2.熟悉血钙测定的其他方法

血浆中约含钙2.1mmol/(8.4～10.2mg/dl)，以三种形式存在：①非扩散钙(non-difusionalcalcium)：是指与血浆蛋白相结合的钙，占血浆总钙的45%；②离子钙(ioncalcium)：是具有生理活性的部分，约占血浆总钙的50%；③络合钙(chelatingcalcium)：主要指与枸橼酸结合的钙，是体内钙的一种运输方式，约占血浆总钙的5%左右。钙离子和络合钙都能透过毛细血管壁，故统称为扩散钙。血钙的测定方法很多，一般可分为总钙测定和离子钙测定法。前者包括同位素稀释质谱法、原子吸收光谱法、分光光度法和络合滴定法等。AAS是最常用的准确测定血浆总钙含量的参考方法，但费用昂贵，不适于常规工作；分光光度法中以甲基百里香酚蓝比色法和偶氮胂Ⅲ比色法最常用。分光光度法已被广泛用自动生化分析议分析。

离子选择电极法测定离子钙已在临床广泛应用。临床应用的方法：离子选择性电极法为主。1．离子钙的测定影响因素：标本pH值的改变，添加剂，标本类型。

迅速、简便、敏感性高，重复性好【参考范围】1.15～1.42mmol/L2．总钙测定方法：滴定法、比色法、火焰分光光度法、原子吸收分光光度法、同位素稀释质谱法、酶法等决定性方法：ID-MS

参考方法：原子吸收分光光度法常规方法：邻甲酚酞络合酮法（o-CPC）

o-CPC是一种金属络合染料，也是酸碱指示剂。在碱性条件下可与钙螯合生成紫红色螯合物，与同样处理的钙标准液比色，可求得血清钙的含量。【参考范围】2.1～2.7mmol/L【实验原理】

在碱性条件下，血清钙与偶氮胂Ⅲ作用生成蓝色复合物，其颜色深浅与钙浓度成正比，通过在660nm波长处测定吸光度的变化值，与经过同样处理的钙校准液进行比较，即可计算出样品中钙含量。

【操作步骤】

测定管（U）标准管（S）空白管（B）试剂（ml）2.02.0

2.037℃恒温5分钟蒸馏水（ml）----0.02标准液（ml）--0.02--血清0.02----混匀，37恒温2分钟，660nm波长，以空白管调零，测定各管吸光度。【计算】样品钙含量（mmol/L）=×2.50【参考范围】血清钙：2.1～2.6mmol/L【临床意义】

（1）低钙血症见于①摄入不足和吸收不良：慢性脂肪性腹泻、阻塞性黄疸；②需要增加：妊娠后期及哺乳期妇女；③吸收减少：佝偻病、甲状旁腺功能减退症；④肾脏疾病：急、慢性肾衰竭、肾病综合征、肾小管性酸中毒；⑤坏死性胰腺炎。（2）高钙血症见于①摄入钙过多：静脉用钙过量、大量饮用牛奶等；②原发性甲状旁腺功能亢进症、肾癌等使血钙升高；③服用维生素D过多，钙吸收作用增强；④骨病：变形性骨炎、转移性骨癌、多发性骨髓瘤等，骨溶解增加；⑤具有异位内分泌作用的肿瘤；⑥长期制动引起骨骼脱钙。【评价】

1.线性范围：0.00～6.00mmol/L，γ≥0.99。

2.精密度：批内、批间平均CV分别≤5.0%

3.准确度：不准确度≤10%

4.试剂空白吸光度值≤0.35。5.血红蛋白和胆红素对测定结果无明显干扰。【注意事项】1.样品中钙含量超过5.00mmol/L，则用生理盐水稀释后测定，结果乘以稀释倍数。2.测试温度无严格规定，但色素对温度敏感，应保持反应体系恒温。3.高脂样本会引起测定结果假性升高，可用样本空白管校正。4.反应形成的色素可稳定1小时。

5.所用试验器材必须清洁，没有钙污染。

6.试剂与样品量可根据需要按比例改变。

7.试剂使用后立即关紧瓶盖，避免污染。

8.使用肝素作为抗凝剂时浓度不能太高，每毫升血液中肝素浓度应小于50单位。不能使用草酸盐、枸橼酸盐、EDTA等作抗凝剂。实验十七钙镁试剂比色法测血镁【目的要求】1.掌握比色法测血镁2.熟悉血镁测定的其他方法镁的代谢含量:

血浆中的镁浓度约0.67～1.23mmol/L约占体重的0.03%正常成人含镁约20～28g.分布：

约60%以磷酸镁及碳酸镁的形式存在于骨组织中骨骼肌中含镁约占体内总镁量的20%～30%，其余约10%分布在其它组织中；从体液中镁的分布看，细胞内液的镁的含量约占总量的39%，是细胞内仅次于钾的主要阳离子。仅有约1%的镁存在于细胞外液中。

部位：小肠上段吸收，吸收率只有30～40%。

吸收：排泄：肾是体内镁的主要排泄途径，也是血浆镁水平调节的主要器官。

1、原子吸收分光光度法2、甲基麝香草酚蓝比色法：金属络合指示法3、Calmagite比色法（钙镁试剂法）4、达旦黄比色法：染料结合法【实验原理】

血清中的镁在碱性条件下，与金属色原染料钙镁试剂（calmagite)反应生成紫红色络合物。颜色深浅与镁的浓度成正比，与同样处理的标准品比较，可以求得镁的含量。【操作步骤】

