联苯菊酯和噻虫胺在甘蓝上的残留分析方法研究

课题名称：联苯菊酯和噻虫胺在甘蓝上的残留分析方法研究

摘要目的：本实验采用QUECHERS前处理方法与Waters超高效液相色谱-TQD串联质谱联用仪检测，建立了联苯菊酯和噻虫胺在甘蓝上的简单、快速的残留分析方法。方法：本次试验主要是采用Waters超高效液相色谱-TQD质谱联用仪来进行检测，相比较气相色谱-串联质谱，克服了其不能检测在热条件下不稳定、气化比较困难、极性非常强的化合物的一系列问题，逐渐成为目前首选的农药残留检测手段。结果：在空白样本中添加联苯菊酯浓度0.02-1mg/kg的条件下，在甘蓝中的添加回收率在92%-102%之间，变异系数在4.0%-7.3%之间；在空白样本中添加噻虫胺浓度为0.02-1mg/kg的条件下，其添加回收率在97%-104%之间，变异系数在2.9%-6.3%之间；两种药的浓度与色谱峰的峰面积在0.02-1mg/kg浓度这一范围内，呈显著的线性关系。结论：QUECHERS方法简单易操作，符合农药相关要求，并且可为以后的实验提供合理的使用意见。关键词：噻虫胺；联苯菊酯；甘蓝；残留分析

目录TOC\o"1-3"\h\u32644一、前言 前言中国这么多年以来一直就是农业生产的大国，随着人口数量的增长，粮食问题得到的关注越来越高，传统的种植方法显然已经不能满足人类现阶段的需求。虽然影响农作物生长的因素有许许多多，例如气候变暖，各类病虫害的频发等等。在科技高度发达的21世纪，农药依旧是解决粮食产量问题和提高质量的最好途径。近些年来农药的使用量越来越多，而农药的危害也是愈演愈烈。人类使用的农药大多数都会存在残留于空气环境之中，而只有很少的一部分会被农作物利用，当这些农药大量残留在我们生活的环境中时，最切合实际的一点就是危害我们的身体以及动物，无论经过一个什么样的过程，最后的一切还是回馈于人类自身，随着我们生活条件的提高，对生活质量以及身体健康的高标准要求，所以国家对农药这方面的残留分析也是越来越重视。农药残留带来的是全球性的环境污染和生态破坏，带来的危害是非常严重的，那么它的途径主要分为两个方面：=1\*GB3①其自身的毒性非常的强，短期内即对人类和其他生物体造成严重的危害。=2\*GB3②其残留水平高，而且十分难降解，持续的周期非常的强，逐渐在环境中积累到一定程度之后，降低水质，生物在取食或者通过其他途径摄入农药后，通过食物链富集到人类身上，给人体造成非常大的毒害，可引起“致畸、致癌、致突变”（Dich.J等，1997)。因此，研究环境及农产品中农药的残留对于保护生态环境和人类健康具有非常重要的作用和意义，而研究方法的确立在整个残留分析中起着至关重要的作用。方法制定原则首先我们要明白残留对我们来说意味着什么，以及它的定义具体是怎么样的。农药残留是指残存与人类食物、畜牧饲料和饮用水中的农药原体、代谢物、降解物和其他转化物的总称。那么农药的残留物定义则是指农药管理机构对施用于可食用或可饲用作物上的农药，在进行善事摄入风险评估以及制定最大允许残留量时所明确的残留化合物。对于社会上许多的药品，有很多是属于高毒以及明文禁止的，那么基于禁止和限制使用农药的高毒、难解等特性，国际组织和欧美等国均对其制定了严格的限量标准，以加强对生产使用和贸易环节食品安全的监控，保护消费者健康、环境安全和农业产业安全。我国农药残留标准的制定准备阶段准备阶段起草阶段审查阶段立项阶段征求意见阶段批准阶段图1、制定流程制定标准的原则分为六项1、实事求是原则。2、顾客为主原则。3、科学先进原则。4、和谐一致原则。5、时机适宜原则。6、效益最佳原则。残留化学评估残留化学评估主要分为四个方面：第一个是动植物代谢试验和残留定义评价。我们可以根据之前学习过的毒理学试验的一个结果，或根据其他参考文献代谢试验中农药残留的规律、最终产物和农药残留的定义进行一个相对客观地评价。第二个方面是残留行为的评价。分为三个小节来依次进行评价：1、残留的分析方法。2、样品贮藏的稳定性。