CN110869496A 用于大麻素家族的戊烯化聚酮的重组生产系统 （海湾医学公司）

(19)中华人民共和国国家知识产权局(21)申请号201880042070.X(22)申请日2018.05.10(30)优先权数据(85)PCT国际申请进入国家阶段日(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2018/0321552018(87)PCT国际申请的公布数据WO2018/209143EN2018.11(71)申请人海湾医学公司地址美国内华达州(74)专利代理机构北京市金杜律师事务所代理人陈文平徐志明C12N15/52(2006.C12N15/81(2006.孙建萍(54)发明名称用于大麻素家族的戊烯化聚酮的重组生产系统(57)摘要21.一种生产大麻素产物的方法，该方法包括在其中表达由外源多核苷酸编码的产物并产生2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸的条件下，培养修饰的重组宿主细胞，所述细胞包含：(i)编码将脂族羧酸转化成酰基CoA硫酯的酰基-CoA合成酶的第一外源多核苷酸；(ii)编码从酰基CoA硫酯和丙二酰CoA产生四酮的二羟基戊基苯甲酸合酶的第二外源(iii)编码2-烷基-4.6-二羟基苯甲酸环化酶的第三外源多核苷酸；和将2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸在体外转化成大麻素产物。2.权利要求1的方法，其中所述2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸环化酶是二羟基戊基苯甲酸环化酶。3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸是二羟基戊基5.权利要求1至4任一项的方法，其中所述2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸环化酶包含DABB结构域。6.权利要求1至5任一项的方法，其中所述第二和第三外源多核苷酸作为双顺反子mRNA表达。7.权利要求3的方法，其中所述转化步骤包括形成包含二羟基戊基苯甲酸、香叶醇和有机溶剂的反应混合物并将所述反应混合物维持在足以产生大麻萜酚酸(CBGA)的条件下。8.权利要求7的方法，其中所述反应混合物进一步包含酸。9.权利要求8的方法，其中所述酸是对甲苯磺酸。10.权利要求7-9任一项的方法，其中所述有机溶剂是甲苯。11.权利要求7-10任一项的方法，其中所述反应混合物包含所述宿主细胞。12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述修饰的重组宿主细胞是经遗传修饰以敲除13.权利要求1-11任一项的方法，其中所述2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸是所述大麻素产14.权利要求1-11任一项的方法，进一步包括将所述2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸转化成所述大麻素产物。15.一种修饰的重组宿主细胞，其包含：(i)编码将脂族羧酸转化成酰基CoA硫酯的酰基-CoA合成酶的第一外源多核苷酸，其中所述酰基-CoA合成酶是revS多肽或CsAAE3多肽；(ii)编码二羟基戊基苯甲酸合酶的第二外源多核苷酸；和(iii)编码2-烷基-4.6-二羟基苯甲酸环化酶的第三外源多核苷酸。16.权利要求15的修饰重组宿主细胞，其中所述2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸环化酶是截短的二羟基戊基苯甲酸环化酶。17.权利要求15的修饰重组宿主细胞，包含编码异戊烯基转移酶的第四外源多核苷酸，所述异戊烯基转移酶催化香叶基-焦磷酸与2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸的偶联以产生酸性大麻素。18.权利要求15的修饰重组宿主细胞，其中所述第一、第二或第三外源多核苷酸中的一个或多个存在于自主复制表达载体中。319.权利要求18的修饰重组宿主细胞，其中所述第一、第二或第三外源多核苷酸中的至少两个存在于同一自主复制表达载体中并表达为多顺反子mRNA。20.权利要求19的修饰重组宿主细胞，其中所述第二和第三外源多核苷酸表达为双顺21.权利要求18的修饰重组宿主细胞，其中所述第一、第二或第三外源多核苷酸中的至少两个存在于同一自主复制表达载体中并且与各自的启动子可操作地连接。22.权利要求15的修饰重组宿主细胞，其中所述第一、第二或第三和第四外源多核苷酸存在于两个或更多个自主复制表达载体中。23.权利要求15至22任一项的修饰重组宿主细胞，其中所述修饰重组宿主细胞是经遗传修饰以敲除PAD1和FDC1芳族脱羧酶基因表达的酵母细胞。24.权利要求18的修饰重组宿主细胞，其中所述自主复制表达载体是酵母人工染色体。25.权利要求15的修饰重组宿主细胞，其中所述第一、第二或第三外源多核苷酸中的一个或多个整合至宿主基因组中。26.权利要求15的修饰重组宿主细胞，其中一个或多个外源多核苷酸通过逆转座子整合引入所述重组宿主细胞中。27.权利要求15至26任一项的修饰重组宿主细胞，其中所述外源多核苷酸中的一个或多个的表达通过醇脱氢酶-2启动子驱动。28.权利要求17的修饰重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含一个或多个选自以下三个外源多核苷酸的另外的外源多核苷酸：编码戊烯醇和异戊烯醇激酶的外源多核苷酸；编码在外源戊烯醇和异戊烯醇存在下生长时产生二甲基烯丙基焦磷酸和异戊烯基焦磷酸的激酶的外源多核苷酸；和编码香叶基-焦磷酸合酶的外源多核苷酸。29.权利要求15的修饰重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含所有三个另外的外源多核苷酸。30.权利要求28的修饰重组宿主细胞，其中所述一个或多个另外的外源多核苷酸存在于自主复制表达载体中。31.权利要求30的修饰重组宿主细胞，其中所述一个或多个另外的外源多核苷酸存在于自主复制表达载体中，所述自主复制表达载体包含所述第一、第二、第三或第四外源多核苷酸中的一个或多个。32.权利要求28的修饰重组宿主细胞，其中所述一个或多个另外的外源多核苷酸整合至宿主染色体中。33.权利要求28的修饰重组宿主细胞，其中所述另外的外源多核苷酸通过逆转座子整合引入宿主细胞中。34.权利要求15至33任一项的修饰重组宿主细胞，其中所述另外的外源多核苷酸中的一个或多个的表达通过醇脱氢酶-2启动子来驱动。35.权利要求15至34任一项的修饰重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自酿酒酵母酵母(K.marxianus)、毕赤巴斯德酵母(Pichiapastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)和曲霉属(Aspergillus)的细胞。36.一种修饰的重组宿主细胞，其包含：(i)编码戊烯醇和异戊烯醇激酶的第一外源多4核苷酸；(ii)编码在外源戊烯醇和异戊烯醇存在下生长时产生二甲基烯丙基焦磷酸和异戊烯基焦磷酸的激酶活性的第二外源多核苷酸；(iii)编码香叶基-焦磷酸合酶的第三外源多核苷酸；和(iv)编码催化香叶基-焦磷酸与2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸的偶联以形成酸性大麻素的异戊烯基转移酶的第四外源多核苷酸。37.权利要求36的修饰重组宿主细胞，其中所述第一、第二、第三或第四外源多核苷酸中的一个或多个存在于自主复制表达载体中。