测定管（U）标准管（S）空白管（B）试剂（ml）2.0

2.0

2.037℃恒温5分钟蒸馏水（ml）--

--0.02标准液（ml）--0.02--血清0.02----混匀，37恒温2分钟，540nm波长，以空白管调零，测定各管吸光度。【计算】样品镁含量（mmol/L）=×1.0【参考范围】血清镁：0.67～1.04mmol/L血清镁升高：肾上腺皮质功能低下、白血病、关节炎、多发性骨髓瘤、肾功能衰竭时尿镁排出减少等。血清镁降低：营养不良、急性胰腺炎、慢性酒精中毒、过量使用维生素D等。此外，应用新生霉素、庆大霉素、洋地黄等药物后会引起血清镁降低。【评价】

1.线性范围：2.0mmol/L±10%。

2.精密度：批内、批间平均CV分别≤5.0%

3.准确度：不准确度≤10%

4.试剂空白吸光度值≤1.10。5.胆红素小于342umol/L，TG小于11.3mmol/L,蛋白小于100g/L对结果无明显干扰。【注意事项】1.试剂宜置于塑料瓶中保存，氰化钾按规定使用及保存。2.测试温度无严格规定，但色素对温度敏感，应保持反应体系恒温。反应形成的色素可稳定1小时。3.高脂样本会引起测定结果假性升高，可用样本空白管校正。4.尿液标本应当用浓盐酸酸化至PH=1.0，如有沉淀形成，加温到60度，使其完全溶解。

5.所用试验器材必须清洁，没有镁污染。

6.所用试剂具有毒性和腐蚀性，请勿用口吸吸管，如有污染，应立刻用大量流水冲洗。实验十八还原钼蓝法测血清磷

磷在体内的含量仅次于钙，约占成人体重的1％。其中70%~90％沉积于骨骼中，10％~30%存在于细胞内。磷是在空肠内与钙一起被吸收，在骨骼中沉积。在骨组织中主要以无机磷的形式存在，即与钙构成骨盐成份。在软组织中的磷主要以有机磷、磷脂和核酸的形式存在。人体是按一定的钙磷比例动用骨骼中的磷。血浆中的磷分为有机磷和无机磷两类，有机磷主要为磷脂，无机磷主要包括蛋白结合磷和非蛋白结合磷两个部分。后者又称为滤过磷，占血浆无机磷的绝大部分（平均占90％）。血浆无机磷主要以磷酸盐的形式存在，主要包括：HPO42－、HPO4－、HPO43－。生化测定的血清磷是指血清无机磷，因此血磷测定对了解骨矿物代谢特别是磷代谢有重要临床价值。

血液中的磷(phosphorus)主要有两种形式：有机磷和无机磷。血清无机磷含量与血钙有一定关系，两者浓度的乘积为一常数（以mg/dl浓度计算，乘积等于40）。磷参与机体糖、脂类及氨基酸的代谢，是骨盐的主要成分，也是转运能量的物质，磷酸盐是调节酸碱平衡的重要缓冲体系之一。血磷浓度没有血钙稳定，它不但随年龄的增长而变化，在同一天也会有较大的生理变化。人体内的磷元素尚不能直接测定。在临床化学实验室进行的无机磷测定实际上只是直接分析磷酸盐阴离子（H2PO4-，HPO42-）。1．磷钼酸还原法2．磷钼酸非还原法标本中的磷酸盐与钼酸生成无色的磷钼酸，用还原剂将磷钼酸还原成蓝色复合杂聚物钼蓝，620nm进行比色分析。临床实验室较多采用。

血清中无机磷在酸性溶液中与钼酸铵作用形成的磷钼酸铵杂聚化合物，在340nm或325nm波长的吸光度值与无机磷含量成正比，与标准品比较可计算出标本无机磷含量。适用于微量无机磷的测定。

3．酶法嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）和黄嘌呤氧化酶（XOD）偶联并以过氧化物酶（POD）为指示剂的方法，可用于常规标本的自动分析。【参考范围】0.6～1.6mmol/L【目的要求】1.掌握此法测血磷的原理。2.熟悉血磷测定的其他方法【实验原理】

利用磷在酸性溶液中与钼酸铵反应生成磷钼酸复合物，用对甲氨基酚硫酸盐还原生成钼蓝，与同样处理的标准液进行比色，可求得血磷的含量。试剂中加入聚山梨酯-80以抑制蛋白质干扰。【操作步骤】

测定管（U）标准管（S）空白管（B）去离子水（ml）----0.1磷标准液（ml）--0.1--血清0.1----显色液（ml）4.04.0

4.0混匀，37度恒温10分钟，650nm波长，以空白管调零，测定各管吸光度。【计算】样品磷含量（mmol/L）=×1.29【参考值】成人0.97～1.62mmol/L；儿童1.45～2.10mmol/L【临床意义】1.低磷血症见于①摄入不足和吸收减少：饥饿或恶病质、吸收不良综合征、呕吐、腹泻、长期应用含铝的制剂等；②磷转移入细胞内：静脉注射葡萄糖、胰岛素及碱中毒、妊娠等；③丢失过多：血液透析、肾小管酸中毒、急性痛风等；④其他：如酒精中毒、糖尿病酮症酸中毒、维