2025年检验科PCR室培训试题附答案

2025年检验科PCR室培训试题附答案一、单项选择题（每题2分，共30分）1.实时荧光定量PCR中，荧光信号开始显著超过基线的循环数称为：A.平台期B.阈值线C.Ct值D.扩增效率答案：C2.以下哪种物质对TaqDNA聚合酶抑制作用最强？A.血红蛋白B.尿素C.肝素D.免疫球蛋白答案：C3.核酸提取过程中，若使用磁珠法，洗涤步骤的关键目的是：A.增加磁珠与核酸的结合力B.去除蛋白质、盐离子等杂质C.裂解细胞释放核酸D.调节反应体系pH值答案：B4.进行RNA检测时，实验室必须配备的设备是：A.高压蒸汽灭菌器B.超低温冰箱（-80℃）C.核酸蛋白测定仪D.小型高速离心机（13000rpm以上）答案：B5.关于PCR实验室分区，以下说法错误的是：A.试剂准备区可设置普通冰箱保存引物B.标本处理区应配备生物安全柜C.扩增区与产物分析区可合并为一个区域D.各区域需单向流动，避免交叉答案：C6.检测新型冠状病毒核酸时，若选择ORF1ab和N基因双靶标，主要目的是：A.提高检测灵敏度B.降低假阳性概率C.区分不同变异株D.减少扩增时间答案：B7.引物设计时，若Tm值差异超过5℃，最可能导致的结果是：A.非特异性扩增B.扩增效率降低C.产物量不足D.荧光信号弱答案：A8.以下哪种情况会导致扩增曲线出现“拖尾”现象？A.引物浓度过高B.dNTP浓度过低C.Mg²+浓度不足D.模板量过少答案：A9.实验室使用UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）的主要目的是：A.降解样本中的RNAB.消除PCR产物污染C.提高逆转录效率D.增强Taq酶活性答案：B10.进行定量PCR时，标准曲线的R²值应至少达到：A.0.90B.0.95C.0.98D.0.99答案：D11.核酸提取后，A260/A280比值为1.6，提示可能存在：A.蛋白质污染B.酚类残留C.盐离子残留D.基因组DNA污染答案：A12.以下哪项不属于PCR实验室环境监测的常规项目？A.空气沉降菌计数B.工作台面核酸残留检测C.温湿度记录D.紫外线灯辐照强度答案：B13.检测临床样本时，若阴性对照出现扩增曲线，首先应排查：A.引物设计问题B.模板加样错误C.扩增仪温度偏差D.实验室交叉污染答案：D14.数字PCR（dPCR）与实时荧光PCR的主要区别是：A.不需要标准曲线B.使用不同的荧光染料C.扩增原理不同D.对酶的要求更低答案：A15.冷冻保存的核酸样本反复冻融超过3次，最可能导致：A.核酸片段断裂B.蛋白质变性C.盐离子浓度改变D.荧光染料淬灭答案：A二、多项选择题（每题3分，共30分）1.影响PCR扩增效率的因素包括：A.引物与模板的匹配度B.反应体系中Mg²+浓度C.扩增仪升降温速率D.模板核酸的纯度答案：ABCD2.PCR实验室必须配备的防护设备有：A.医用外科口罩B.一次性乳胶手套C.护目镜D.防污染工作服答案：BCD3.关于核酸提取质量控制，正确的做法是：A.每批样本至少设置1个阳性提取对照B.阴性提取对照应使用无核酸的生理盐水C.提取后立即检测，避免长时间室温放置D.若A260/A230比值＜1.8，提示胍盐残留答案：ABCD4.实时荧光PCR结果判读时，需考虑的因素有：A.扩增曲线的形态（是否呈S型）B.阈值线的位置（是否位于指数扩增期）C.内参基因的扩增情况（若有）D.阳性对照的Ct值是否在预期范围内答案：ABCD5.实验室发生核酸污染时，可采取的处理措施包括：A.用10%次氯酸钠溶液擦拭台面B.紫外线照射30分钟以上（距离＜1m）C.使用核酸酶（如DNase）处理污染区域D.更换污染区域的工作服和手套答案：ABD6.以下哪些操作可能导致PCR假阴性？A.样本保存不当（如RNA样本未加稳定剂）B.逆转录反应时间不足（检测RNA时）C.扩增循环数设置过低（如30个循环）D.荧光探针降解（长期反复冻融）答案：ABCD7.关于PCR试剂保存，正确的是：A.引物应分装保存，避免反复冻融B.Taq酶需保存在-20℃，避免常温放置C.荧光探针需避光保存（如铝箔包裹）D.已配制的反应体系可在4℃保存24小时答案：ABC8.新型冠状病毒核酸检测中，以下哪些情况需复核？A.单靶标阳性（ORF1ab阳性，N基因阴性）B.Ct值≥38的阳性结果C.同一患者前后两次检测结果Ct值差异＞5D.阴性对照出现微弱扩增（Ct＞40）答案：ABC9.数字PCR的优势包括：A.无需标准曲线即可绝对定量B.对低丰度核酸检测更敏感C.可区分同源序列（如突变位点）D.实验周期更短答案：ABC10.