CN114839367A 一种大麻素单克隆抗体的制备及其应用 （西南林业大学）

(10)申请公布号CN114839367A(21)申请号202210438001.9(71)申请人西南林业大学地址650000云南省昆明市白龙寺300号(72)发明人栾云鹏李襄郑双庆李艳梅贾璐李志朋(74)专利代理机构北京国翰知识产权代理事务所(普通合伙)11696专利代理师张天辰一种大麻素单克隆抗体的制备及其应用本发明公开了一种大麻素单克隆抗体的制备及其应用，属于生物技术领域。大麻素单克隆抗体的制备具体步骤包括：(1)半抗原制备：将大麻素分子与4-氯苯甲酸甲酯反应即得半抗原；(2)完全抗原制备：将半抗原与血蓝蛋白偶联即得完全抗原。本发明通过制备出四氢大麻酚、大麻萜酚或大麻二酚的完全抗原，进一步制备对应的单克隆抗体，再将制得的单克隆抗体用于制备胶体金检测试纸。制得的胶体金试纸特异性强，21.一种式I或式Ⅱ或式Ⅲ所示大麻素半抗原，2.一种式IV或式V或式VI所示大麻素完全抗原，3.一种制备权利要求2所述大麻素完全抗原的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)半抗原制备：将大麻素分子与4-氯苯甲酸甲酯反应即得权利要求1所述大麻素半抗(2)完全抗原制备：将半抗原与血蓝蛋白偶联即得权利要求2所述大麻素完全抗原；所述大麻素分子选自四氢大麻酚、大麻萜酚或大麻二酚。4.一种大麻素单克隆抗体，其特征在于，使用权利要求2所述大麻素完全抗原通过动物免疫制得。5.一种胶体金试纸，其特征在于，所述试纸含有权利要求4所述的大麻素单克隆抗体。6.权利要求5所述的胶体金试纸的制备方法，包括如下步骤：3(1)纳米金标记抗体：将纳米金溶液与抗体混合振荡，加入封闭液封闭后离心，重悬后即得抗体悬液；(2)检测线制备：将抗体悬液涂布于硝酸纤维膜靠近样品垫的一端，即得检测线；(3)质控线制备：将羊抗鼠抗体涂布于硝酸纤维膜靠近吸水垫的一端，即得质控线；7.权利要求1所述的半抗原在制备大麻素单克隆抗体中的用途。8.权利要求2所述的完全抗原在制备大麻素单克隆抗体中的用途。9.权利要求5中所述胶体金试纸在检测样品中是否含有大麻素分子中的用途。4一种大麻素单克隆抗体的制备及其应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种大麻素单克隆抗体的制备及其应用。背景技术[0002]大麻是一种古老的具有药用开发价值的栽种植物，大麻素是从大麻植物中提取的氢大麻酚酸等。[0003]CBD是从大麻中提取出的单体，是FDA批准的第一个大麻类药物，CBD是大麻中的非[0004]CBG是一种不具有精神活性的大麻素，研究表明CBG在保护大脑神经细胞方面非常活跃。2015年西班牙马德里康普顿斯大学生物化学与分子生物学系的研究人员发现CBG具有神经保护特性。CBG可改善运动缺陷并保留神经元，提高了抗氧化防御水平，对多发性硬化症、亨廷顿舞蹈症等神经退行性疾病有着积极的影响。[0005]THC是大麻中的主要精神活性物质，被列入第一类精神药品品种目录管制。由于THC会威胁人类健康。而CBG、CBD则具备有益的药理作用，对大麻植物多种成分的快速检测是区别优质工业大麻和毒品大麻的关键技术，对THC的快速检测可以满足毒品检测的需要。[0006]检测样品中是否含有CBD、CBG或THC常用的初筛方法有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、胶体金免疫层析技术(GICA)等。确认方法主要用高压液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC/MS)等理化检测方法。HPLC和GC/MS测试都必须在实验室完成，需要设备并由专业技术人员操作，费用昂贵。放射免疫分析法灵敏度和特异性高，但仪器昂贵，因而无法实现普及应用。酶联免疫分析法在灵敏度和特异性方面保留有放射免疫分析法的优点，但操作复杂、耗时，必需专业技术人员操作。