38.权利要求37的修饰重组宿主细胞，其中所述第一、第二、第三或第四外源多核苷酸中的至少两个存在于同一自主复制表达载体中并表达为多顺反子RNA。39.权利要求37的修饰重组宿主细胞，其中所述第一、第二、第三或第四外源多核苷酸中的至少两个存在于同一自主复制表达载体中并且与各自的启动子可操作地连接。40.权利要求37的修饰重组宿主细胞，其中所述第一、第二、第三和第四外源多核苷酸存在于两个或更多个自主复制表达载体中。41.权利要求37的修饰重组宿主细胞，其中所述第一和第二外源多核苷酸存在于同一载体上。42.权利要求37的修饰重组宿主细胞，其中所述自主复制表达载体是酵母人工染色体。43.权利要求37的修饰重组宿主细胞，其中所述第一、第二、第三或第四外源多核苷酸中的一个或多个整合至宿主基因组中。44.权利要求37的修饰重组宿主细胞，其中所述第一、第二、第三或第四外源多核苷酸中的一个或多个通过逆转座子整合引入宿主细胞中。45.权利要求36的修饰重组宿主细胞，其中所述酸性大麻素是CBGA或次大麻酚酸46.权利要求36的修饰重组宿主细胞，其中所述2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸通过外源提47.权利要求36的修饰重组宿主细胞，其中在宿主细胞内表达所述2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸在所述宿主细胞内表达并且所述宿主细胞进一步包含编码二羟基戊基苯甲酸合酶基因的第五外源多核苷酸、编码2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸环化酶的第六外源多核苷酸；和编码酰基-CoA合酶基因的第七外源多核苷酸。48.权利要求47的修饰重组宿主细胞，其中所述2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸环化酶是修饰的二羟基戊基苯甲酸环化酶。49.权利要求36的修饰重组宿主细胞，进一步包含编码大麻素合酶的外源多核苷酸，所述大麻素合酶催化宿主细胞中产生的所述酸性大麻素化合物中间体转化以形成中性大麻素或第二酸性大麻素。50.权利要求36至49任一项的修饰重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自酿酒酵母酵母(K.marxianus)、毕赤巴斯德酵母(Pichiapastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)和曲霉属(Aspergillus)的细胞。51.权利要求36的修饰重组宿主细胞，其中所述外源多核苷酸中的一个或多个可操作地连接醇脱氢酶-2启动子。52.一种生产大麻素产物的方法，该方法包括在其中表达由所述外源多核苷酸编码的5产物并产生所述酸性大麻素的条件下培养权利要求36-51任一项的修饰宿主细胞。53.权利要求52的方法，进一步包括加热所述酸性大麻素以形成中性大麻素。54.一种用于制备大麻素产物的方法，该方法包括：在酵母细胞中表达大麻素起始材料，其中所述酵母细胞进行遗传修饰以表达所述大麻素起始材料，在所述分离的酵母细胞中将所述大麻素起始材料转化成所述大麻素产物。55.权利要求54的方法，其中所述大麻素起始材料是大麻素前体或酸性大麻素。56.权利要求54或权利要求55的方法，其中所述转化步骤包括形成包含所述分离的酵母细胞和有机溶剂的反应混合物。57.权利要求54-56任一项的方法，其中所述大麻素起始材料是大麻素前体，和其中所述转化步骤包括将所述大麻素前体香叶基化以形成所述大麻素产物。58.权利要求57的方法，其中所述大麻素前体是2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸。59.权利要求57的方法，其中所述异戊烯化包括形成包含所述大麻素产物、香叶醇和有机溶剂的反应混合物并将所述反应混合物维持在足以产生所述大麻素产物的条件下。60.权利要求54的方法，其中所述大麻素起始材料是酸性大麻素，和其中所述转化步骤包括将所述酸性大麻素脱羧以形成中性大麻素产物。6用于大麻素家族的戊烯化聚酮的重组生产系统[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请要求2017年5月10日提交的美国临时申请No.62/504,456的权益，将所述临时申请按引用并入本文中用于所有目的。技术领域[0003]本发明总地涉及用于生物合成临床上重要的大麻素家族的戊烯化(prenylated)聚酮的生产方法、酶和重组宿主株，例如酵母菌株。利用容易获得的起始原料，使用异源酶来指导在真核微生物(例如酵母)中的大麻素生物合成。背景技术[0004]大麻(Cannabissativa)品种已经在世界范围内被广泛种植和利用以用于多种应记录了许多在人体内进行的受控临床研究以及传闻或开放标签研究，这些研究证明了植物提取物和纯化的大麻植物化合物在许多人类医学状况中均具有有益作用。人体研究中描述的大麻素家族化合物的有益活性的范围从神经系统到情绪/行为失调，再到胃肠道疾病以及睡眠、食欲和疲劳问题。其他用途或潜在用途包括治疗各种微生物和病毒感染以及治疗多种癌症。因此，作为这一人类治疗适应症迅速发展的范围的直接结果，目前对使用可持续的现代生物制药方法生产药用级大麻素类存在着尚未满足的需求。[0005]目前，主要通过在全世界的农业生产中种植大面积的大麻(cannabis或hemp)植物来分离大麻素，以及使用较低的(尽管在临床上重要的)水平的涉及合成化学过程的生产方法。前一种技术成本高昂，利用大量自然资源，如耕地和水，并且总是导致最终的药品含有污染所需活性药物物质的其他活性大麻素类。这可能导致所需纯化合物的活性的变化，从而在临床试验情况下和市售产品中导致虚假活性。此外，有毒金属和农药对天然植物来源的大麻素制品的污染是目前需要解决的问题。同样，由于许多大麻素的复杂立体化学，化学合成是困难、昂贵和低产的过程。此外，据报导，许多大麻素的合成化学生产产生的分子药理活性比从大麻植物提取的那些分子低。[0006]然而，合成生物学(由此使用工程化微生物中的隔离遗传途径来生物合成目标产物)为许多天然存在的化合物的大规模商业化生产问题提供了潜在的解决方案。[0007]大麻素分子及其类似物的第一化学构建块是天然源自III型聚酮合酶(PKS)的聚酮。对于在大麻中的PKS的详细描述，参见FloresSanchez,I.J.,2008,博士学位论文，LeidenUniversity以及Sanchez和Verpoorte,PhytochemRev(2[0008]聚酮通常以类似于脂肪酸合成的方式通过二碳单元的缩合来合成。通常，该合成的第一个酶促步骤是通过III型PKS酶形成二羟基戊基苯甲酸(olivetolicacid),所述酶7催化己酰基-CoA与三分子的丙二酰基-辅酶A的缩合以形成四酮，其随后通过单独基因编码的环化酶环化和芳香化。因此，从起始前体己酰基-CoA(一种中链脂肪酰基-CoA)形成主要的大麻素类，包括△9-四氢大麻酚酸和大麻二醇酸。其他的、具有变体侧链的不太普遍的大麻素由不同长度的脂族CoA形成(例如，△9-四氢次大麻酚酸从n-丁酰基-CoA起始单元形成)。在自然界中发现了几种另外的相关类似物，且其他类似物已化学合成。