CN110974868A 一种工业大麻花粉提取物及其制备方法和应用 （云南省农业科学院经济作物研究所）

(71)申请人云南省农业科学院经济作物研究所(74)专利代理机构云南凌云律师事务所53207代理人康珉A61K36/60(2006.01)A61P35/00(2006.01)一种工业大麻花粉提取物及其制备方法和应用本发明公开一种工业大麻花粉提取物及其21.一种工业大麻花粉提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)搅拌提取或超声波提取，在工业大麻花粉中加入提取剂，采用搅拌提取或超声波提取，过滤得到滤液为提取混合液I,得到的滤渣为剩余固体物；(2)生物酶解提取，对剩余固体物用蛋白水解酶酶解提取，过滤所得滤液为提取混合液(3)合并提取混合液I和提取混合液Ⅱ得液体工业大麻花粉提取物，或合并提取混合液I和提取混合液Ⅱ经浓缩干燥得固体工业大麻花粉提取物。2.根据权利要求1所述的工业大麻花粉提取物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中加入提取剂按工业大麻花粉质量：提取剂体积为1kg:5～50L的比例加入提取剂。3.根据权利要求1所述的工业大麻花粉提取物的制备方法，其特征在于：氯甲烷、环己烷、正己烷中的一种或二种以上可以混溶的溶剂。4.根据权利要求1所述的工业大麻花粉提取物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的搅拌提取是在温度20～65℃下，搅拌反应1～24h,重复提取1～3次，提取2-3次时，将每次提取过滤得到的滤液合并为提取混合液I,最后一次搅拌提取过滤得到的滤渣为剩余固体物；步骤(1)中所述的超声波提取是在温度为20～65℃、超声频率为10-50KHz,超声0.5～12h,超声波提取1～3次，提取2-3次时，将每次提取过滤得到的滤液合并为提取混合液I,最后一次超声波提取过滤得到的滤渣为剩余固体物。5.根据权利要求1所述的工业大麻花粉提取物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的对剩余固体物用蛋白水解酶酶解提取具体包括，在剩余固体物中按1kg剩余固体物加入1～10L水或缓冲液的比例加入水或缓冲液，pH调整为2～10,再加入为剩余固体物质量的0.01～5%的蛋白水解酶，于20～65℃酶解0.5～72h,酶解后加热使酶失6.根据权利要求5所述的工业大麻花粉提取物的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为Tris-HC1缓冲液、磷酸缓冲液或醋酸缓冲液。7.根据权利要求1或5所述的工业大麻花粉提取物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的蛋白水解酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝8.工业大麻花粉提取物，其特征在于，用权利要求1至7中任一权利要求所述的工业大麻花粉提取物的制备方法制备得到。9.工业大麻花粉提取物制剂，其特征在于，所述制剂为用权利要求8所述的工业大麻花或气雾剂。10.权利要求8所述的工业大麻花粉提取物或权利要求9所述的工业大麻花粉提取物制剂在制备治疗癌症药物中的应用。3技术领域[0001]本发明属于有效物质的提取工艺技术及应用技术领域，具体涉及工业大麻花粉提取物及其制备和应用。背景技术[0002]大麻(CannabissativaL.),为大麻科(Cannabinaceca)大麻属(Cannabis)一年为止，在大麻中已经发现了150多种具有潜在药用价值的成分，包括大麻素类化合物(包括四氢大麻酚(Tetrahydrocannabinol,THC)、大麻二酚(Cannabidiol,CBD)、大麻酚(Cannabinol,CBN)、大麻萜酚(Cannabigerol,CBG)和大麻环萜酚(Cannabichromene,CBC)[0003]大麻花粉中含有丰富的蛋白质、碳水化合物、黄酮类化合物、萜烯类化合物、微量元素等有效成分。经云南省农业科学院大麻团队前期关于工业大麻花粉提取物生物活性研列腺功能、提高免疫力、增强智力发育等功效。