胶体金免疫层析法由于其具有简便快捷、结果明确、无需复杂操作技巧和特殊设备、灵敏度和特异性较高等优点，非常适合对大批量样品进行现场筛查工作，已成为临床诊断领域发展的一个新方向。[0007]本领域迫切需要研发一种简便快速、准确可靠、灵敏、价格便宜适用于农业种植检测、工业大麻产品检测和大麻毒品检测检验方法。中国专利CN101580544A公开了一种胶体金标记大麻、四氢大麻酚单抗免疫检测板，其优点在于能够快速、简易、灵敏地检测四氢大麻酚，但该专利未对其他大麻素分子做进一步研究和试验。发明内容[0008]本发明的第一个目的在于提供一种大麻素完全抗原及其制备方法，为达到该发明[0009]一种式I或式Ⅱ或式Ⅲ所示大麻素半抗原，5式IⅢ。一种式IV或式V或式VI所示大麻素完全抗原，式VI;[0014](1)半抗原制备：将大麻素分子与4-氯苯甲酸甲酯反应即得半抗原；[0015](2)完全抗原制备：将半抗原与血蓝蛋[0016]大麻素分子的免疫原性较弱，将大麻素分子与载体蛋白偶联后能够形成较免疫原性较强的抗原；又因THC、CBG或CBD分子表面均没有能够直接与蛋白偶联的活性基团，因此需要在偶联载体蛋白之前进行衍生化处理制成半抗原，引入活性羧基。[0017]优选地，步骤(1)半抗原制备的具体操作步骤包括：[0018]将大麻素分子、催化剂加入DMF搅拌溶解，再加入4-氯苯甲酸甲酯升温搅拌反应；反应后加LiOH溶液进行水解反应；之后使用乙酸乙酯萃取，收集有机相抽滤、干燥即得半抗6[0019]更优选地，大麻素分子选自四氢大麻酚(THC)、大麻萜酚(CBG)或大麻二酚(CBD)。[0020]更优选地，催化剂包括三乙胺、DMAP和NAOH。[0022]更优选地，4-氯苯甲酸甲酯与大麻素分子的重量比为2-3:4-8。[0023]更优选地，4-氯苯甲酸甲酯与大麻素分子的反应温度为65-80℃。[0024]更优选地，4-氯苯甲酸甲酯与大麻素分子的反应时间为2-5h。[0025]更优选地，LiOH的浓度为20-30wt%。[0026]更优选地，水解反应的时间为2-5h。[0027]更优选地，水解反应温度为室温。[0028]更进一步优选地，步骤(1)半抗原的具体操作步骤包括：[0029]按重量份计，将4-8份大麻素分子、5-10份三乙胺、6-8份DMAP和1-2份NAOH加入15-20份DMF搅拌溶解，再加入2-3份4-氯苯甲酸甲酯升温至65-80℃搅拌反应2-5h;反应后加15-20份水并使用乙酸乙酯进行萃取；收集有机相并浓缩干燥后加15-20份20%-30%的LiOH溶液，室温下进行水解反应2-5h;之后使用乙酸乙酯萃取，收集有机相并调节pH至5-6,抽滤、干燥即得半抗原。[0030]优选地，步骤(2)完全抗原制备的具体操作步骤包括：[0031]将血蓝蛋白溶于缓冲液中制得血蓝蛋白溶液；将半抗原溶于DMF中，并加入EDC和NHS;将半抗原溶液逐滴加入血蓝蛋白溶液，滴加完毕后搅拌反应；反应后透析即得完全抗[0032]更优选地，缓冲液为CBS缓冲液，pH9.5-9.8,浓度0.05-0.1M。[0033]更优选地，血蓝蛋白与缓冲液的重量比为2-8:15-30。[0034]更优选地，血蓝蛋白与半抗原的重量比为2-8:1-2。[0036]更优选地，反应温度为室温。[0037]更优选地，反应时间为10-15h。[0038]更优选地，透析体系为PBS缓冲液，pH9-10,浓度0.1-0.5M。[0039]更进一步优选地，步骤(2)完全抗原制备的具体操作步骤包括：[0040]按重量份计，将2-8份血蓝蛋白溶于20-30份CBS缓冲液(pH9.5-9.8,浓度0.05-0.1M)中；将1-2份半抗原溶于80-100份DMF中，并加入2-3份EDC和1-2份NHS;将半抗原溶液逐滴加入血蓝蛋白溶液，滴加完毕后室温搅拌反应10-15h;反应后使用PBS缓冲液(pH9-10,浓度0.1-0.5M)透析即得完全抗原。