[0009]I型和许多III型迭代PKS是具有重复使用以获得最终聚酮产物的位点的酶，其中某些III型PKS,包括OA合酶，也需要环化酶的作用来催化完成最终步骤，即线性四酮前体的[0010]天然生物合成途径中朝向主要大麻素的接下来的步骤涉及二羟基戊基苯甲酸或二羟基戊基苯甲酸类似物(例如，2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸)的异戊烯化，其中10-碳香叶基-二磷酸通过异戊烯酶(prenylase)香叶基-二磷酸：二羟基戊基苯甲酸香叶基转移酶(GOT)缩合(Fellermeier和Zenk,1998)以产生大麻萜酚酸(CBGA);其通过大麻二醇酸合酶(Taura等，2007)、△9-四氢大麻酚酸合酶(Sirikantaramas等，2004)和大麻二烯酸合酶(Morimoto等，1998)分别进一步氧化环化成例如CBDA、△9-THCA和CBCA(Morimoto等，发明内容[0011]本文提供了为大麻素表达而工程化的修饰重组宿主细胞，酵母菌株。在一些实施方式中，宿主细胞进行遗传修饰以表达编码酰基-CoA合成酶的外源多核苷酸，所述酶将脂羟基戊基苯甲酸合酶的外源多核苷酸，(iii)和编码2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸环化酶(例如，二羟基戊基苯甲酸环化酶)的外源多核苷酸。还可以对这种宿主细胞进行遗传修饰以表达异戊烯基转移酶，其催化香叶基焦磷酸与二羟基戊基苯甲酸或二羟基戊基苯甲酸类似物(例如2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸)的偶联以形成大麻素化合物。[0012]本文还提供了重组宿主细胞，其被遗传修饰以表达编码戊烯醇和异戊烯醇激酶的外源多核苷酸；编码在外源性戊烯醇和异戊烯醇存在下生长时产生二甲基烯丙基焦磷酸和异戊烯基焦磷酸的激酶的外源多核苷酸；和编码香叶基焦磷酸合酶的外源多核苷酸。在一些实施方式中，另外对宿主细胞进行遗传修饰以表达编码异戊烯基转移酶的外源多核苷酸，所述酶催化香叶基焦磷酸与二羟基戊基苯甲酸或二羟基戊基苯甲酸类似物(例如2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸)的偶联以形成大麻素化合物。[0013]本文还提供了用于生产大麻素产物的方法。所述方法包括：在其中表达由外源多核苷酸编码的产物并且产生2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸(例如，二羟基戊基苯甲酸)的条件下，培养修饰的重组宿主细胞，所述细胞含有编码将脂族羧酸转化成酰基CoA硫酯的酰基-CoA合成酶的外源多核苷酸；编码从酰基-CoA和丙二酰CoA产生四酮的二羟基戊基苯甲酸合酶的外源多核苷酸；和编码2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸环化酶(例如，二羟基戊基苯甲酸环化酶)的外源多核苷酸；并将2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸转化成大麻素。所述转化可以在体外或体内通过化学或酶方式进行。8附图说明[0014]图1描绘了通过戊烯醇(二甲基烯丙基醇)和异戊烯醇(异戊烯基醇)的焦磷酸酯得到香叶基焦磷酸的生物合成途径。香叶基焦磷酸是用于聚酮二羟基戊基苯甲酸及其类似物的异戊烯化以形成大麻萜酚酸(CBGA)及其类似物的底物。[0015]图2A描绘了可通过多前体进料(MPF)策略(改编自FloresSanchez,I.J.,2008,博士学位论文，LeidenUniversity,Sanchez和Verpoorte,Phytoc获得的主要大麻素类的化学结构。[0016]图2B描绘了可使用MPF策略以及进一步的化学或生物化学转化反应(改编自FloresSanchez,I.J.,2008,博士学位论文，LeidenUnivePhytochemRev(2008)7:615-639)获得的其他大麻素类的化学结构。[0017]图3描绘了可通过CBGA获得的临床上重要的大麻素化合物的整体途径(改编自FloresSanchez,I.J.,2008,博士学位论文，LeidenUnivePhytochemRev(2008)7:615-6[0018]图4描绘了直接在经工程化以产生△⁹-四氢大麻酚酸(△⁹-THCA)和大麻二酚(CBD)的酵母细胞内更多重要的大麻素化合物(例如，大麻酚(CBN)和大麻二醇(CBDN))的化学转[0019]图5描绘了通过将脂族羧酸进料至表达酰基-CoA合成酶、大麻CsAAE3和来自链霉菌属(Streptomycessp.)SN-593的中链脂肪酰基-CoA连接酶revS的酵母(Saccharomyces)菌株在摇瓶培养物中生产聚酮大麻素前体。[0020]图6描绘了在进料各种酵母摇瓶培养物及己酸时3,5-二羟基戊苯和二羟基戊基苯膜结构域的CsAAE1(道2)、CsAAE3(道3)、revS(道4)、647个氨基酸的青枯雷尔氏菌端415个氨基酸(道6)的基因转化。[0021]图7描绘了摇瓶实验(泳道1-5)中pH对二羟基戊基苯甲酸相对于3,5-二羟基戊苯表达的影响，以及在3-升发酵(道6)中在pH6.5下通气增加对二羟基戊基苯甲酸表达的作具体实施方式[0023]本发明提供了以快速、经济和有效的方式生产目标大麻素化合物的方法和材料。因此，本发明满足各种商业和制药工业的需求。[0024]在一个方面中，本发明提供了使用商业酵母生物药物制造系统有效生产异戊烯化聚酮的新系统(Page,J.E.,和Nagel,J.(2006),Biosynthesishopandcannabis.InIntegrativePlantBiochemistry,J.T.Romeo编辑(0xford,UK:Elsevier),pp.179-210),所述异戊烯化聚酮包括大麻素家族以及大麻素前体分子及其类似物。在一些实施方式中，选择作为宿主的酵母菌株属于不天然产生这些分子的酿酒酵母(Saccharomyces维酵母(Kluyveromyceslactis)、马克思克鲁维酵母(K.marxianus)、毕赤巴斯德酵母9(Pichiapastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)和多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)。相似地，丝状真菌种，如某些曲霉属(Aspergillus)的种，也可以工程化以用于大麻素生产。[0025]本能发明可以使用来自I型PKS和II型PKS的编码序列，但在典型的实施方式中，所用的PKS是来自PKS的III型类别，例如，天然芳香族二羟基戊基苯甲酸合成酶/环化酶系统，或相关的III型苔色酸合成酶，或这些酶的修饰形式。编码I型PKS的多肽组分的基因已经用于在异源微生物(如酵母和大肠杆菌)中相似聚酮的微生物生产。参见，例如，美国专利No.6,033,883、6,258,566、7,078,233和9,637,763,以及Kealey等，ProcNatlAcaUSA(1998)95,505。[0026]在一些实施方式中，本发明使用一种称为多前体进料(MPF)技术的方法，其中适当修饰的宿主细胞可以接受并磷酸化进料的香叶醇和/或5-碳香叶基-二磷酸前体，以及内源产生的或外源进料的二羟基戊基苯甲酸或二羟基戊基苯甲酸类似物(例如，2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸)以获得产量比在相同宿主细胞中从头合成全部这些前体所产生的更高的大麻素生物合成产率。在一些实施方式中，香叶基-二磷酸可以从两个5-碳前体(二甲基烯丙基醇(戊烯醇)和异戊烯基醇(异戊烯醇))产生，这两个5-碳前体本身进料并通过工程化至大麻素生产菌株中的合适异源激酶磷酸化至二磷酸水平。[0028]除非另外限定，本文使用的所有技术术语、符号和其他科学术语旨在具有本申请所属领域的普通技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为了清楚和/或易于参考，在此定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括这样的定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性区别。