3、规范残留试验。第三个方面就是我们通常所要做的加工过程的评价。也就是对食品加工过程前后农药残留量变化进行评价，计算加工因子，在有必要的时候，也可以对加工过程中农药性质变化来进行评价。第四个方面是动物饲喂试验评价。我们主要通过饲料、直接给药和外用对动物饲喂试验造成动物产品中农药残留试验结果进行评价。膳食摄入评估膳食摄入评估主要分为两个方面来进行评估，第一个方面是长期膳食摄入评估。根据我国卫生部发布的《中国不同人群消费膳食分组食谱》，并结合残留化学评估推荐的残留实验中值或已经制定的最大残留限量，计算国家估算每日摄入量。第二个方面就是关于短期膳食摄入评估。按照世界卫生组织推荐方法，根据每日膳食结构和具体食品特征，计算国家估算短期摄入量，通过与毒理学评估推荐的急性参考剂量来进行比较进行一个评估。联苯菊酯理化性质中文通用名：联苯菊酯，英文通用名：Bifenthrin，分子量：422.87，化学名称：（1R，S)-顺式-（Z)-2，2-二甲基-3-（2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)环丙烷羧酸-2-甲基-3-苯基苄酯，纯品为固体，熔点68～70.6℃，原药为浅褐色固体，有效成分含量90～96%，熔点57～64℃，密度d25为1.210，25℃时蒸气压为2.4×10-2帕。对光稳定，酸性介质中较稳定，碱性介质中易分解，在常温下贮存稳定。溶于丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙醚、甲苯等有机溶剂，微溶于庚烷和甲醇，难溶于水，在水中的溶解度为0.1mg/L。化学结构式为：.2生物活性联苯菊酯具有触杀和胃毒作用，无内吸和熏蒸活性。联苯菊酯击倒速度快，残效期长，杀虫谱广，对螨也有较好防效。主要用于防治各种鳞翅目幼虫、粉虱、蚜虫、植食性叶螨。联苯菊酯对鱼类等水生生物，家蚕高毒。联苯菊酯防治棉铃虫，棉红蜘蛛，桃小食心虫，梨小食心虫，山楂叶螨、柑桔红蜘蛛，黄斑蝽，茶翅蝽，菜蚜，菜青虫，小菜蛾，茄子红蜘蛛，茶细蛾等20多种害虫，温室白粉虱、茶尺蠖、茶毛虫。联苯菊酯杀虫活性很高，主要为触杀和胃毒作用，无内吸和熏蒸活性。其作用迅速，持效期长，杀虫谱广。噻虫胺理化性质噻虫胺的纯品的外观是白色结晶粉末，中文名称通常被称作：噻虫胺（1-（2-氯-5-噻唑基甲基)-3-甲基-2-硝基胍），英文名称：Clothianidin，噻虫胺的分子式为：C6H8ClN5O2S，分子量为：249.68，一般它的熔点是：178.8°C，密度是1.61，在0-6°C的条件下进行储存，水溶解性：327mg/Lat20ºC，在25°C的条件下在水中噻虫胺的溶解度一般是在0.327g/L（20°C)左右，乙酸乙酯中的是在2.03g/L左右，在正庚烷中小于0.00104g/L，二甲苯中0.0128g/L，二氯甲烷中1.32g/L，辛醇中0.938g/L，丙酮中15.2g/L。化学结构为：生物活性噻虫胺是日本住化武田农药研究开发的的具有噻唑环的第二代新型烟碱类内吸性杀虫剂，属新烟碱类，是一种活性高、具有内吸性、触杀和胃毒作用的广谱杀虫剂。具有安全高效、选择性强等特点，作用方式和烟碱乙酰胆碱受体较为相似，主要用于农作物水稻、可食用蔬菜、平时常种果树及其他作物上防治蚜虫、叶蝉、飞虱等半翅目、鞘翅目、双翅目和某些鳞翅目类害虫，对半翅目害虫、甲虫目害虫、双翅目等很多害虫等均有较高的防治效果，对水稻、果树、蔬菜等作物的安全性能比较高，但对人畜的毒性相对比较低（陈雁君等，2008）。高毒有机磷农药的杀虫剂。此药剂为剧毒，表现出较好的速效性，每季最多使用三次，安全间隔期为七天。噻虫胺和其他烟碱类化合物一样，作为乙酰胆碱酯酶受体抑制剂，作用于昆虫的中枢神经系统，具有作用效果高、有良好的选择性、哺乳动物接触后比较安全，且和传统农药相比较不存在交互抗性。适宜的作物为水稻、果树、棉花、茶叶、草皮和观赏植物等。