[0041]上述制备完全抗原的方法仅为优选制备方法，本发明完全抗原的制备中，可使用任何本领域已知的现有技术进行连接。[0042]优选地，一种大麻素单克隆抗体的制备方法，制备步骤还包括：[0043]血清效价检测及筛选；杂交瘤细胞制备；杂交瘤细胞筛选；动物体内诱生；抗体纯[0044]本发明还公开了上述制备方法制得的大麻素单克隆抗体。[0045]本发明的第二个目的在于提供一种胶体金试纸，能够准确、快速、灵敏地检测样品7本发明制备的胶体金试纸能够同时检测THC、CBD或CBG中的一种或几种，检测范围更广，有利于提高检测的准确度。[0049](1)纳米金标记抗体：将纳米金溶液与抗体混合振荡，加入封闭液封闭后离心，重悬后即得抗体悬液；[0051](3)质控线制备：将羊抗鼠抗体涂布于硝酸纤维膜靠近吸水垫的一端，即得质控[0052](4)试纸组装：将样品垫、吸水垫贴、底板、将硝酸纤维膜组装完成即得胶体金试[0053]更优选地，(4)试纸组装包括：将样品垫和吸水垫贴在底板两端，将硝酸纤维膜贴在底板中间并与样品垫和吸水垫有重叠，组装完成即得胶体金试纸。[0054]更优选地，抗体溶液中抗体浓度为0.2-0.5mg/mL。时检测2种或3种时，可以增加检测的准确性。[0057]将纳米金溶液、抗体、双甘肽和乙醇胺盐酸盐混合振荡，加入封闭液封闭后离心，重悬后即得抗体悬液。[0058]双甘肽和乙醇胺盐酸盐的加入不会对试纸的检测功能造成负面影响，反之，还能够增加胶体金和抗体的稳定性，使其能够耐受更高的温度。有利于避免因高温导致试纸失[0059]优选地，双甘肽与乙醇胺盐酸盐的重量比为1-3:0.3-0.8。[0060]本发明还公开了上述完全抗原在制备大麻素单克隆抗体中的用途。[0061]本发明还公开了上述双甘肽和乙醇胺盐酸盐在胶体金试纸耐高温中的用途。[0062]本发明还公开了上述胶体金试纸在检测样品中是否含有大麻素分子中的用途。[0063]与现有技术相比，本发明的有益效果为：抗体，再将制得的单克隆抗体用于制备胶体金检测试纸，制得的胶体金试纸特异性强，能够准确检测样品中是否含有THC、CBD或CBG中的1种或几种；灵敏度高，最低检测浓度至少为10ng/mL;并且，本发明胶体金试纸能够在90s以内获得检测结果，检测速度快。本发明制备胶体金试纸时，纳米金标记抗体所制得的抗体悬液中，还添加有双甘肽和乙醇胺盐酸盐，将纳米金溶液、双甘肽和乙醇胺盐酸盐共同使用时，能够增加胶体金试纸的耐高温性，在70℃储存5-10d后仍能够准确检测。CN114839367A说明书5/12页8附图说明的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。再加入300mg4-氯苯甲酸甲酯升温至75℃搅拌反应3h;反应后加1500mg水并使用乙酸乙酯进行萃取，收集有机相并浓缩干燥后加2000mg25%的LiOH溶液，室温下进行水解反应(400MHz,DMSO)δ:9.94(s,1H),8.19(d,2H),7.38(d,2H),6.70(s,1H),6.65(s,1H),5.40(s,1H),5.29(m,1H),3.25(d,2H),2.67(m,2H),2.06H),1.72(s,3H),1.62(m,2H),1.30-1.32(m,4H,CH₂),0.95(m,3H).抗原溶液逐滴加入血蓝蛋白溶液中，滴加完毕后室温搅拌反应10h;反应后使用PBS缓冲液9[0080]制备方法同CBG半抗原的制备，制得式II所示CBD半抗原。采用核磁共振仪对式II所示CBD半抗原进行核磁结构表征，核磁鉴定结果为：HNMR(400MHz,DMSO)δ:9.89(s,1H),8.19(d,2H),7.38(d,2H),6.74(s,1H),6.69(s,1H),5.40(s,1H),5.35(m4.95(m,1H),3.25(d,1H),2.75(d,1H),2.67(m,2H),2.06(m,1H),2.00(m,1H),1.85(1.79(m,1H),1.58(m,2H),1.52(m,1H),1.30-1.32(m,4H式II。