含有聚酮部分(例如为二羟基戊基苯甲酸或另一种2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸)和萜烯衍生的部分(例如，香叶基基团)的分子。香叶基基团源自香叶醇的二磷酸酯，称为香叶基二磷酸或香叶基焦磷酸(图1),其形成酸性大麻素大麻萜酚酸(CBGA)。CBGA可以通过酶促(例如通过体内或体外酶处理的脱羧作用以形成中性大麻素大麻酚)和化学方式(例如通过加热)转化成其他生物活性大麻素类；还参见图1、2A和2B。二羟基戊基苯甲酸香叶醇[0031]术语大麻素包括酸性大麻素和中性大麻素。术语“酸性大麻素”是指具有羧酸部分的大麻素。羧酸部分可能以质子化形式(即，作为-COOH)或以去质子化形式(即，作为碳酸酯-CO0-)存在。酸性大麻素的实例包括，但不限于，大麻萜酚酸、大麻二酚酸和△⁹-四氢大麻酚酸。术语“中性大麻素”是指不包含羧酸部分(即，实际含-COOH或-CO0-部分)的大麻素。中性大麻素的实例包括，但不限于，大麻萜酚、大麻二酚和△9-四氢大麻酚。[0032]术语“2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸”是指具有以下结构的化合物：CN110869496A说明书5/23页基戊基苯甲酸(即，2-戊基-4,6-二羟基苯甲酸；CAS登记号No.491-72-5)和二酚酸5-壬基间苯二酚。烷基包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔-丁基、戊基、异戊基、己基等。烷基还可以指具有多达20个碳原子的烷基基团，如，但不限于，庚基、辛基、壬基、癸基等。剂的实例包括，但不限于，甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃、苯、氯仿、二乙醚、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和石油醚。酸、对甲苯磺酸等)。[0039]在整个说明书和权利要求书中，词语“包括(comprise)”或诸如“包含氨基酸残基的两个或多个序列或子序列(例如，至少70%,至少75%,至少80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或更高)。用于确定氨基酸序列同一性(DNASTAR)软件之类的可公开获得计算机软件的那些。适用于确定序列同一性和序列相似[0041]如本文所用，“保守”置换是指使得维持侧基链的电荷、疏水性和/或大小的氨基酸负电荷的氨基酸Glu和Asp;(iii)芳香族氨基酸Phe、Tyr和Trp;(iv)氮环(v)大型脂族非极性氨基酸Val、Leu和Ile;(vi)弱极性氨基酸Met和Cys;(vii)小侧链氨基11(ix)小羟基氨基酸Ser和Thr。在本段中，提及氨基酸的电荷是指在生理pH下的电荷。是指二羟基戊基苯甲酸。“CBG”是指大麻萜酚；“CBDA”是指大麻二酚酸；“CBD”是指大麻二四氢大麻酚酸(△⁹-THCA);“△⁸-THCA”是指△⁸-四氢大麻酚酸；“CBCA”是指大麻色烯酸；“CBV”是指次大麻酚(cannabivarin);“CBVA”是指次大麻酚酸；"THC酚(△⁹-THCV);“△⁸-THCV”是指“△⁸-四氢次大麻酚”;“THCVA”是指△⁹-四氢次大麻酚酸(△⁹-THCV);“△⁸-THCVA”是指△⁸-四氢次大麻酚酸；“CBGV”是指次大麻萜酚(cannabigerovarin);“C指次大麻色烯(cannabichromevarin);“CBCVA”是指次大麻色烯酸(cannabichromevaric括复数指代物，除非文中清楚表示其他。[0044]本文描述或参考的分子生物学技术和程序是本领域技术人员通常充分了解的并LaboratoryManual,第2版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.中所述的分子克隆方法。适当情况下，通常根据制造商限定的实验方案和/或参数来进行涉及商业可获得的试剂盒和试剂的过程。在描述本发明的方法、表达系统及其试剂，当然这些可以改变。还将理解本文使用的术语仅用于描述特定的实施方案的目的，并且不是打算来限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限定。[0045]III.大麻素表达系统有充分研究的在各种人类医学病症中具有更高效力和选择性活性的大麻素。它们包括，不大麻酚(OTHC)、大麻环醚萜酚(cannabiglendol)和△⁷-异四氢大麻酚，它们的结构显示于[0047]本发明还涉及大麻素化合物中间体的合成。在一些实施方案中，大麻素中间体化合物是本文所述的代谢途径中的步骤之一中产生的化合物(例如，图1和图2A)。术语“代谢途径”是指系列的两个或更多个酶促反应，其中一个酶促反应的产物变成下一个酶促反应的底物。在代谢途径的每个步骤中，形成中间体化合物并且用作随后步骤的底物。在一些实施方案中，代谢途径的每个步骤在本文所述的修饰的重组细胞中进行。在其他实施方案中，基酸残基的结构域：[LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-列中的给定位置处可接受任何残基。对于给定位置可接受的氨基酸放置在方括号之间(例且有助于鉴定拟南芥(Arabidopsis)(Shockey等，2003)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、毛果杨(Populustrichocharpa)和小立菀藓(Physcomitrellapatens)Black等(BiochimBiophysActa.1771(3):286-98,2007);Miyazawa等(J.Biol.Chem290些实施方案中，多核苷酸编码与SEQIDNO:1中列出的序列具有约60%或更高同一性(例如，约60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性)的多肽。在一些实施方案中，多核苷酸编码与SEQIDNO:1中列出的序列具有约70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高同一性的RevS多肽。在一些实施方案中，非天然产生的变体与SEQNO:2列出的序列具有至少约60%或更高同一性的氨基酸序列(例如，约60%、61%、62%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性)。在一些实施方案中，酰基-CoA合成酶多核苷酸编码包含与SEQIDNO:2中列出的序列具有约70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高同一性的氨基酸序列的CsAAE3,或其同系物或非天然产生的变体。在一些实施NO:3列出的序列具有至少约60%或更高同一性的氨基酸序列(例如，约60%、61%、62%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性)。在一些实施方案中，酰基-CoA合成酶多核苷酸编码包含与SEQIDNO:3中列出的序列具有约70%、75%、80%、85%、90%、酸编码从其删除了跨膜结构域的多肽。