其具有杀虫谱广、用量少、内吸与植物传导好、作用机制新颖和环境相容性高等特性，所以认为该药剂被很多研究人员认为有很强的推广和研发的可能性。实验方法试剂与材料试验试剂提取剂：乙腈（色谱纯），净化剂：PSA（乙二胺-N-丙基硅烷）、GCB（炭黑）、无水硫酸镁。试验材料标准品：联苯菊酯（纯度为96.7%）、噻虫胺（纯度为99.8%）试验样品：甘蓝[产地：湖南、河南（大棚）、北京]仪器与设备本次实验用到以下仪器：KQ500B型超声波清洗器；TG16-WS型台式高速离心机；50mL具塞聚四氟乙烯离心管；YS-04型小型高速粉碎机；移液管；容量瓶；移液器枪；CK-1000型组织振荡混合仪；WatersTQS型超高效液相色谱三重四级杆质谱串联仪（UPLC-MS/MS）等。试验方法本次试验采取了常规QuEChERS的方法测定。QuEChERS分析法提取称甘蓝样品10g（精确至0.01g）于50mL具塞聚四氟乙烯离心管中，加入10mL乙腈提取，然后振荡器上充分震荡10min，再加入4g氯化钠并震荡5min，最后在离心机上离心5min（4000rpm/min)，待净化。净化取上清液1.5mL，滴入装有150mg无水MgSO4、40mgPSA和10mgGCB的2ml离心管内，置于涡旋机上充分涡旋30s，随后离心5min（5000r/min)，过液相有机质膜待测。液相色谱-串联质谱测定仪器条件（1）联苯菊酯仪器条件仪器：超高效液相色谱三重四级杆质谱串联仪（UPLC-MS/MS），WatersTQD型色谱柱：AcquityUPLCBEHC18色谱柱（100mm×2.1mm，1.8μm，Waters公司)柱温箱45℃；进样量5µL流动相：0.00min0.30mL/min甲醇：0.2%甲酸水溶液（90：10，V/V）5.00min0.30mL/min甲醇：0.2%甲酸水溶液（90：10，V/V）质谱条件：化合物母离子子离子驻留时间s锥孔电压v碰撞能量v联苯菊酯440.2181.2*0.0802020440.2166.20.0802060注：*为定量离子电离方式：电喷雾电离，正离子；离子喷雾电压：3kV；锥孔气：氮气，50L/h；离子源温度：120℃干燥气：氮气，流速600L/h，温度350℃；碰撞气：氩气，0.19mL/min；质谱条件：Waters超高效液相色谱-TQD质谱联用仪AcquityUPLCBEHC18，2.1*100mm（1.7um）母离子子离子驻留时间s锥孔电压v碰撞电压v联苯菊酯440.20（ES+)166.200.082060181.20*0.082020注：*为定量离子。液相条件：流动相恒流洗脱：0.00min0.3mL/min甲醇：0.2%甲酸水（90：10，V/V）进样量为5uL（2）噻虫胺仪器条件仪器：超高效液相色谱三重四级杆质谱串联仪（UPLC-MS/MS），WatersTQD型色谱柱：AcquityUPLCBEHC18色谱柱（100mm×2.1mm，1.8μm，Waters公司)柱温箱45℃；进样量10µL流动相梯度洗脱：0.00min0.30mL/min乙腈：0.2%甲酸水溶液（10：90，V/V）1.00min0.30mL/min乙腈：0.2%甲酸水溶液（10：90，V/V）1.50min0.30mL/min乙腈：0.2%甲酸水溶液（50：50，V/V）3.50min0.30mL/min乙腈：0.2%甲酸水溶液（50：50，V/V）4.00min5.00min0.30mL/min0.30mL/min乙腈：0.2%甲酸水溶液（10：90，V/V）乙腈：0.2%甲酸水溶液（10：90，V/V）质谱条件：母离子子离子驻留时间锥孔电压碰撞能量噻虫胺250.4131.970.0801020250.4169.00*0.0801016注：*为定量离子电离方式：电喷雾电离，正离子；离子喷雾电压：3kV；锥孔气：氮气，50L/h；离子源温度：120℃干燥气：氮气，流速600L/h，温度350℃；碰撞气：氩气，0.19mL/min；质谱条件：Waters超高效液相色谱-TQD质谱联用仪AcquityUPLCBEHC18，2.1*100mm（1.7um）母离子子离子驻留时间s锥孔电压v碰撞电压v噻虫胺250.40（ES+)131.970.081020169.00*0.081016注：*为定量离子。