[0082](2)完全抗原制备：[0083]制备方法同CBG完全抗原的制备，最终制得式V所示CBD-KLH。式V。[0086](1)THC半抗原制备：[0087]制备方法同CBG半抗原的制备，制得式III所示THC半抗原。采用核磁共振仪对式III所示THC半抗原进行核磁结构表征，核磁鉴定结果为：HNMR(400MHz,DMSO)δ:9.86(s,1H),8.23(d,2H),7.44(d,2H),6.81(s,2H),5.42(d,1H),31H),1.93-1.99(t,2H),1.85(s,3H),1.79(t,1H),1.61(式IⅢ。[0089](2)完全抗原制备：[0090]制备方法同CBG完全抗原的制备，最终制得式VI所示THC-KLH。[0092]实施例2[0093]单克隆抗体的制备[0094]1、CBG单克隆抗体的制备[0095](1)动物免疫[0096]取8只BALB/c小鼠，编号1-8,将CBG-KLH与弗氏佐剂混合免疫，CBG-KLH、弗氏佐剂的重量比为1:1;按皮下注射50μg/只的剂量进行免疫，每3周加强免疫一次，加强免疫时剂量减半，共进行3次免疫，每次免疫后第7d对小鼠尾部采血，测定小鼠血清效价。[0097](2)小鼠血清效价检测及筛选[0098]包板：用PBS包被液(pH7.4)将抗原D-BSA稀释成1μg/mL浓度，混匀后加入96孔板[0099]封闭：包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μL封闭液，37℃恒温箱1h;取[0100]一抗：抗血清按1:500开始进行不同倍数的稀释，每孔100μL;对照为0.01M的PBS;37℃恒温箱1h;[0101]二抗：取出96孔板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μL按照1:20000稀释好的山羊抗鼠-HRP;37℃恒温箱1h;大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价；[0104]检测结果如表1所示；[0105]表13免后7天CBG单克隆抗体效价检测11样品名称对照12345678[0107]根据表1可知，1号小鼠的血清抗体效价最优，最优效价为1:13500;因此选择1号小鼠进行后续实验。[0108](3)杂交瘤细胞制备[0109]复苏SP2/0骨髓瘤细胞；断颈处死1号小鼠取出脾脏制成脾细胞悬液；将骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞实验PEG法诱导细胞融合；诱导融合后使用HAT培养基在96孔板中进行培养，培养条件为37℃,5%CO₂;第三天进行半换液培养，第六天进行全换液培养。[0110](4)杂交瘤细胞筛选[0111]培养第7天，按照“小鼠血清效价检测及筛选”中的步骤进行阳性筛选，将筛选出的效价高的杂交瘤细胞保存备用。[0112](5)动物体内诱生[0113]选择BALB/c小鼠，腹腔注射1mL灭菌石蜡油，正常饲养7d;将筛选出的杂交瘤细胞按照10⁶个/只的剂量注射入小鼠腹腔；7d后小鼠明显产生腹水，抽取腹水，8000r/min离心12min后取上清保存备用。[0114](6)抗体纯化[0115]使用饱和硫酸铵盐析沉淀法纯化抗体，纯化后测定抗体浓度，保存备用。[0117]制备方法同CBG单克隆抗体的制备。[0119]制备方法同CBG单克隆抗体的制备。[0120]实施例3[0121]胶体金试纸的制备[0122](1)纳米金标记抗体：将100mL纳米金溶液pH值调节至9后，与5mL0.3mg/mL的CBG单克隆抗体溶液、CBD单克隆抗体溶液或THC单克隆抗体溶液混合振荡30min,加入50mL5%的BSA溶液封闭后离心，去上清，加入10mL20mMPBS溶液重悬后即得抗体悬液；[0123](2)检测线制备：将抗体悬液涂布于硝酸纤维膜靠近样品垫的一端，即得检测线；[0124](3)质控线制备：将0.4mg/mL的羊抗鼠抗体涂布于硝酸纤维膜靠近吸水垫的一端，即得质控线。