在一些实施方案中，非天然产生的变体与SEQID接作用于酰基-CoA底物(与I型PKS和II型PKS的情况中酰基携带蛋白结合的底物相反)的同[0059]在一些实施方案中，二羟基戊基苯甲酸合中列出的序列具有约60%或更高同一性(例如，约60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、97%、98%、99%或100%同一性)的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，二羟基戊基苯甲酸合酶多核苷酸编码包含与SEQIDNO:4中列出的序列具有约70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高同一性的氨基酸序列的III型PKS。[0061]可以将根据本发明的宿主细胞进一步修饰来表达编码2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸烷基-4,6-二羟基苯甲酸环化酶是来自大麻的二羟基戊基苯甲酸合酶(EC编号4.4.1.26)。(S.coelicolor)ActVA-Orf6(Q53908)、瑞士假单胞菌(P.reinekei)MLMI(C5MR76)、黑胡桃链霉菌(S.nogalater)SnoB(P54259)、结核分支杆菌(M.tuberculosis)Rv0793(086332)或IDN0:5、6或7中列出的序列具有约60%或更高同一性(例如，约60%、61%、62%、63%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性)的多肽。在一些实施方案中，该多肽与SEQIDNO:5、6或7中列出的序列具有约70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高同一性。2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸环化酶(例如，二羟基戊基苯甲酸环化酶)的修饰重组宿主细胞可以进一步修饰来表达编码异戊烯基转移酶的外源多核苷酸，所述酶催化香叶基-焦磷酸283-285;1998)中所述的香叶基焦磷酸：二羟基戊基苯甲酸香叶基转移酶(GOT;EC8117-8126;2008)所述的。在一些实施方案中，异戊烯基转移酶是来自肉桂链霉菌遗传修饰来表达异戊烯基转移酶的宿主细胞可以是如以下部分中[0066]再在其他实施方案中，本发明提供了在分批过程或补料-分批过程中将工程化宿源多核苷酸；和(iv)编码催化香叶基-焦磷酸与二羟基戊基苯甲酸或二羟基戊基苯甲酸类似物(例如，2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸)偶联以形成大麻素化合物的异戊烯基转移酶的第[0068]5-碳戊烯醇类(戊烯醇和异戊烯醇)可以通过几种酶转化到单磷酸水平并且之前通过另外表达的酶转化到二磷酸水平，随后其偶联以通过GPP合酶获得10-碳香叶基-二磷基因从其获得的几种生物体中，包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、豆科根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)、贺氏火球菌(Pyrococcushorikoshii)、酿酒酵母(S.cerevisiae)和玉米种。[0069]通过使用异戊烯基二磷酸合酶或异戊烯基磷酸激酶获得进一步磷酸化至二磷酸水平，参见美国专利No.6,235,514。在一些实施方案中，通过使用嗜酸嗜热单胞菌(Thermoplasmaacidophilum)、甲烷嗜热自养菌(Methanothermobacterthermautotrophicus)、詹氏甲烷菌(Methano-caldococcusjannaschii)、Menthaxpiperita或芒果(Mangiferaindica)氨基酸序列，或具有激酶活性的其他同源序列来衍生编码这种酶或更多活性变体的化学合成基因。[0070]还可以通过将香叶醇磷酸化至单磷酸水平的激酶，接着通过产生香叶基-二磷酸的第二激酶来产生10-碳香叶基-二磷酸。在一些实施方案中，通过法呢醇激酶(FOLK)来进行第一激酶事件(Fitzpatrick,Bhandari和Crowell,2011;PlantJ.2011年6月；66(6):1078-88)。这种激酶源自对5-碳戊烯醇磷酸化的生物体的已知氨基酸序列或突变体，所述生物体包括植物(拟南芥、亚麻荠(Camelinasativa)、Capsellarubella、Noccaeacaerulescens等)和真菌(白色念珠菌(Candidaalbicans)、Talaromycesatroroseus等)。[0071]通过使用突变的异戊烯基单磷酸激酶(IPK)实现香叶基-磷酸进一步磷酸化至香叶基-二磷酸水平。据报道IPK中的突变(Val73、Val130、Ile140)产生增强的香叶基-磷酸激酶活性(Mabanglo等，2012)。这种激酶源自细菌或古细菌种的已知氨基酸序列或突变体，包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)和嗜酸嗜热单胞菌(Thermoplasmaacido[0072]在一些实施方案中，用于异戊烯酶香叶基二磷酸：二羟基戊基苯甲酸香叶基转移酶的DNA构建体编码野生型或具有酵母优选密码子的突变体酶。在其他实施方案中，使用编码具有宽松底物特异性的细菌(例如，链霉菌)异戊烯基转移酶的DNA构建体(Kumano等，[0073]在一些实施方案中，宿主细胞包含一个或多个选自以下三个外源多核苷酸的另外的外源多核苷酸：编码戊烯醇和异戊烯醇激酶的外源多核苷酸；编码在外源戊烯醇和异戊烯醇存在下生长时产生二甲基烯丙基焦磷酸和异戊烯基焦磷酸的激酶的外源多核苷酸；和编码香叶基-焦磷酸合酶的外源多核苷酸。[0074]与之前描述的用于在酵母中基于重组DNA产生大麻素的方法相反，本发明的一些实施方案基于戊烯醇和异戊烯醇的高水溶性以及产生高水平表达异源激酶的重组宿主细胞的能力，所述激酶可以将这些5-碳化合物磷酸化至二磷酸水平，并由于带电的二磷酸部戊烯醇异戊烯醇[0076]在一些实施方案中，根据图1中所示的示意图，随后通过内源性或异源表达的香叶基-焦磷酸合酶(GPP合酶)的作用将所得的二磷酸缩合以形成香叶基-二磷酸(或焦磷酸盐)。这随后可用于通过野生型或优选更高活性的突变体芳族异戊烯基转移酶的作用与2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸缩合以形成大麻萜酚酸或大麻萜酚酸类似物。[0077]在其他实施方案中，香叶醇自身通过异源表达的激酶的作用转化以形成香叶基-焦磷酸，其随后通过野生型异戊烯基转移酶或突变异戊烯基转移酶的作用与二羟基戊基苯甲酸或二羟基戊基苯甲酸类似物(例如，2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸)偶联以形成大麻萜酚酸或大麻萜酚酸类似物。[0078]在一些实施方案中，宿主细胞进一步修饰来表达CBDA合酶(EC1.21.3.8)、THCA合[0079]工程化宿主细胞[0080]可以使用任何方法将多核苷酸引入宿主细胞中。在一些实施方案中，编码两种或2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸环化酶(例如，二羟基戊基苯甲酸环化酶)中的两种)的外源多核苷酸存在于同一表达构建体中，例如，自主复制表达载体，并表达为多顺反子RNA,其中表达通过同一启动子驱动。因此，例如，在一些实施方案中，编码二羟基戊基苯甲酸合酶的外源多核苷酸和编码2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸环化酶(例如，二羟基戊基苯甲酸环化酶)的外源多核苷酸包含在同一表达构建体中，例如，自主复制表达载体，并且通过内部核糖体进入位点(IRES)分隔，使得表达通过同一启动子来驱动以产生二顺反子mRNA。在一些实施方案中，启动子是醇脱氢酶-2启动子。