第十七章 细胞工程(胡以平)

第十七章细胞工程（cellengineering）第一节概述第二节动物细胞工程涉及的主要技术第三节动物细胞工程的应

内容第一节概述

是在细胞水平上，采用细胞生物学、发育生物学、遗传学及分子生物学等学科的理论与方法，按照人们的需要和设计对细胞的遗传性状进行人为修饰，以获得具有产业化价值或其他利用价值的细胞或细胞相关产品的综合技术体系，也称细胞技术。细胞工程是现代生物技术（biotechnology）的基本组成部分之一。

一、细胞工程（cellengineering）

是指应用生命科学和工程学的基本原理及其相关技术，对微生物、动物或植物等有机体进行人工操作或改造，以实现人类某些特殊需求的综合性技术体系。又称生物工程（bioengineering）。二、生物技术（biotechnology）旧石器时代，神农氏传授种植谷物的方法。新石器时代，利用谷物造酒，世界上最早的发酵技术。周代后期，豆腐、酱油和醋的制作技术，沿用至今。公元10世纪，开始使用预防天花的活疫苗，并在人群中广泛接种，以后通过丝绸之路传至欧洲。三、生物技术发展简史—中国三、生物技术发展简史—西方公元前6000年前，苏美尼尔人和巴比伦人已开始制作啤酒。公元前4000年前，埃及人开始制作面包。1860年，巴斯德单一霉菌纯粹培养技术。1878年，啤酒酵母单一培养技术。1881年，细菌的纯粹培养技术。1929年，青霉素发现。1946年，用细菌生产出氨基酸。1952年，用微生物转化荷尔蒙获得成功。1953年，沃森和克里克提出了DNA双螺旋结构。1972年，美国斯坦福大学构建了第一个重组DNA分子。1977年，在美国旧金山建立了世界上第一家遗传工程公司。传统生物技术（traditionalbiotechnology）：旧时期的制造酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶及其他食物的传统工艺。现代生物技术（modernbiotechnology）：上世纪新出现的各种生物技术。四、生物技术分类基因技术—基因工程细胞技术—细胞工程基因酶技术—酶工程发酵技术—发酵工程蛋白质技术—蛋白质工程五、现代生物技术的五大体系六、现代生物技术的安全性与伦理问题转基因是否会破坏重要生长基因或激活癌基因？生物武器？环境危害？克隆人问题？基因诊断是否会侵犯人类隐私权？宗教问题？动物保护问题？重要生物技术的垄断？……第二节动物细胞工程涉及的主要技术

细胞工程

微生物细胞工程植物细胞工程动物细胞工程动物细胞工程所涉及的研究领域

生产医用蛋白生产基因工程动物核移植与动物克隆组织工程细胞治疗一、大规模细胞培养（large-scalecellculture）

是在人工条件下（设定pH、温度、氧溶等），高密度大规模的在生物反应器（bioreactor）中培养细胞用于生产生物产品的技术，它是细胞工程的重要组成部分。（一）大规模细胞培养的原则1、增加培养容积2、增大细胞的附着面积3、抑制细胞凋亡4、无血清培养

首要考虑因素培养的容积越大，细胞的产量就越高是提高悬浮生长细胞产量的最重要因素1、增加培养容积

提高细胞产量的另一个重要因素培养容器中添加细胞附着生长的支持物常用的支持物主要有：微载体（microcarrier）中空纤维（hollowfiber）微胶囊（microcapsule）

2、增大细胞的附着面积高分子微细实心颗粒，100～300μm集单层培养和悬浮培养的特点于一体增大细胞附着面积十分明显（1）微载体（microcarrier）HEK292cellsonmicrocarriersinfectedwithAdenoviruswithGFPmarkerGlassBallSpinnerSystem

CellsonmicrocarrierGCStechnologyenableslifescienceresearcherstomimicinvivomorphologyinaninvitroenvironment

半透膜性两端开口的中空纤维，直径约200μm

细胞附着于外表面，内部有培养液通过利于分泌型表达蛋白的纯化，不易放大培养

（2）中空纤维（hollowfiber）Cross-sectionthroughhollowfiberculturesystemshowingextracapillaryspaceHollowFiberCellCultureSystem

半透性膜所围成的囊，直径200μm左右细胞生长在囊的内壁细胞密度大(108/ml),产物浓度高,分离纯化相对简单需研究人员自行制备（3）微胶囊（microcapsule）FluorescencemicroscopyimageofFITC-peroxidesloadedpolypeptidemicrocapsulesAscanningelectronmicroscopeimageofafracturedmicrocapsule,oncefilledwithhealingagent3、抑制细胞凋亡