液相条件：流动相梯度洗脱：0.00min0.3mL/min乙腈：0.1%甲酸水（10：90，V/V）1.00min0.3mL/min乙腈：0.1%甲酸水（10：90，V/V）1.50min0.3mL/min乙腈：0.1%甲酸水（50：50，V/V）3.50min0.3mL/min乙腈：0.1%甲酸水（50：50，V/V）4.00min0.3mL/min乙腈：0.1%甲酸水（10：90，V/V）5.00min0.3mL/min乙腈：0.1%甲酸水（10：90，V/V）进样量为10uL定性测定在实验的过程中如果是在相同的试验条件下进行样品测定的话，那么如果检测出的色谱峰的保留时间与标准样品是相一致的，并且在扣除在仪器检测中所得的背景后的样品质谱图中，所选择的各种需要的离子均出现，而且我们之前所选择的离子丰度比与标准样品的离子丰度比大致是相同的（也就是满足相对丰度>50%，允许±20%偏差；相对丰度>20%-50%，允许±25%偏差；相对丰度>10%-20%，允许±30%偏差；相对丰度≤10%，允许±50%偏差），那么我们则可以判断样品中中是否存在这种农药或相关化学药品的残留。定量测定我们一般在高效液相色谱-串联质谱的这样一个方法中，通常会采用外标-校准曲线法定量测定离子的某些性质。那么为了减少基质对定量测定的影响，一般定量采用标准溶液应采用基质混合标准工作溶液来绘制离子的标准曲线，除此之外我们还要保证所测样品中农药及相关化学品的响应值均在仪器的限行范围内，这样不仅保护了一起的使用寿命，而且对我们的实验结果也会带来很大的便利，增加准确度。平行试验和空白试验为了增加准确度，按照以上步骤对同一试样进行平行试验。做空白试验时不添加药剂，然后在提取和净化过程中仍然按照上述步骤来完成。（称甘蓝CK样品10g（精确至0.01g）于50mL具塞聚四氟乙烯离心管中，加入10mL乙腈提取，然后振荡器上充分震荡10min，再加入4g氯化钠并震荡5min，最后在离心机上离心5min（4000rpm/min)，待净化，取上清液1.5mL，滴入装有150mg无水MgSO4、40mgPSA和10mgGCB的2ml离心管内，置于涡旋机上充分涡旋30s，随后离心5min（5000r/min)，过液相有机质膜待测。）标准曲线联苯菊酯：用电子天平准确称取10.341mg联苯菊酯标准品于洗净烘干后的100mL容量瓶中，用色谱纯乙腈将样品溶解后定容至容量瓶中，配置成100mg/L的母液，然后再将母液再用色谱纯乙腈分别稀释成0.01mg/L、0.02mg/L、0.2mg/L、1mg/L、2mg/L等一系列的标准溶液。噻虫胺：用电子天平准确称取10.020mg噻虫胺标准品与洗净烘干后的100ml容量瓶中，用色谱纯乙腈将样品溶解后定容至容量瓶中，配置成100mg/L的母液，然后再将母液再用色谱纯乙腈分别稀释成0.01mg/L、0.02mg/L、0.2mg/L、1mg/L、2mg/L等一系列的标准溶液。实验过程中需要配单标的配置：10mg/kg：取1ml的100mg/kg的标准液，加入9ml的色谱纯乙腈。2mg/kg：取1ml的10mg/kg的标准液，加入4ml的色谱纯乙腈。1mg/kgppm：取0.1ml的10mg/kg的标准液，加入0.9ml的色谱纯乙腈。0.2mg/kg：取1ml的2mg/kg的标准液，加入9ml的色谱纯乙腈。0.02mg/kg：取1ml的0.2mg/kg的标准液，加入9ml的色谱纯乙腈。结果计算高效液相色谱-串联质谱测定采用的一般是标准曲线法，结果按下式计算：Xi=Ci×V/m各字母所代表的含义如下：Xi：试样中被测组分含量，单位为毫克每千克（mg/kg）。