CN110780003A 一种工业大麻花叶中大麻二酚和四氢大麻酚含量的测定方法 （云南绿新生物药业有限公司）

(72)发明人刘胜贵王钲霖马海悦付彬彬一种工业大麻花叶中大麻二酚和四氢大麻短短21.一种工业大麻花叶中大麻二酚和四氢大麻酚含量的测定方法，其特征在于，包括如(1)将新鲜工业大麻花叶样品于烘箱中60℃下干燥，粉碎机粉碎，混匀待测；(2)准确称取花叶样品于离心管中，加入有机溶剂，超声提取，离心收集上清液，残渣重(3)用高效液相色谱仪对待测液进行检测，所述高效液相色谱仪流动相为水和乙腈，等度洗脱；(4)使用外标法定量：用大麻二酚、四氢大麻酚标准对照品配得系列对照品溶液，外标法测得大麻花叶待测液中大麻二酚、四氢大麻酚的含量。2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述大麻花叶为9月采摘的成熟工业大麻的叶和花苞组合物，60℃干燥至水分小于5%,粉碎机粉碎至20目。3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述有机溶剂为色谱纯溶剂，为甲醇、乙醇、正己烷、乙酸乙酯中一种或两种混合物，有机溶剂所用体积量与花叶样品质量比为5~4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于超声时间为5min~30min,超声功率为250W,工作频率为40kHz。5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述离心的转速为5000~10000转/分6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述高效液相色谱仪品牌型号为安捷伦1260;所述流动相乙腈为色谱纯，水为去离子水，乙腈与水的比例为(60%~80%):(20%~40%),等度洗脱，流速为0.8mL/min~1.2mL/min;所述高效液相色谱仪进样量为8uL~12uL;所述高效液相色谱仪柱温为20℃~40℃;所述高效液相色谱仪检测波长为210nm~7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述所述大麻二酚、四氢大麻酚标准对照品溶液购自美国Sigma公司，配制成系列对照品溶液，进高效液相色谱仪检测，以物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。3一种工业大麻花叶中大麻二酚和四氢大麻酚含量的测定方法技术领域[0001]本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种工业大麻花叶中大麻二酚和四氢大麻酚含量的测定方法。背景技术[0002]工业大麻是指四氢大麻酚(THC)含量低于0.3%的大麻，我国将工业大麻称为汉麻，是大麻科大麻属一年生草本植物，大麻中的主要活性成分是大麻素类化合物，目前已知天然大麻素有70种，主要用于某些神经系统疾病中的多发性硬化症、运动性神经疾病、慢性顽固性疼痛和药源性呕吐，另外，对青光眼、哮喘和心血管疾病也有一定作用。最常见的成分为四氢大麻酚(THC)与大麻二酚(CBD),不同的大麻花叶中，含有不同含量的四氢大麻酚与大麻二酚。[0003]相比之下，大麻二酚的药用价值较高，四氢大麻酚则具有神经致幻作用，能够使人产生幻觉，被联合国禁毒公约列为与海洛因、可卡因并列的三大毒品之一，这成为许多国家禁种大麻的原因。随着人们对大麻的深入研究，发现大麻二酚能阻碍四氢大麻酚对人体神健。在不对任何认知系统造成明显损害的前提之下，大麻二酚具备解救、抗焦虑和压力等功作用。除了药用价值，大麻二酚产品呈现多元化发展，完美适应保健品市场更新迭代的速可根据消费者的需求制成各种口味或浓度的大麻二酚营养品。[0004]据权威数据统计，在未来十年内，全球约1%的人口可能在一生中的某个时候成为潜在的大麻二酚产品使用者。目前，大麻二酚(CBD)成为大麻研究新的热点，而大麻二酚主要从工业大麻花叶中提取，故准确测定花叶原料中的大麻二酚含量十分重要。在我国允许种植的工业大麻是整株四氢大麻酚含量在0.3%以下的大麻品种。但提取大麻二酚时，一般使用的是活性大麻素含量较高的嫩叶和花苞，提取过程中产生的四氢大麻酚含量往往高于0.3%。在《云南省工业大麻种植加工许可规定》中也明确指出，工业大麻花叶加工提取的四氢大麻酚含量高于0.3%的产品，适用毒品管制的法律、法规。