培养的后期，维持细胞的高活力是关键细胞凋亡是大规模培养时细胞死亡的主要原因细胞静止（cellrest）技术可以有效降低营养成分消耗和代谢毒物产生，对提高培养细胞表达目的蛋白的产率是一种有效的手段4、无血清培养血清培养基与无血清培养基的比较血清培养基无血清培养基质量稳定性存在批次的差异有明确的质量标准，避免了批次差异培养基成分影响细胞生长的因子多、复杂程度高、不明确因素多成分明确，培养基可针对不同的细胞株进行成分优化，以达到最佳培养效果与产品纯化的关系血清中蛋白含量>45g/l，成分复杂，且易被病毒或支原体污染，不利于下游纯化工作，产业化成本高下游产品纯化容易，产品回收率高，不存在病原体污染问题，易于产业化实用性适用细胞谱系较宽适用细胞谱系窄。对某于具体的某种细胞的培养，通常摸索其培养条件。由于培养基的黏度小，其细胞在培养过程中易受机械损伤（二）大规模细胞培养系统1.悬浮培养系统2.气流驱动培养系统3.微载体培养系统4.灌注培养系统1.悬浮培养系统（suspensionculturesystem）

细胞产量是最高的仅适合于悬浮生长细胞

旋转细胞培养系统（RotaryCellCultureSystem,RCCS）2.气流驱动培养系统（airliftculturesystem）被成功培养的细胞有：HeLa、BHK21、人类原始淋巴细胞以及植物细胞等凡适合于在搅拌悬浮培养体系中生长的细胞都可以在本培养体系中生长，如用于制备单克隆抗体的杂交瘤细胞不需要发动机和搅拌装置3.微载体培养系统（microcarrierculturesystem）微载体与搅拌悬浮培养相结合的一种培养体系适于贴壁生长细胞的大规模培养微载体培养技术复杂

4.灌注培养系统（perfusionculturesystem）可使细胞始终处于一个较好的营养状态和生存环境可以在“旧”培养基中连续收集培养细胞所分泌的某些产物可以根据特殊的要求，通过改变培养液的组成实现对于细胞状态的人为调控

ABCDABCD（三）影响细胞生长的因素1.量化评估大规模培养细胞的营养需求2.探索大规模培养细胞合适的生存环境3.鉴定细胞的健康状况二、核移植（nucleartransfer）

是指利用显微注射装置，将一个细胞的核植入于另一个已经去核的细胞中，以得到重组细胞的技术。通常所说的核移植，则是指将一个二倍体的细胞核植入于另一个已经去核的细胞（受精卵或处于MⅡ期的卵母细胞）中，以得到重组细胞，并使其在一定环境中生长发育，最后获得新的个体的综合技术体系。

去/取核（A/B）新核/移入（C/D）（一）核移植技术的基本技术流程1．受体细胞的选择早期多采用受精卵（合子）细胞作为受体细胞，后发现处于MII期的卵母细胞更适合作受体细胞。受精卵及处于MII期卵母细胞的细胞质，可使所植入的细胞核基因组的发生重编程（reprogramming），以致处于不同分化程度的供核细胞得以去分化、恢复到全能性状态。由此获得的重构卵，进入到正常的发育程序，从而获得遗传背景完全源于供核细胞的动物个体。2．供核细胞的选择供体细胞主要有两大类：早期采用胚胎细胞作为供核细胞。现已知，未分化的原始生殖细胞（PGCs）与胚胎干细胞（ES细胞）、胎儿体细胞、成年体细胞甚至是高度分化的神经细胞、淋巴细胞等均可作为供核细胞的来源。对不同供核细胞来源的克隆研究结果表明，克隆效率一般随其供核细胞分化程度的提高而下降。3．去核细胞核移植能否成功的关键与前提。目前的去核方法主要有以下几种：（1）紫外线照射去核（2）盲吸法去核（3）蔗糖高渗处理去核法（4）透明带打孔去核法（5）超速离心法