实验室生物安全管理中，属于一级防护的是：A.样本处理时佩戴N95口罩B.离心时使用带盖离心管C.废弃物分类收集（感染性废物）D.每日工作结束后消毒台面答案：BCD三、判断题（每题1分，共10分）1.PCR实验室各区域可使用同一台冰箱保存试剂和样本。（×）2.核酸提取时，若样本量不足，可将多个样本合并提取以节省试剂。（×）3.UNG酶仅能降解含dUTP的PCR产物，对天然DNA无作用。（√）4.扩增仪的温度校准应至少每6个月进行一次。（√）5.检测RNA时，实验台面需用DEPC水处理以灭活RNase。（√）6.阳性对照应选择高浓度模板（如10^6拷贝/μl），以确保扩增稳定。（×）7.若扩增曲线呈直线（无指数增长），可能是Taq酶失活导致。（√）8.实验室空气消毒可使用过氧化氢汽化消毒，效果优于紫外线。（√）9.核酸提取仪的加样针无需定期校准，因仪器自带质量控制。（×）10.临床样本检测结果需经2名检验人员核对后才能发出报告。（√）四、简答题（每题6分，共30分）1.简述实时荧光定量PCR的基本原理。答案：实时荧光定量PCR通过在反应体系中加入荧光基团（如SYBRGreen或探针），利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程。在指数扩增期，荧光信号强度与模板拷贝数呈正相关，通过设定阈值线确定Ct值（荧光信号达到阈值时的循环数），结合标准曲线或内参基因实现对初始模板的定量分析。2.列举PCR实验室质量控制的5个关键环节。答案：（1）人员培训与资质管理；（2）试剂验收（灵敏度、特异性、稳定性）；（3）设备校准（扩增仪温度、加样器精度）；（4）样本处理（采集、运输、保存符合规范）；（5）室内质控（阴/阳性对照、内参基因）；（6）室间质评（参加权威机构组织的能力验证）。（任意5点）3.核酸提取过程中出现“提取效率低”可能的原因及解决措施。答案：可能原因：①样本类型复杂（如全血含大量血红蛋白抑制物）；②裂解时间不足（细胞未完全破裂）；③磁珠/硅胶柱结合时间过短（核酸未充分吸附）；④洗涤次数过多（核酸被洗脱）；⑤洗脱缓冲液温度过低（DNA/RNA未充分溶解）。解决措施：①预处理样本（如用红细胞裂解液去除血红蛋白）；②延长裂解时间（根据样本类型调整）；③增加结合时间或翻转次数；④按说明书严格控制洗涤次数；⑤使用65℃预热的洗脱缓冲液。4.扩增曲线出现“平台期提前”可能的原因及处理方法。答案：可能原因：①模板浓度过高（超过扩增仪线性范围）；②dNTP或引物浓度过高（反应提前耗尽底物）；③扩增循环数设置过多（超过40个循环）；④Mg²+浓度过高（加速反应进程）。处理方法：①对模板进行梯度稀释后重新检测；②优化反应体系（降低dNTP/引物浓度）；③减少循环数（一般35-40个循环）；④调整Mg²+浓度（通常1.5-2.5mmol/L）。5.实验室如何预防气溶胶污染？答案：（1）操作时避免剧烈震荡、反复吹打样本；（2）使用带滤芯的吸头（阻止气溶胶进入移液器）；（3）扩增后避免打开反应管（实时荧光PCR无需开盖）；（4）各区域严格分区，实验后进行空气消毒（如过氧化氢汽化）；（5）定期检测环境核酸残留（用阴性对照监测）；（6）设置专用的废液处理区，废液需经化学处理（如次氯酸钠）后再丢弃。五、案例分析题（每题10分，共20分）案例1：某实验室进行新型冠状病毒核酸检测，当日检测10份临床样本，其中样本5的ORF1ab基因Ct=32.5，N基因Ct=34.2，其余样本均为阴性；但阴性对照（无模板水）的ORF1ab基因Ct=38.6，N基因无扩增。问题：（1）分析阴性对照异常的可能原因；（2）样本5的检测结果是否有效？需如何处理？答案：（1）阴性对照异常的可能原因：①加样过程中移液器被污染（如吸头未正确安装，气溶胶进入枪体）；②扩增区与样本处理区交叉污染（如实验服未更换）；③试剂配制时被污染（如缓冲液或酶制剂被PCR产物污染）；④实验室环境存在微量病毒核酸残留（如台面未彻底消毒）。（2）样本5的结果需谨慎判断：因阴性对照出现弱扩增（Ct=38.6），提示存在轻度污染，可能导致样本5的假阳性。处理措施：①重新检测样本5，使用新的试剂和吸头；②同时检测样本5的内参基因（如人RPP30基因），确认样本有效性；③若重测结果仍为双靶标阳性且内参正常，报告阳性；若重测阴性或单靶标阳性，报告“检测结果不确定，建议重新采样”。案例2：某实验室检测HPVDNA时，发现所有样本的扩增曲线均呈“波浪形”（荧光信号波动大），而阳性对照和阴性对照结果正常。问题：（1）分析可能的原因；（2）提出解决措施。答案：（1）可能原因：①扩增仪加热模块温度不均匀