因此，尽管种植的是工业大麻品种，但用于提取大麻二酚时，仍需关注四氢大麻酚的含量。基于此，开发一种能够准确测定工业大麻花叶中四氢大麻酚、大麻二酚含量的检测方法十分必要。发明内容[0005]本发明使用甲醇超声提取工业大麻花叶中的大麻二酚和四氢大麻酚，用高效液相色谱仪检测，外标法进行定量，能够准确、快速的检测大麻花叶中的大麻二酚和四氢大麻酚4(1)本发明提供了一种工业大麻花叶中大麻二酚和四氢大麻酚含量的测定方法，包括如下步骤：①将新鲜工业大麻花叶样品于烘箱中60℃下干燥12小时(水分小于5%),粉碎机粉碎至[0007]②准确称取花叶样品于离心管中，加入有机溶剂，超声提取，然后离心收集上清[0008]③用高效液相色谱仪对待测液进行检测，高效液相色谱仪流动相为水和乙腈，等度洗脱。[0009]④使用外标法定量：用大麻二酚、四氢大麻酚标准对照品配得系列对照品溶液，外标法测得大麻花叶待测液中大麻二酚、四氢大麻酚的含量。[0010](2)进一步的，步骤①中所述大麻花叶为9月采摘的成熟工业大麻的叶和花苞组合乙酯中一种或两种混合物，有机溶剂所用体积量与花叶样品质量比为5~20:1。[0012](4)优选地，步骤②中所述有机溶剂为色谱纯甲醇，甲醇体积与大麻花叶质量比为[0013](5)进一步的，步骤②中所述超声时间为5min~30min。[0014](6)优选地，步骤②中所述超声时间为20min,超声功率为250W,工作频率为40kHz。[0015](7)进一步的，步骤②中所述离心转速为5000~10000转/分钟，时间为5~10分钟。[0016](8)优选地，步骤②中所述离心转速为10000转/分钟，离心时间为5分钟。[0017](9)进一步的，步骤③中所述高效液相色谱仪品牌型号为安捷伦1260;所述流动相乙腈为色谱纯，水为去离子水，乙腈与水的比例为(60%~80%):(20%~40%),等度洗脱，流速为0.8mL/min~1.2mL/min;所述高效液相色谱仪进样量为8uL~12uL;所述高效液相色谱仪柱温为20℃~40℃;所述高效液相色谱仪检测波长为210nm~230nm。[0018](10)优选地，步骤③乙腈与水的比例为65%:35%,流速为1mL/min;进样量为10uL;色谱柱为AgilentZORBAXEclipsePlusC18,柱温为30℃,检测波长为220nm。[0019](11)进一步的，步骤④中所述大麻二酚、四氢大麻酚标准对照品溶液购自美国Sigma公司，浓度为1mg/mL的大麻二酚、四氢大麻酚标准品溶液分别用色谱纯甲醇稀释为仪检测，以物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。①本发明用甲醇进行超声提取大麻花叶中的大麻二酚和四氢大麻酚，实验操作简单，处理时间短，检测结果准确。[0021]②本发明用去离子水和乙腈作为流动相、等度洗脱，目标物峰形好、分离度好。本发明流动相使用纯水，无需配置缓冲盐，能够延长色谱柱等仪器部件的使用周期，仪器维护简单。附图说明[0022]图1大麻二酚标准对照品色谱图。5[0023]图2大麻二酚标准曲线。[0024]图3四氢大麻酚标准对照品色谱图。[0025]图4四氢大麻酚标准曲线。[0026]图5实施例2大麻花叶样品色谱图。[0027]图6实施例3大麻花叶样品色谱图。[0028]图7实施例4大麻花叶样品色谱图。具体实施方式[0029]以下实施例仅是对本发明予以解释说明，并未对本发明的保护范围进行任何限制。对于本领域技术人员而言，凡未脱离本发明技术精神所作的同等实施方式或变更均在本发明的保护范围之内。(1)将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时(水分小于5%),粉碎机粉碎至20目，混匀待测。[0031](2)准确称取花叶样品0.5g于离心管中，加入10mL甲醇，超声提取10分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10mL甲醇重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪(温度40℃)浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10mL容[0032](3)高效液相色谱仪(安捷伦1260)仪器条件设置为：流动相色谱纯乙腈与去离子水的比例为70%:30%,等度洗脱，流速为0.8mL/min;进样量为10uL。色谱柱为AgilentZORBAXEclipsePlusC18,柱温为30℃;检测波长为220nm。