CN111202767A 大麻全草提取物在改善tau蛋白和β-淀粉样蛋白病理损伤中应用 （汉义生物科技（北京）有限公司）

普通合伙企业)53116A61K36/60(2006.01)A61P25/00(2006.01)大麻全草提取物在改善tau蛋白和β-淀粉其特征是一种大麻全草提取物可以同时有效的麻全草提取物通过抑制tau蛋白聚集和tau蛋白磷酸化程度两个途径减轻tau蛋白的病理损伤，通过抑制淀粉蛋白沉积β-淀粉样蛋白病理损21.一种大麻全草提取物的应用，其特征在于改善tau蛋白和β-淀粉样蛋白病理损伤。2.根据权利要求1所述的大麻全草提取物的应用，其特征在于改善人类tau蛋白和β-淀粉样蛋白的病理损伤。3.根据权利要求2所述的大麻全草提取物的应用，其特征在于所述的改善人类tau蛋白的病理损伤是抑制tau蛋白聚集。4.根据权利要求3所述的大麻全草提取物的应用，其特征在于所述的抑制人类tau蛋白聚集是抑制tau311蛋白聚集。5.根据权利要求2所述的大麻全草提取物的应用，其特征在于所述的改善人类tau蛋白的病理损伤是抑制tau蛋白磷酸化的水平。6.根据权利要求5所述的大麻全草提取物的应用，其特征在于抑制磷酸化的位点是tau蛋白396位点。7.根据权利要求5所述的抑制tau蛋白磷酸化的水平，其特征在于抑制磷酸化的位点是tau蛋白231位点。8.根据权利要求5所述的抑制tau蛋白磷酸化的水平，其特征在于抑制磷酸化的位点是tau蛋白199位点。9.根据权利要求2所述的大麻全草提取物的应用，其特征在于改善人类β-淀粉样蛋白的病理损伤是减轻了Aβ淀粉蛋白沉积。10.根据权利要求9所述的减轻了Aβ淀粉蛋白沉积，其特征在于减轻了Aβ42淀粉蛋白沉3大麻全草提取物在改善tau蛋白和β-淀粉样蛋白病理损伤中应用技术领域[0001]本发明属于改善蛋白的病理损伤技术领域，具体涉及一种改善tau蛋白和β-淀粉样蛋白的病理损伤的分子领域。背景技术[0002]微管系统是细胞骨架成分，可参与细胞功能。Tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白成束。正常人中由于Tau蛋白mRNA剪基蛋白，有多个可以磷酸化的的氨基，但是正常Tau蛋白分子含2～3个磷酸基。Tau蛋白异常折叠错误和不当磷酸化，可以导致蛋白质功能紊乱，从而导致的病理改变，甚至是疾病的发[0003]β淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)是含有39～43个氨基酸的多肽。多与伴侣蛋白结引发神经毒性作用。[0004]大麻全草提取物(CBDV)是工业大麻中主要的无精神活性成分，现在在医学上也发现多种功能。发明内容[0006]本发明的目的在于提供一种改善tau蛋白和β-淀粉样蛋白病理损伤的物质。[0007]本发明的目的是这样实现的，包括大麻全草提取物，用于改善tau蛋白的病理损伤，特别是改善人类tau蛋白的病理损伤，其通过抑制tau蛋白聚集特别是抑制humantau311蛋白聚集，或者通过抑制tau蛋白磷酸化的水平，抑制位点是tau蛋白396位点和tau蛋白231位点和tau蛋白199位点。大麻全草提取物，用于改善人类β-淀粉样蛋白的病理损伤通过减[0008]本发明优点是大麻全草提取物是大麻中众多成分的一种，毒性低，不具有成瘾性，可以长时间服用，大麻全草提取物易于大规模生产，其可以减轻tau蛋白的病理损伤，通过抑制tau蛋白聚集和磷酸化实现和改善人类β-淀粉样蛋白的病理损伤。附图说明[0009]图1为大麻全草提取物(CBDV)抑制了Aβ聚集实验。[0010]图2为大麻全草提取物(CBDV)抑制了tau蛋白聚集和磷酸化的实验。具体实施方式4tau)聚集形成的神经纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFT)是重要的病理特征[1]。在体外研究方面，我们采用负染投射电镜实验观察大麻全草提取物TCE(CannabisExtract)对Aβ42(Sigma,USA)聚集及tauAc-306VQIVYK311(成都凯捷生物医药科技发展有限公司提供)聚集后的螺旋丝状物的干扰效果[2,3]。此外，采用南京大学-南京生物医药研究院购置的APP/PS1转基因小鼠进行体内研究，在小鼠三月龄时，分别设立对照组和大麻提取物治疗组(每组均为12只动物，雌雄各半),大麻提取物治疗组给药剂量为100mg/kg,持续9个[0012]Aβ解聚分析，Aβ42肽购于Sigma公司，单体的前期处理即分装按Dahlgren论文中培养箱中孵育7天形成Aβ原纤维，然后加入20mg/mL大麻全草提取物(TCE)共同孵育3天，在透射电子显微镜(Hitachi7650)下观察并拍照。[0013]Tau蛋白抑聚分析，tauAc-306VQIVYK311(成都凯捷生物医药科技发展有限公司提供),Tau(100μM)在加入肝素的PBS中孵育3天后，tau聚集形成螺旋丝状。