4．重构胚的组建

通常做法：采用显微操作，直接将供核细胞移植到已去核的MII期卵母细胞（或受精卵）的透明带下，然后通过细胞融合（电融合或仙台病毒介导），使供核细胞与受体细胞发生融合，实现细胞核与细胞质的重组。存在问题：供核细胞质参与重构胚，这有可能导致克隆动物组织细胞中线粒体的多样性。另一种做法：以显微针抽吸供核细胞，分离出其细胞，然后将核直接注入已去核的受体细胞中，直接构成重组胚，该法主要被用于克隆小鼠的制作。5．重构胚的激活正常受精过程中，会发生一系列的精子激活卵母细胞的事件。因而，在重构胚组合成功后，也必须要模拟体内的自然受精过程，对重构胚施以激活。激活通常采用化学激活与电激活方法。激活处理后的重构胚，继续培养后，能够卵裂的，表明重构胚已激活。否则，则激活失败。6．重构胚的培养与移植重构胚激活后，需经一定时间的体外培养，或放入中间受体动物（家兔、山羊等）的输卵管内孵育培养数日，待获得发育的重构胚（囊胚或桑椹胚）后，方可将之移植至受体的子宫里，经妊娠、分娩获得克隆个体。（二）核移植技术可使用不同的供核细胞胚胎细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易成体细胞核移植：细胞分化程度高，恢复全能性不容易1938年，Spemann，两栖类动物细胞核移植。1952年，Briggs和King，青蛙细胞核移植。1963年，童第周，金鱼等鱼类核移植成功。1981年，Illmensee和Hoppe，哺乳动物克隆试验。1983年，Solter和McGrath，小鼠胚胎细胞和内细胞团细胞为供核细胞获得克隆后代。1984年，Willadsen，世界上第一只以未分化的胚胎细胞为供核细胞的核移植绵羊。1995年7月，Wilmut等，已分化的胚胎细胞作为供核细胞，克隆了Megan和Morag。1．胚胎细胞核移植

克隆羊Megan和Morag1962年，Gorden，紫外线照射方法，非洲爪蟾的未受精的卵细胞的核失活，同种爪蟾的小肠上皮细胞的核植入其中，结果约1％的重组卵发育为成熟的爪蟾。这一成功，标志着由体细胞核培育动物的技术体系在两栖类获得了成功。1997年2月23日，Wilmut等，乳腺细胞作为供核细胞，成功地培育了克隆羊“多莉”（Dolly）。1997年7月，Wilmut等，以培养的皮肤成纤维细胞为供核细胞，成功地培育了克隆羊“Polly”。2．成体细胞核移植这一成果的重要生物学意义：它证明了一个已完全分化的动物体细胞仍然保持着胚胎细胞的全部遗传信息，并且经此技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性形成完整个体。它的成功提示我们可以按照人的意志去改选、生产物种。多利羊的诞生及生长表明，利用克隆技术复制哺乳类动物的最后技术障碍已被突破，在理论上已成为可能。DollyasalambwithhersurrogatemotherDolly,firstmammalclonedfromanadultcellDolly,asanadultCatcloneDonor Surrogatemotherwithclone(Cc)Outof87implantsonlyCcsurvivedtobirthCcasanadultEpigenetics/biotech/day1.htmlPigletsclonescreatedbyPLLTherapeuticsin2000Thepigletscarryasilencedcopyofalpha1,3galactosyltransferase,orGT,anenzymeinvolvedinorganrejectionInordertoguaranteecompatibilityasecondGTgenemustalsobesilenced（三）人类治疗性克隆

humantherapeuticcloning三、基因转移技术GeneTransfection

基因移转是实现细胞表型定向改造的基本技术之一。目前已被有效使用的方法有很多，分为物理法、化学法和生物法三大类。1.电穿孔法利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米大小的微孔，使外源DNA转移到细胞中。该方法简单，广泛运用于培养细胞的基因转移，基因转移效率最高可达10-3。（一）物理和化学转化法2.显微注射法显微注射法主要用于制备转基因动物。该方法转入的基因随机整合在染色体DNA上，有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或点突变，但这种方法应用范围广，转基因长度可达数百kb。显微操作系统显微注射3.脂质体包埋法将待转化的DNA溶液与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性剂存在的条件下形成包埋水相DNA的脂质体结构。当这种脂质体悬浮液加入到细胞培养皿中，便会与受体细胞膜发生融合，DNA片段随即进入细胞质和细胞核内。该方法基因转移效率很高，据报道最高时，100%离体细胞可以瞬时表达外源基因。转染复合物形成过程示意图脂质体膜融合4.磷酸钙转染法