[0033](4)系列对照品溶液配置：大麻二酚、四氢大麻酚标准品溶液购自美国Sigma公司，浓度为1mg/mL的大麻二酚、四氢大麻酚标准品溶液分别用色谱纯甲醇稀释为1ug/mL、4ug/色谱仪检测，以物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。[0034](5)外标法定量：在上述色谱条件下，待测样品用液相色谱进行检测，对照大麻二酚、四氢大麻酚标准对照品的对应保留时间，记录大麻二酚、四氢大麻酚的峰面积值，将峰面积带入外标曲线，即可得到待测液中大麻二酚、四氢大麻酚的浓度，进而计算得大麻花叶样品中大麻二酚、四氢大麻酚的含量。(1)将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时(水分小于5%),粉碎机粉碎至20目，混匀待测。[0036](2)准确称取花叶样品1.0g于离心管中，加入10mL甲醇，超声提取20分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10mL甲醇重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪(温度40℃)浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10mL容[0037](3)高效液相色谱仪(安捷伦1260)仪器条件设置为：流动相色谱纯乙腈与去离子水的比例为65%:35%,等度洗脱，流速为1mL/min;进样量为10uL;色谱柱为AgilentZORBAXEclipsePlusC18,柱温为30℃;检测波长为220nm。6[0038](4)系列对照品溶液配置同实施例1。(1)将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时(水分小于5%),粉碎机粉碎至20目，混匀待测。[0041](2)准确称取花叶样品1.0g于离心管中，加入10mL乙醇，超声提取20分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10mL乙醇重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪(温度40℃)浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10mL容[0042](3)高效液相色谱仪(安捷伦1260)仪器条件设置同实施例2。[0043](4)系列对照品溶液配置同实施例1。(1)将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时(水分小于5%),粉碎机粉碎至20目，混匀待测。[0046](2)准确称取花叶样品1.0g于离心管中，加入10mL正己烷+乙酸乙酯混合液(体积比为9:1),超声提取20分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10mL正己烷+乙酸乙酯混合液重复超声提取仪(温度40℃)浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10mL容量瓶中，正己烷+乙酸乙酯混合液定[0047](3)高效液相色谱仪(安捷伦1260)仪器条件设置同实施例2。[0048](4)系列对照品溶液配置同实施例1。[0050]备注：由图7可知，用正己烷-乙酸乙酯做提取溶剂，29(1)将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时(水分小于5%),粉碎机粉碎至20目，混匀待测。[0052](2)准确称取花叶样品2g于离心管中，加入10mL甲醇，超声提取30分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10mL甲醇重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪(温度40℃)浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10mL容[0053](3)高效液相色谱仪(安捷伦1260)仪器条件设置为：流动相色谱纯乙腈与去离子水的比例为60%:40%,等度洗脱，流速为1mL/min;进样量为10uL;色谱柱为Agilent