在一些实施方案中，外源多核苷酸存在于同一表达构建体核苷酸存在于两个或更多个表达构建体中，例如，自主辅助表达载体。在一些实施方案中，自主复制表达载体是酵母人造染色体。在一些实施方案中，外源多核苷酸中的一个或多个整合至宿主基因组中。在一些实施方案中，通过逆转座子整合将多个外源多核苷酸引入宿主细胞中。[0081]在一些实施方案中，使用在宿主内表达的二羟基戊基苯甲酸或二羟基戊基苯甲酸类似物产生大麻素化合物，例如，如之前段落中所述的，并且宿主细胞进一步修饰来表达异戊烯基转移酶、戊烯醇和异戊烯醇激酶；在外源戊烯醇和异戊烯醇存在下生长时产生二甲基烯丙基焦磷酸和异戊烯基焦磷酸的激酶；或如本文所述的编码香叶基-焦磷酸合酶的多核苷酸。这样的多核苷酸可以包含在相同或单独的表达载体中，如之前段落中所述的。[0082]在一些实施方案中，修饰的重组宿主细胞进一步包含编码大麻素合酶的外源多核苷酸，所述酶催化宿主细胞中产生的第一大麻素化合物中间体的转化以形成第二大麻素化[0083]宿主细胞[0084]在一些实施方案中，宿主细胞是酵母或丝状真菌宿主细胞，如曲霉属宿主细胞。可以用作宿主细胞的酵母属包括，但不限于，酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)和发夫酵母属酵母(Hansenulapolymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、加拿大毕赤酵母(P.canadensis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。可以用作宿主细胞的丝状真菌属包括，但不限于，枝顶胞属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、Chrysoporium、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、棒囊壳菌属孢属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、毛霉菌属(Mucor)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、镰孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、毛平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、Scytaldium、裂褶菌属(Schizophyllum)、侧孢霉属(Sporotrichum)、篮状菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes禾赤镰孢菌(Fusariumgraminum)、Fusarisarcochroum)、分枝镰孢菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusarium绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete(Trichodermareesei)和绿色木霉(Trichodermaviride)。[0087]用于驱动基因在酿酒酵母和其他酵母中的转录的启动子是本领域公知的并且包[0088]在一些实施方案中，外源多核苷酸中的一个或多个可操作地连接葡萄糖调节的启动子。在一些实施方案中，通过醇脱氢酶-2启动子驱动外源多核苷酸中的一个或多个的表[0089]其他启动子以组成型方式强烈驱动转录。这样的启动子包括，不限于，用于高度表达的酵母糖酵解酶的控制元件，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK)、丙糖磷酸异构酶(TPI)和醇脱氢酶-1(ADH1)。可以使用的另一种强组成型启动子是来自酿酒酵母转录延伸因子EF-1α基因(TEF1)的启动子(Partow等，Yeast.2010,[0090]在其他实施方案中，宿主细胞可以通过增加前体池等来提高大麻素产量。可以将异源的天然或化学合成的用于酶(如丙二酰-CoA合酶、乙酰-CoA羧化酶、乙酰-CoA合酶-1和-2)的基因、来自酵母或其他真核物种的甲羟戊酸途酶、甲羟戊酸激酶、突变法呢基-焦磷酸合酶)(EGR20;Zhao等，2016)引入高水平表达质粒载体上或使用本领域技术人员公知的方法通过基因组整合引入。这样的方法可包括CRISPRCas-9技术、酵母人工染色体(YAC)或使用逆转座子。或者，如果对于宿主生物体是天然的，这些基因可以通过本领域技术人员已知的遗传元件整合方法来上调。[0091]在再其他方面中，可以使用相似的工程化来降低利用碳源的天然产物(例如，乙醇)的产生，其导致用于大麻素生产的碳源利用降低。这样的基因可以通过删除从基因组中[0092]更多的实施方案包括针对辅助最终产物大麻素产生的辅助酶的基因。一种这样的酶，过氧化氢酶，能够中和参与CBGA和类似物的氧化环化的某些酶(如，大麻二醇酸合酶(Taura等，2007)、△⁹-四氢大麻酚酸合酶(Sikikantaramas等，2004)和大麻二烯酸合酶[0093]在更多的实施方案中，工程化的宿主细胞含有上调或下调的内源或异源基因以优化，例如，用于大麻素生物合成的前体池。可以表达另外的更多异源基因产物以在细胞内产生“辅助”功能。例如，可以表达超表达的过氧化氢酶以将氧化-领域公知的技术，通过整合至酵母基因组中来提供，或可以从质粒(也称为酵母表达载体)、酵母人工染色体(yACht)或酵母转座子表达。[0094]在一些实施方案中，将用含有以上每种基因的质粒或载体转化或遗传整合的宿主细胞(例如，酵母菌株)与另一表达系统一起转化用于将CBGA或CBGA类似物转化成第二酸性大麻素，如以下进一步解释的。在一些这样的实施方案中，表达系统在同一载体或单独的载体上，或整合至宿主细胞基因组中。[0095]本发明的产生大麻素的工程化细胞可以使用编码工程化代谢途径中涉及的酶的至少一个核苷酸序列，通过基因组整合或使用游离体质粒(也称为表达载体，或简称为载一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的以反映宿主细胞的典型密码子使用而不改变改变核酸序列的密码子内容而不改变核酸编码的多肽序列以增强在特定宿主细胞中的表达。在某些实施方案中，该术语表示包括改变核酸序列的密码子内容作为控制多肽表达水平(例如，提高或降低表达水平)的手段。因此，描述了编码参与工程化代谢途径的酶的核酸序列。在一些实施方案中，代谢工程化细胞可以表达一个或多个具有进行以下所述步骤所需的酶活性的多肽。在一些实施方案中，根据美国专利No.7,561,972中所述的，核苷酸序列被合成并针对在酵母中表达进行密码子优化。每一个编码产生本文所述的大麻素化合物或大麻素化合物中间体所需的多肽。或者，单个核酸分子可以编码一个或超过一个多肽。例如，单个核酸分子可以含有编码两个、三个、四个或甚至五个不同的多肽的核酸序列。本文所述的可用于本发明的核酸序列可以获自各种序列随后可以使用标准分子生物学和/或重组DNA技术来修饰以产生具有所需修饰的核酸用限制性酶的序列部分的交换(任选与连接结合)、同源重组、位点特异性重组或其各种组合。在其他实施方案中，核酸序列可以是合成的核酸序列。可以使用美国专利No.7,323,320以及美国专利申请公开No.2006/0160138和2007/0269870中所述的各种方法来产生合成的多核苷酸序列。酵母细胞的转化方法是本领域公知的。[0097]IV.用于大麻素表达的方法[0099]根据本文提供的方法的大麻素生产通常包括培养经工程化以包含上述表达系统的宿主细胞(例如，酵母或丝状真菌)。在一些实施方案中，用于酵母生长的碳源是糖，如葡的碳源可以是甲醇、丙三醇、乙醇或醋酸盐(酯)。