[0125](4)试纸组装：将样品垫和吸水垫贴在底板两端，将硝酸纤维膜贴在底板中间并与样品垫和吸水垫有重叠，组装完成即得胶体金试纸；[0126]根据抗体的种类和数量的不同，分别按照上述方法制得：[0127]单检测线试纸(如图1所示):CBG胶体金试纸、CBD胶体金试纸、THC胶体金试纸；[0129]三检测线试纸：CBG-CBD-THC胶体金试纸。[0130]实施例4[0131]胶体金试纸的制备[0132](1)纳米金标记抗体：将100mL纳米金溶液pH值调节至9后，加入1g双甘肽与0.5g乙醇胺盐酸盐，混匀后再与5mL0.3mg/mL的CBG单克隆抗体溶液、CBD单克隆抗体溶液或THC单20mMPBS溶液重悬后即得抗体悬液；[0133](2)检测线制备：同实施例3;[0134](3)质控线制备：同实施例3;[0135](4)试纸组装：同实施例3;[0136]根据抗体的种类和数量的不同，分别按照上述方法制得：[0139]三检测线试纸：CBG-CBD-THC胶体金试纸。[0140]试验例1[0141]单克隆抗体的检测[0142]1、完全抗原偶联比测定[0143]使用紫外分光光度法对偶联后的完全抗原进行扫描，按照吸光度的加和性原理计算KLH上偶联半抗原的量，计算公式如下：为1722.8。说明半抗原与KLH成功偶联并且偶联比适中，可以用于进一步试验。[0146]2、抗体亲和力测定[0147]分别取THC、CBD或CBG使用包被缓冲液配制成1μg/mL进行包被，包被方法同实施例2中“小鼠血清效价检测及筛选”;之后进行封闭，封闭方法同实施例2中“小鼠血清效价检测及筛选”;取实施例2中制得的单克隆抗体使用缓冲液稀释至5μg/mL;将实施例1中制得的混合，37℃恒温箱1h;之后进行二抗、显色、终止，方法同实施例2中“小鼠血清效价检测及筛选”;测定OD值后计算单克隆抗体的亲和常数K:[0149]经测定，实施例2中制得的CBG单克隆抗体的亲和常数为5.74×10¹⁰m⁻¹,CBD单克隆抗体的亲和常数为5.47×10¹⁰M⁻¹,THC单克隆抗体的亲和常数为5.59×10¹⁰M¹;测得的亲和力常数满足制备胶体金试纸的需求。[0150]3、交叉反应测定[0151]使用实施例2中“小鼠血清效价检测及筛选”中的检测方法测定CBG单克隆抗体、[0152]交叉反应率(%)=(目标物质IC50值/其他物质IC50值)×100%;[0153]测定结果如表3所示。[0154]表3实施例2中单克隆抗体的交叉反应率实施例2CBD单抗THC单抗CBG单抗/CBD单抗/THC单抗/[0159]1、灵敏度检测[0160]分别配制浓度为1.0ng/mL、2.0ng/mL、3.0ng/mL、4.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、CBD和THC溶液作为标准液，使用实施例3和4中的单检测线胶体金试纸进行检测；用胶头滴管吸取标准液，滴3滴在样品垫上，滴加后静置观察；检测线和质控线同时显色，判定为阳定为胶体金试纸失效；对阳性样品，同时记[0161]实施例3检测结果如表4所示，实施例4检测结果与实施例3结果类似，为避免冗余，在此不做展示。[0162]表4实施例3胶体金试纸灵敏度检测结果[0163]标准液浓度(ng/mL)CBG胶体金试纸CBD胶体金试纸THC胶体金试纸150阳性，65s阳性，62s阳性，63s100阳性，63s阳性，62s阳性，65s 70阳性，64s阳性，65s阳性，64s 50阳性，68s阳性，67s阳性，66s 25阳性，69s阳性，71s阳性，74s 20阳性，75s阳性，77s阳性，76s 15阳性，77s阳性，77s阳性，80s 10阳性，81s阳性，80s阳性，84s 5阴性阴性阴性4阴性阴性阴性3阴性阴性阴性2阴性阴性阴性1阴性阴性阴性[0164]由表4可知，