但到目前为止，却未见对工业大麻花粉中有效物质提取方法的报道。[0004]工业大麻是四氢大麻酚含量<0.3%的大麻，其含量通常采样中国NY/T3252.1-2018中推荐方法检测。发明内容[0005]本发明针对上述问题，提供了一种工业大麻花粉提取物及其制备和应用。其技术方案如下：[0007](1)搅拌提取或超声波提取，在工业大麻花粉中加入提取剂，采用搅拌提取或超声波提取，过滤得到滤液为提取混合液I,得到的滤渣为剩余固体物；[0008](2)生物酶解提取，对剩余固体物用蛋白水解酶酶解提取，过滤所得滤液为提取混合液Ⅱ;[0009](3)合并提取混合液I和提取混合液Ⅱ得液体工业大麻花粉提取物，或合并提取混合液I和提取混合液Ⅱ经浓缩干燥得固体工业大麻花粉提取物。[0010]进一步，步骤(1)中加入提取剂按工业大麻花粉质量：提取剂体积为1kg:5～50L的比例加入提取剂。余物质为分析纯。[0012]进一步，步骤(1)中所述的搅拌提取是在温度20～65℃下，搅拌反应1～24h,重复提取1～3次，提取2-3次时，将每次提取过滤得到的滤液合并为提取混合液I,最后一次搅拌4提取过滤得到的滤渣为剩余固体物；步骤(1)中所述的超声波提取是在温度为20～65℃、超声频率为10-50KHz,超声0.5～12h,超声波提取1～3次，提取2-3次时，将每次提取过滤得到的滤液合并为提取混合液I,最后一次超声波提取过滤得到的滤渣为剩余固体物。[0013]进一步，步骤(2)中所述的对剩余固体物用蛋白水解酶酶解提取具体包括，在剩余固体物中按1kg剩余固体物加入1～10L水或按1kg剩余固体物加入1～10L缓冲液的比例加入水或缓冲液，pH调整为2～10,再加入为剩余固体物质量的0.01～5%的蛋白水解酶，于20~65℃酶解0.5～72h,酶解后加热使酶失活，然后过滤，所得滤液为提取混合液Ⅱ。[0014]进一步，所述缓冲液为Tris-HC1缓冲液、磷酸缓冲液或醋酸缓冲液。[0016]本发明提供的一种工业大麻花粉提取物，用上述工业大麻花粉提取物的制备方法制备得到。[0017]本发明还提供工业大麻花粉提取物制剂，所述工业大麻花粉提取物制剂是用上述工业大麻花粉提取物制成临床上或药学上可接受的包括但不限于如下剂型的制剂：粉剂、[0018]本发明还提供了上述工业大麻花粉提取物或工业大麻花粉提取物制剂在制备治疗癌症药物中的应用。以及上述工业大麻花粉提取物在制备治疗肝癌药物或肺癌药物中的应用，上述工业大麻花粉提取物制剂在制备治疗肝癌药物或肺癌药物中的应用。[0020]1.本发明的提取工艺独特，第一步采用搅拌提取或超声波提取，主要以得到的小分子化合物混合液，第二步采用生物酶解提取主要以得到肽类化合物，分开提取，最大程度的提取工业大麻花粉中的有效成分，经应用表明，本发明工业大麻花粉提取物在对肝癌细胞的生长、肺癌细胞的生长均有显著的抑制作用，并且对正常细胞的生长没有毒副作用。具体实施方式[0023]以下各实施例中所述的经除杂处理的工业大麻花粉是将工业大麻花粉过400目筛子，其筛下物为经除杂处理的工业大麻花粉。[0024]实施例1工业大麻花粉提取物制备方法之一[0025](1)超声波提取：取1kg经除杂处理的工业大麻花粉，加入乙醇-水提取剂50L,在65℃下超声0.5h,超声频率为50KHz,用滤纸过滤得滤液I和滤渣I,所述乙醇-水提取剂为分析纯乙醇：蒸馏水的体积比为1:1的混合溶剂，向滤渣I中加入所述的乙醇-水提取剂10L,在65℃下超声0.5h,超声频率为50KHz,用滤纸过滤得滤液Ⅱ和滤渣Ⅱ,在滤渣Ⅱ中加入所述的乙醇-水提取剂10L,在65℃下超声0.5h,超声频率为50KHz,用滤纸过滤得滤液Ⅲ和滤渣Ⅲ,合并三次滤液(即合并滤液I、滤液Ⅱ和滤液Ⅲ)、采用减压蒸馏方法浓缩合并的滤液至恒定重量即得提取混合液I;滤渣Ⅲ即为剩余固体物质，滤渣Ⅲ0.85Kg备用。[0026](2)生物酶解提取：在步骤(1)所得的滤渣Ⅲ即剩余固体物质中加入8.5L醋酸缓冲5液，调节pH值为10,加入17g木瓜蛋白酶和25.5g碱性蛋白酶，65℃下酶解72h后，加热至150℃维持3min使酶失活，然后用滤纸过滤，收集滤液采用减压蒸馏方法浓缩至恒定重量即得提取混合液Ⅱ。