在一些实施方案中，通过实验来精炼原料组合物以提供最佳的酵母生长和最终大麻素生产水平，如使用如HPLC的分析技术测量的。在这样的实施方案中，方法包括利用葡萄糖/乙醇或葡萄糖/醋酸盐混合物，其中葡萄糖与2-碳源(乙醇或醋酸盐)的摩尔比在50/50、60/40、80/20或90/10的范围之间。进料经优化以诱导葡萄糖调节启动子并使生产菌株中的乙酰-CoA和丙二酰-CoA前体的产生最大化。[0100]在本发明的其他方面中，二羟基戊基苯甲酸或其类似物可以通过化学合成获得，或可以在重组生产系统中生物合成。在一些实施方案中，二羟基戊基苯甲酸在与包含用于大麻素生产的代谢途径的相同酵母细胞株中高水平地产生。用于酵母中的单环聚酮芳族化合物的高水平产生系统是本领域已知的，参见美国专利No.9,637,763。在其他实施方案中，来自产生高水平二羟基戊基苯甲酸或其类似物的酵母株的培养基可以被浓缩并且用作用于大麻素生产的MPF程序中的高相容性原料。[0101]由于碳利用途径或表达控制模式的差异，发酵方法可以适应于特定的酵母菌株。例如，酵母属酵母发酵可能需要单一葡萄糖进料、复合氮源(例如，酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。这与甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母不同，其对于最佳生长和表达可能需要甘油、甲醇和微量矿物质进料，但只需要简单的铵(氮)盐。参见，例如，Elliott等，Biotechnol.Bioeng.(1987)29:11131121。培养基可以含有如酵母提取物、蛋白胨等的组[0102]在一些实施方案中，控制葡萄糖添加至发酵器中的速率，使得葡萄糖添加的速率大致等于酵母消耗葡萄糖的速率；在这样的条件下，葡萄糖或乙醇的量不会明显累积。在这样的情况中，葡萄糖添加的速率可以取决于包括，但不限于，特定的酵母菌株、发酵温度和发酵设备的物理尺寸的因素。[0103]对于MPF程序，在分批模式中，前体二羟基戊基苯甲酸(或二羟基戊基苯甲酸类似物，如另一种2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸)、戊烯醇、异戊烯醇或香叶醇可以以0.1至50g/ml的浓度存在(例如，1至10g/L)。在补料-分批模式中，前体可以在2至20个小时中缓慢进料到发酵中，使得每种必需的前体存在1至100g/L(例如，1至10g/L,或10至100g/L)的最终添加。如，1至10g/L)。在补料-分批模式中，羧酸可以在2至20个小时中缓慢加入发酵中，使得羧酸存在1至100g/L(例如，1至10g/L,或10至100g/L)的最终添加。[0105]可以控制培养条件，如表达时间、温度和pH,使得以高产量获得目标大麻素中间体材料(如己酸、戊烯醇、异戊烯醇等)存在下，根据所用的特定宿主细胞在约20℃至约40℃的温度范围中培养几小时至一天或更长的时间(例如，24小时、30小时、36小时或48小时)。例如，酿酒酵母可以在25-32℃下培养24-40小时(例如，30小时)。培养基的pH可以通过添加酸、碱和/或缓冲剂维持在特定水平。在某些实施方案中，在6或更高pH下培养酵母可以降低不合需要的副产物如3,5-二羟基戊苯的产生。在一些实施方案中，酵母培养的pH范围为约6至约8。在一些实施方案中，酵母培养的pH为约6.5。在一些实施方案中，酵母培养的p[0106]在一些实施方案中，重组酵母细胞进行遗传修饰，使得其在如上所述的含合适前体的培养基中体内培养时以至少约0.1g/L,至少约0.5g/L,至少约0.75g/L,至少约1g/L,至少约1.5g/L,至少约2g/L,至少约2.5g/L,至少约3g/L,至少约3.5g/L,至少约4g/L,至少约4.5g/L,至少约5g/L,至少约5.5g/L,至少约6g/L,至少约7g/L,至少约8g/L,至少约9g/L或至少约10g/L的水平产生目标大麻素产物或中间体。在一些实施方案中，重组酵母细胞进行遗传修饰以使得其在合适的培养基中体内培养时以至少约20g/L,至少约30g/L,至少约50g/L或至少约80g/L的水平产生目标大麻素产物或中间体。[0107]可以在允许细胞生长和/或孵育的任何容器中进行大麻素生产。例如，反应混合物养烧瓶、发酵器或用于细胞生长或孵育的其他容器。可以使用本领域已知的方法从发酵培养基或细胞提取物分离生物产生的目标产物。例如，可以通过离心或过滤除去固体或细胞[0108]2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸转化成大麻素产物[0109]本文还提供了用于生产大麻素产物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在酵母细胞中表达大麻素起始材料，其中酵母细胞进行遗传修饰来表达大麻素起始材料，分离酵母细胞并在分离的酵母细胞中将大麻素起始材料转化成大麻素产物。大麻素起始材料可以是酸性大麻素、中性大麻素或大麻素前体，如二羟基戊基苯甲酸或另一种2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸。可以使用本文所述的程序(例如，化学或酶促香叶基化、热或促酶脱羧化等)来进行大麻素起始材料转化或可以根据特定大麻素起始材料或特定大麻素产物的性质来进行改变。例如，可以使用上述的任一种表达系统来表达大麻素起始材料。分离酵母细胞可以任选地包括：通过离心、过滤或其他方式从培养基收集酵母细胞；洗涤酵母细胞来除去培养基或其他组分；从细胞除去至少一部分液体(例如，培养基);和/或干燥细胞(例如，通过冷冻干燥或其他方式)。分离的酵母细胞可以直接经受用于形成大麻素产物的反应条件。例如，可以将酵母细胞与溶剂和其他试剂直接组合，[0110]在一些实施方案中，所述方法包括在其中产生2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸的条件下培养包含如上所述的表达系统的修饰重组宿主细胞，并将2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸转化成大麻素产物。在一些实施方案中，所述方法包括在其中产生二羟基戊基苯甲酸的条件下培养包含如上所述的表达系统的修饰重组宿主细胞，并将二羟基戊基苯甲酸转化成大麻[0111]在一些实施方案中，转化步骤在体外进行。例如，转化步骤可以包括在足以产生酸性大麻素(例如，大麻萜酚酸，CBGA)的条件下形成包含2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸(例如，二羟基戊基苯甲酸)、香叶醇和有机溶剂的反应混合物。该方法可以用于将二羟基戊基苯甲酸类似物转化成相应的酸性大麻素。[0112]任何合适的有机溶剂可以用于本发明的方法中。合适的溶剂包括，但不限于，甲苯。还可以使用含水有机溶剂混合物(即，水和水混溶性有机溶剂如四氢呋喃或二甲基甲酰胺的混合物)。通常，溶剂与2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸的比率范围以重量计为约1:1至约1000:1。溶剂与2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸的比率以重量计可以为例如约100:1,或约10:1,或约5:1。在某些实施方案中，2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸存在于酵母混合物中(例如，干燥的酵母细胞，或从培养物收集的湿酵母细胞沉淀物)。在一些这样的实施方案中，反应混合物包含宿主细胞(例如，干燥的酵母细胞)。溶剂与酵母混合物(例如，干燥的酵母细胞)的比率范围可以为约1:1至约1000:1,以重量计。