Ci：从标准工作曲线中得到的试样溶液中被测组分的浓度，μg/ml。V：试样溶液定容体积，mL。m：样品溶液所代表的试样的质量，g。添加回收试验用联苯菊酯、噻虫胺两种药种药的单标分别来进行测定，在甘蓝空白样品中加入一定量的溶液，配制成0.02mg/L、0.2mg/L、1mg/L的溶液、每种浓度重复三次，检测方法、实验步骤、仪器条件以及操作步骤同上，但需要注意的是，在做空白实验对照时，不需要加药，在所有加药的基质中，在加过药之后需要静置30min让样本充分吸收药品之后再加提取剂，最后上机检测两种药在甘蓝中的添加回收率。然后做田间试验设计，做残留实验。结果分析标准曲线用色谱纯乙腈将联苯菊酯、噻虫胺母液分别配制成0.01mg/L、0.02mg/L、0.2mg/L、1mg/L、2mg/L的系列标准品溶液，经超高效液相色谱-串联质谱联用仪测定后，以Y（峰面积）对X（标准溶液浓度（mg/L））做图，得到标准回归线，见图1、图2、图3、图4。图1：联苯菊酯溶剂标曲线图图2：联苯菊酯基质标曲线图图3：噻虫胺溶剂标曲线图图4：噻虫胺基质标曲线图由以上四幅图可以看出，两种药剂在0.01～2mg/L浓度范围内，标准溶液浓度与色谱峰的面积呈现出极为明显的线性关系，可准确进行定量分析。添加回收率与相对标准偏差分别配置成为0.02mg/kg、0.2mg/kg、1mg/kg的三个添加浓度，每个浓度进行三次重复，对甘蓝进行处理，用Waters超高效液相色谱-TQD质谱联用仪来进行检测测定回收率，在甘蓝中联苯菊酯的变异系数为4.0%～7.3%，在甘蓝中噻虫胺的变异系数为2.9%～6.3%；在甘蓝中联苯菊酯的平均回收率为92%～102%，在甘蓝中噻虫胺的平均回收率为97%～104%。如下表：添加浓度（mg/kg)回收率（%)平均回收率（%)RSD（%)联苯菊酯0.029290919196926.00.2104100909598975.2110910298103981024.3噻虫胺0.02991151241151121137.70.21041051028796997.4110810298103981023.8添加浓度（mg/kg)回收率（%)平均回收率（%)RSD（%)联苯菊酯0.0291839191103927.30.210499909094955.9110710198103981024.0噻虫胺0.0299991041051021022.90.296105998796976.311071081021021001043.2谱图见下图：联苯菊酯图1甘蓝基质空白对照图2甘蓝基质基质标0.02mg/kg图3甘蓝基质添加回收0.02mg/kg图4甘蓝基质基质标0.2mg/kg图5甘蓝基质添加回收0.2mg/kg图6甘蓝基质基质标1mg/kg图7甘蓝基质添加回收1mg/kg噻虫胺图8甘蓝基质空白对照图9甘蓝基质基质标0.02mg/kg图10甘蓝基质添加回收0.02mg/kg图11甘蓝基质基质标0.2mg/kg图12甘蓝基质添加回收0.2mg/kg图13甘蓝基质基质标1mg/kg图14甘蓝基质添加回收1mg/kg方法小结从以上结果可以看出此方法的精确度和准确度更高，两种药的标准溶液浓度与色谱峰的面积呈现出极为明显的线性关系，可准确进行定量分析；其添加回收率均在92%-104%之间，符合国家残留标准规定。结论本文就甘蓝中联苯菊酯和噻虫胺的残留分析方法进行了探索和建立，用传统的QUECHERS方法试验过程较简单，而且这个试验方法比较成熟，操作起来简单可行，但是在净化过程中色素吸附处理的不彻底，在上机检测的过程中会损坏机器，但是测量的结果比较好，误差较小。甘蓝样品以色谱纯乙腈作为提取溶剂，净化剂为150mg无水硫酸镁、40mgPSA、10mgGCB，样品溶液用Waters超高效液相色谱-TQD质谱联用仪进行检测，仪器对联苯菊酯和噻虫胺的定量限为mg/kg，样品添加水平在0.02-1mg/kg范围内时，联苯菊酯在甘蓝中的平均回收率在92%—102%之间，变异系数在4