[0027](3)合并提取混合液I和提取混合液Ⅱ,并冷冻干燥(100Pa,72h)至固体即得工业大麻花粉提取物0.11kg,收率11%。[0028]实施例2:工业大麻花粉提取物制备方法之二[0029](1)搅拌提取：取1kg经除杂处理的工业大麻花粉，加入石油醚-乙酸乙酯提取剂5L,所述石油醚-乙酸乙酯提取剂为分析纯石油醚：分析纯乙酸乙酯的体积比为1:1的混合溶剂，在20℃下以转速为1000rpm搅拌反应24h,用滤纸过滤得滤液I和滤渣I,向滤渣I中加入所述的石油醚-乙酸乙酯提取剂5L,在20℃下以转速为1000rpm搅拌反应24h,用滤纸过滤得滤液Ⅱ和滤渣Ⅱ,在滤渣Ⅱ中加入所述的石油醚-乙酸乙酯提取剂5L,在20℃下以转速为1000rpm搅拌反应24h,用滤纸过滤得滤液Ⅲ和滤渣Ⅲ,合并滤液I、滤液Ⅱ和滤液Ⅲ,采用减压蒸馏方法浓缩合并的滤液至恒定重量即得提取混合液I0.74Kg;得滤渣Ⅲ(即剩余固体物质)为0.74kg备用。[0030](2)生物酶解提取：在滤渣Ⅲ(即剩余固体物质)中加入1LTris-HCl缓冲液，调节pH值为2,加入7.4g胃蛋白酶，20℃下酶解0.5h后，加热至150℃维持3min使酶失活，然后用滤纸过滤，收集滤液采用减压蒸馏方法浓缩至恒定重量即得提取混合液Ⅱ。[0031](3)合并提取混合液I和提取混合液Ⅱ,并冷冻干燥(100Pa,72h)至固体即得工业大麻花粉提取物0.19kg,收率19%。[0032]实施例3工业大麻花粉提取物制备方法之三[0033](1)超声波提取：取1kg经除杂处理的工业大麻花粉，加入丙酮-水提取剂A15L,所述丙酮一水提取剂A为分析纯丙酮：蒸馏水的体积比为1:9的混合溶剂，在35℃和超声频率为10KHz下超声12h,用滤纸过滤得滤液I和滤渣I,在滤渣I中加入丙酮一水提取剂B10L,在35℃和超声频率为10KHz下超声12h,用滤纸过滤得滤液Ⅱ和滤渣Ⅱ,所述的丙酮-水提取剂B为分析纯丙酮：蒸馏水的体积比为1:1的混合溶剂，在滤渣Ⅱ中加入丙酮-水提取剂B10L,在35℃和超声频率为10KHz下超声12h,用滤纸过滤得滤液Ⅲ和滤渣Ⅲ,合并滤液I、滤液Ⅱ和滤液Ⅲ,用减压蒸馏方法浓缩合并的滤液至恒定重量即得提取混合液I;得滤渣Ⅲ(即剩余固体物质)0.83kg,备用。[0034](2)生物酶解提取：在滤渣Ⅲ(即剩余固体物质)中加入5L磷酸缓冲液，调节pH值为7.4,加入14.4g菠萝蛋白酶和10.5g木瓜蛋白酶白酶，35℃下酶解4h后，加热至150℃维持3min使酶失活，然后用滤纸过滤，收集滤液采用减压蒸馏方法浓缩至恒定重量即得提取混合液Ⅱ。[0035](3)合并提取混合液I和提取混合液Ⅱ,并冷冻干燥(100Pa,72h)至固体即得工业大麻花粉提取物0.145Kg,收率14.5%。[0036]实施例4:工业大麻花粉提取物体外抗癌实验研究[0037]样品：肝癌细胞株(HepG2)、肺腺癌细胞株(A549)、人胚肺细胞(MRC-5),均为市[0038]分别在RPMI1640培养液中分别悬浮培养肝癌细胞株(HepG2)、肺腺癌细胞株(A549)、人胚肺细胞(MRC-5),将培养的细胞接种到96孔板中，细胞的密度控制在0.9×10⁴6~1.1×10⁴个/100μL间，均在37℃,5%CO₂的培养箱中培养24小时后，分别使用新的RPMI1640培养液(其中分别含不同浓度(0-100μM)的顺铂(CDPP)、工业大麻花粉提取物(为具体实施例1所得，0-100μg/mL)替换先前的培养液。以不加样品的RPMI1640培养基为阴性对96孔板中加入MTT溶液(5mg/mlPBS)25μL,在37℃,5%CO₂条件下继续培养4小时，高速离心作重复进行3次取平均值，结果如下表1。[0039]表1工业大麻花粉提取物体外毒性实验样品工业大麻花粉提取物[0041]实施例4表明工业大麻花粉提取物在体外展现较好的抗癌活性，同时对正常细胞无毒性。[0042]实施例5:工业大麻花粉提取物软膏的制备[0043]在烧杯中加入硬脂酸1.6g、单硬脂酸甘油酯0.8g、十八醇0.8g、液状石蜡1.2g、水貂油1.2g,水浴加热至熔融后，缓慢加入预先混合均匀的混合试剂C,快速搅拌，冷却至乳状，再加入工业大麻花粉提取物1.5g,混匀后即得工业大麻花粉提取物软膏，所述混合试剂C由三乙醇胺0.18ml,甘油1.2g,尼泊金乙酯0.02g,超纯水0