然后加入加入20mg/mL大麻全草提取物(TCE)再共同孵育3天，在透射电子显微镜(Hitachi7650)下观察并拍照。APP/PS1转基因AD鼠满9月龄后，用10%水合氯醛麻醉(0.3ml/100g),用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)经心内穿刺灌注，很快取出大脑，用手术刀切分为两个脑半球，右侧半球的大脑是固定在4%多聚甲醛(pH值7.4)24h脱水，然后在40C的条件下，用30%蔗糖溶液继续脱水24小时，冰冻切片级切片(厚度35μm),切好的片子保存在40%乙二醇PBS溶液中用于组织学分析，左脑则浸于液氮中，置于-80℃保存，用作生化分析。[0014]免疫组化IHC采用漂片法[3],每～200μm选取5片切好的脑片，然后浸在0.3%过氧化氢20分钟以抑制内源性过氧化物酶活性，接着在70%甲酸为继续浸泡10分钟。PBST洗片3次，然后加入anti-Aβ抗体6e10或tau-396(1:500稀释，Covance,美国),在4℃条件下孵育ImageJ软件定量分析，刚果红染色选片方法同上。用氯化钠工作液(饱和氯化钠在80%的酒精和0.01%的氢氧化钠)在室温下了浸泡40分钟，然后直接放置到刚果红工作溶液(饱和刚果红氯化钠工作溶液)继续浸泡1小时，在无水酒精中迅速脱水。用LeicaDM4000B正置显微镜观察大脑皮层和海马区的染色斑点，用LeicaDFC550对其成像，最后用ImageJ软件定量分析。[0015]蛋白印迹实验(WB),将脑组织匀浆煮沸10min,将负载蛋白在10%SDS丙烯酰胺凝胶中电泳，然后转移到硝基纤维素膜上(AmershamBiosciences).用5%脱脂牛奶溶解在TBS-吐温20中阻断1小时后，与一抗(tau199,tau231,tau396)孵育过夜。洗膜，然后在室温下孵育二抗，并使用奥德赛红外成像系统(LI-CORBiosciences,Lincoln,NE,UnitedStates)进行检测。采用德国ImageJsoftware(Rawaksoftware,Inc.)对蛋白质条带进行定量分析。用试剂盒，并按照厂家提供的操作指南进行。[0017]实验结果，大麻全草提取物(TCE)抑制了Aβ聚集。如图1显示大麻全草提取物(TCE)减轻了Aβ淀粉蛋白沉积.A-B:免疫组化(6e10)染色结果；C-D:刚果红染色结果；I-J:56e10和刚果红染色结果的对比，大麻全草提取物(TCE)治疗后APP/PS1转基因小鼠淀粉蛋白斑块明显减少约46%;E-F:20μg的Aβ42共同孵育7天后聚集；G-H:20mg/mL的大麻全草提取物(TCE)与Aβ42共同孵育3天后Aβ纤维转变为扭曲、短小纤维，或无定型的聚合体；K:ELISA试剂盒检测小鼠大脑中的Aβ,TCE治疗后APP/PS1小鼠大脑中的Aβ40,Aβ42及总的Aβ的浓度均显著下降(p<0.05)。[0018]大麻全草提取物(TCE)抑制了tau蛋白聚集。如图2显示A-B:免疫组化(tau396)染色结果；C:WB实验结果(tau396、tau231、tau199);D:WB结果对比，大麻全草提取物(TCE)治疗组的tau磷酸化水平明显降低(p<0.05);E-F:Tau(100μM)孵育4天后的电镜图片，tau为螺旋丝状；G-H:20mg/mL的大麻全草提取物(TCE)与tau蛋白相互作用4天后的电镜图片，tau蛋白的螺旋丝结构被破坏，呈短小，无定形聚集体；I:免疫组化(tau396)结[0019]结论：大麻全草提取物(TCE)在体内外均能与Aβ及tau蛋白相互作用，破坏Aβ及tau蛋白的聚集体结构，减轻或抑制Aβ淀粉蛋白沉积(斑块)和Tau蛋白磷酸化聚集，对AD中这两个蛋白所致病理损伤有潜在防治效果。1.HenryW,Querfurth,FrankM,LaFerla.MechanismsofDiseDisease.TheNewEnglandJournalofMedicine.2010;362,329-344。[0021]2.Li,C.,Gotz,J.Tau-basedtherapiesinneurodegeneopportunitiesandchallenges.NatLiu,J.,Zhu,C.,Shen,L.L.,Liu,C.H.,Wang,Y.R.,Zeng,G.HChen,J.,Liang,C.R.,Xiang,Y.,Bu,X.L.,Deng,J.,Li,JY.Q.,Xu,X.,Xu,H.W.,Zhong,J.H.,Zhou,H.D.,Zhou,X.F.,WaEdaravonealleviatesAlzheimer'sdisease-typepathologiesdeficits.ProcNatlAcadSciUSA.2015;2,522