受二价金属离子能促进细菌细胞吸收外源DNA的启发，人们发展了简便有效的磷酸钙共沉淀转化方法。此法将待转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，然后加入CaCl2溶液混匀，此时DNA与磷酸钙共沉淀形成大颗粒；将此颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37℃下保温4～16h；除去DNA悬浮液，加入新鲜培养基．继续培养7天即可进行转化株的筛选。在上述过程中，DNA颗粒也是通过胞饮作用进入受体细胞的。5.DEAE-葡聚糖法

最早的动物细胞转化方法是将外源DNA片段与DEAE-葡聚糖等高分子碳水化合物混合，此时DNA链上带负电荷的磷酸骨架便吸附在DEAE的正电荷基团上，形成含DNA的大颗粒。后者黏附于受体细胞表面，并通过其胞饮作用进入细胞内。但这种方法对许多细胞类型的转化率极低。

通过病毒感染的方式将外源基因导入动物细胞内是一种常用的基因转导方法。根据动物受体细胞类型的不同，可选择使用具有不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为转化载体。目前常用的病毒载体包括：DNA病毒载体（腺病毒载体、腺相关病毒载体、牛痘病毒载体）、反转录病毒载体和慢病毒载体等。用作基因转导的病毒载体都是缺陷型的病毒，感染细胞后仅能将基因组转入细胞，无法产生包装的病毒颗粒。（二）生物转化法

腺病毒科为线型双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个成员，分两个属：哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属。目前已鉴定的人腺病毒有6个亚属．其中常用来构建载体的腺病毒主要是C亚属的2型（Ad2）和5型病毒（Ad5）。腺病毒感染人体细胞是裂解型的，不会致癌，但对啮齿目动物细胞来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。腺病毒基因组DNA全长36kb，其包装上限为原基因组的105％，即37.8kb。

腺病毒作为转化载体的特点是：基因组重排率低，安全性好，不整合染色体，不导致肿瘤发生；宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂周期要求不严格；外源基因在载体上容易高效表达。病毒载体也具有一些缺点，如所有的病毒载体都会诱导产生一定程度的免疫反应，都或多或少的存在一定的安全隐患，转导能力有限，以及不适合于大规模生产等。

第三节动物细胞工程的应用一、生产医用蛋白

单克隆抗体的生产

B淋巴细胞杂交瘤技术

复杂的人体蛋白的生产

真核细胞表达体系（CHO细胞）组织型纤溶酶原激活剂（tPA）凝血因子Ⅷ

促红细胞生成素1975年GKohler和CMilstein建立了B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。B淋巴细胞杂交瘤技术将淋巴细胞产生单一抗体的能力和骨髓瘤无限增生的能力巧妙地结合起来，并可进一步筛选获得专一性的抗体。单克隆抗体的最主要的优点在于它的专一性、均质性、灵敏性以及无限量制备的可能性。（一）单克隆抗体的生产单克隆抗体的生产单抗在生物工程技术中占有很重要的地位，其用途包括以下几方面：①作为体外诊断试剂；②作为体内诊断试剂；③作为导向药物的载体。导向药物是指对病变部位具有特异选择性的药物，将来抗癌药物、抗生素等的导向制剂将普遍取代目前的常规药。④作为治疗药物用于治疗的单克隆抗体必须具有专一性高、稳定性好、亲合力强、分泌量大、针对非脱落抗原在靶细胞上的分布密度高等特点，但这是很难获得的。此外，近来也有报道用单克隆抗体检测工业生产及各种焊缝管道中的早期腐蚀；作为某些化学工业的催化剂等。由于微生物缺乏蛋白翻译后的加工修饰系统，故许多人体蛋白必须用真核动物细胞表达。第一个由重组哺乳动物细胞规模化生产的医用蛋白是“组织型纤溶酶原激活剂”（tPA）的溶血栓药物。另一个由哺乳动物细胞生产的人重组蛋白是凝血因子VIII。人凝血因子VIII是一种需要修饰才有活性的蛋白质，故必须采用重组哺乳动物细胞进行生产。此外，生物活性严格依赖于糖基化修饰的人促红细胞生成素（EPO）也必须用动物细胞生产，用于治疗因肿瘤化疗或肾脏疾病所致的红细胞减少症。（二）获得复杂人体蛋白二、生产基因工程动物

基因工程动物（genetically

engineeredanimal）是通过遗传工程的手段对小鼠基因组的结构或组成进行人为的修饰或改造，并通过相应的动物育种技术，最终获得修饰改造后的基因组在世代间得以传递和表现的工程化动物。