溶剂与酵母混合物的比率可以为例如约100:1,或约10:1,或约5:1,或约2:1,以重量计。[0113]任何合适量的香叶醇可以用于转化步骤中。通常，相对于2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸，反应混合物含有至少一摩尔分子当量的香叶醇。相对于2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸，反应混合物可以含有例如约1摩尔当量至约10摩尔当量的香叶醇(例如，约1.1摩尔当量，或约酯、甲磺酸香叶基酯等)也可以用于转化步骤中。[0114]在一些实施方案中，反应混合物进一步包含酸。任何合适的酸可以用于转化步骤任何合适量的酸可以用于转化步骤中。通常，相对于2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸，反应混合物含有约0.01摩尔当量的酸(例如，对甲苯磺酸)至约10摩尔当量的酸。例如，相对于2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸，反应混合物可以含有约1摩尔当量至约10摩尔当量的香叶醇(例如，约0.01摩尔当量，或约0.1摩尔当量)。[0115]转化步骤可以在任何合适的温度下进行。通常，转化步骤在约20℃至约200℃的温度范围下进行，例如，约25℃至约100℃,或约25℃至约80℃,或约25℃至约70℃。转化步骤进行足以将2-烷基-4,6-二羟基苯甲酸转化成大麻素产物(例如，将二羟基戊基苯甲酸转化态(例如，存在于酵母混合物中)的因素，转化时间范围为几分钟到几小时。在一些实施方案中，反应混合物在约25℃至约100℃范围的温度(例如，约60℃)下维持约5分钟至约360分钟范围的时间。在一些实施方案中，反应混合物在60℃或约60℃下维持60分钟或更短时间(例方法进一步包括将酸性大麻素(例如，CBGA)转化成大麻素产物。最终的大麻素产物可以是中性大麻素或另一酸性大麻素。在一些实施方案中，通过物理或化学过程，如加热、自氧化或UV光处理来进行中间体化合物(如CBGA)转化成另一种大麻素的转化。例如，所述方法可以包括酸性大麻素的脱羧(在工程化酵母细胞内或在其完全或部分纯化后通过热的作用或通过在体内或体外接触大麻酸的野生型或突变脱羧酶的作用)。酸性大麻素的脱羧提供了[0117]在一些实施方案中，使用UV光处理、加热、氧化或其他反应条件以使得第一中间体重组DNA来源的大麻素产物保留在酵母细胞内并且随后转化成以商业规模分离和纯化的第二有价值的大麻素产物。[0118]可以对形成的大麻素进行其他化学转化以制备完全非天然的类似物，如酯、醚和卤化的衍生物，用作前药或者更有活性的或生物可利用的药物物质。在一些实施方案中，可以对带有生物合成的大麻素底物的整个酵母细胞进行这种化学作用以避免在形成所需的终产物前的非必要纯化步骤。[0119]还在其他实施方案中，描述了在相同的工程化宿主细胞内或通过与两种或更多种重组宿主细胞株(例如，酵母菌株)共培养，通过野生型或突变大麻素或大麻酸合酶的作用将第一中间体大麻素转化成第二大麻素的方法。[0120]如以上解释的，在一些实施方案中，用含有以上每种基因的质粒或载体转化或基因组整合的宿主细胞(例如，酵母菌株)用用于将CBGA或CBGA类似物转化成第二酸性大麻素的另一表达系统一起转化。在一些这样的实施方案中，表达系统在同一载体上或在单独的载体上，或整合至宿主细胞基因组中。在其他实施方案中，用于转化活性的表达系统编码大麻酶THCA合酶、CBDA合酶或CBCA合酶中的一种。在一些实施方案中，合酶是来自啤酒花大麻素保持在升高的温度(例如，约40℃、50℃或100℃)下几分钟到几小时的时间将酸性大麻素脱羧。[0122]本文说明性描述的本发明可以在不存在本文没有具体描述的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下合适地实施。因此，例如，在本文中的每种情况中，术语“包主细胞。已经使用的术语和表述用作描述而非限制的术语，并且在使用这些术语和表述时，无意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是应认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解尽管已经通过优选实施方案和任何特征具体地公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和变化，并且认为这样的修改和变化在由所附权利要求限定的本发明的范围内。[0123]前述书面描述认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。提供以下实施例仅用于说明性目的，而无意以任何方式限制本发明的范围。实际上，除了本文中示出和描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。[0124]在已经参考专利说明书、其他外部文件或其他信息源的本说明书中，这通常是出于提供讨论本发明的特征的背景的目的。除非另有特别说明，否则对此类外部文件的引用不应解释为承认此类文件或此类信息源在任何管辖范围内都是现有技术，或构成本领域公知常识的部分。本说明书中引用的所有专利、专利申请和文献参考文献均按引用全文并入[0126]提供以下实施例来说明但不是限制所要求保护的本发明。[0128]酿酒酵母ADH2启动子化学合成并且与用于来自天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)的突变细菌NphB基因的合成基因融合。基因连接用于酿酒酵母ERG20的合成基因，其具有用于酿酒酵母p150内部核糖体进入位点(IRES)序列的合成序列。酿酒酵母终止子序列也与基因序列融合，紧接在ERG20基因的终止密码子后。表达盒克隆至含有URA3选择标记的酵母表达载体中。相似地，编码酿酒酵母羟乙基噻唑激酶和嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)异戊烯基磷酸激酶突变体(V73I+Y141V+K203G)基因的基因(也与酿酒酵母p150内部核糖体进入位点(IRES)连接)克隆至含有用于在色氨酸缺乏培养基中生长的选择标记的酵母表达载体中。酿酒酵母终止子序列也与这个双顺反子序列融合，紧接在嗜酸热原体异戊烯基磷酸激酶突变基因的终止密码子后。[0129]用表达载体顺序转化感受态酿酒酵母InvSc1(MATahis3D1leu2trp1-289ura3-52)(Invitrogen)细胞，并随后接种于最低琼脂板(1.7g/L不含氨基酸或硫酸铵的酵嘧啶和色氨酸原养型的选择。挑选转化体并在尿嘧啶-和色氨酸-缺乏最低培养基中生长24小时。从转化体分离质粒DNA并通过限制性消化分析来进行分析以确认身份。[0130]将成功的转化体用于接种2mL尿嘧啶缺乏的最低培养基并在轨道摇床中在30℃下生长过夜。将500μL等份的这种培养物用于接种50mLYEPD培养基(Wobbe,CurrentProtocolsinMolecularBiology,增刊34:13.0.1-13.13.9(Wiley,1996))(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖),并将培养物在二羟基戊基苯甲酸(10g/L)、戊烯醇(10g/L)和异戊烯醇(10g/L)的存在下在摇床中在30℃下生长。[0132]通过与薄层色谱(TLC)板上的已知标准品比较，以及通过HPLC来鉴定从酵母上清[0134]将以上实施例1中所述的质粒顺序转化至酵母菌株[0135]将转化的酵母细胞在包含具有2%葡萄糖的YEPD培养基的摇瓶中生长48和72小[0136]通过在薄层色谱(TLC)板上与已知标准品比较以及通过HPLC来鉴定从酵母上清液