人们可以在动物基因组中引入特定的外源基因，使外源基因与动物本身的基因组整合，培育出可将外源基因稳定的遗传给下一代的转基因动物（transgenicanimal），也可以在动物基因组的特定位点引入所设计的基因突变，导致基因失活或替换，培育出基因剔除动物（geneknock-outanimal）或基因重组动物（geneknock-inanimal）。转基因动物（transgenicanimal）正常动物基因组引入病毒基因组模拟病毒性疾病的发病过程，进行药物有害型和有效性评价引入药用蛋白基因生产药用蛋白引入靶DNA研究目的基因的功能超级小鼠（supermouse）表达绿色莹光蛋白（GFP）基因的转基因小鼠组织特异性表达报告基因LacZ的转基因小鼠TransgenicPig:XenotransplantationRosengardAM,etal.Tissueexpressionofhumancomplementinhibitor,decay-acceleratingfactor,intransgenicpigs.Apotentialapproachforpreventingxenograftrejection.Transplantation.199515;59(9):1325-33.BrandlU,etal.TransgenicAnimalsinExperimentalXenotransplantationModels:OrthotopicHeartTransplantationinthePig-to-BaboonModel.TransplantProc.2007;39(2):577-8.Transgenicpigsexpressingcomplementinhibitor,humandecay-acceleratingfactor（hDAF,衰变加速因子）将外源DNA注射入受精卵的雄原核内Micromanipulatorsystemfortransgene

转基因动物生物反应器是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白。用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕）个体等。转基因动物生物反应器

（transgenicanimalbioreactors）

乳腺生物反应器(mammaryglandbioreactor)，或称动物个体乳腺表达系统，即用于在乳腺中生产生物活性物质的转基因动物。将某种具有重要价值的生物活性蛋白的基因导入动物的受精卵中培养出转基因动物，使外源基因在动物的乳腺中高效表达并分泌到乳汁中，再从乳汁中提取目的基因产物。AtransgenicindustryforfutureTransgenicsheep

Tracy,atransgenicsheep,1999.

WrightG,CarverA,CottomD,etal.Highlevelexpressionofactivehumanalpha-1-antitrypsininthemilkoftransgenicsheep.Biotechnology(N.Y.)1991;9:830-4.www.beep.ac.uk/content/456.0.htmlAATandTransgenicsheephttp://www.scienceandsociety.co.uk/pr/632030877/Science_&_Society_Picture_Library_10319243.jpgGMsheepgrowbigger,producemoremilkandwool

Agroupoftransgenicsheep,geneticallymodifiedwithanextracopyofsheepgrowthhormonegene,inafield.WebsterandPeterTransgenicGoat'sMilkKicksUpImmunity

transgenicgoatscansuccessfullyproducemilkcontainingtheenzymeLysozyme,andthatthismilkexhibitsanantibacterialeffectwhenfedtoyounggoatsandpigs./media/inline/0007602B-78B7-14D2-B8B783414B7F0000_1.gifAugust04,2006

TransgenicChickenHatchingtheGoldenEgg:ANewWaytoMakeDrugs”inScienceVol.300,730,2May,2003.

FirstTransgenicPigsPhoto:Leanerporkchopsfromageneticallyengineeredpig.BeltsvilleAreaphoto

/history/photos/1980_1.htmlBaconThat'sGoodForYou?ResearchersCreatePigsThatProduceHeart-healthyOmega-3FattyAcids

Ofthesepigletlittermatesphotographedthreeweeksafterbirth,theoneinthemiddleandoneontherighthavetheomega-3fattyacidgene.(Photocredit:UniversityofMissouri-Columbia)

http:///releases/2006/03/060327084435.htm(Nat.Biotechnol.24,435–436,2006)去除特定的内源基因基因剔除（Knockout）动物正常动物基因组研究相应的功能丧失定时定点去除特定的内源基因建立特定基因缺陷型小鼠品系，作为医药研究的动物模型组成型基因剔除小鼠诱导型基因剔除小鼠Knockout小鼠建立过程ImpairedNociceptionandPainSensationinMiceLackingtheCapsaicinReceptorCaterinaetal.

Science14April2000:

Vol.288.no.5464,pp.306-313

基因重组（Knock-in)动物Myf5+/+Myf5-/-MygKi/Myg5美国麻省理工学院Jaenisch实验室（用肌细胞生成素基因（MygKi）替代Myf5基因）三、组织工程（tissueengineering）是指应用工程学和生物学的原理和方法来研究正常或病理状况下哺乳动物组织的结构、功能和生长的机理，进而开发能够修复、维持或改善损伤组织的人工生物替