亲和嫁接技术课件

亲和嫁接技术1 亲和膜过滤

比较?解决之道?1 亲和膜过滤设计比较:柱高/直径=250/4.6 =54.3

柱高/直径=200/252 =0.794Cu-IDA-Seph-aroseCL-6Bφ252×200

IDA-Sepha-roseCL-6Bφ252×100

design?1 亲和膜过滤.如柱体积一定(即料液处理能力一定)降低柱高增大柱径p不变流速提高分离速度提高“短粗”型亲和柱为使分离速度达到极限值，“理想”的层析柱几何形状应该是柱高等于介质直径结果?1 亲和膜过滤

亲和膜(Affinitymembrane)利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。所以，利用亲和膜的纯化方法又称membrane-basedaffinitychromatography结果=亲和膜亲和膜吸附分离的原理时间比较1st

外扩散-吸附时间比较:利用BSA抗体修饰的Sepharose为介质吸附BSA，基于二级反应动力学常数计算的扩散-吸附反应时间为

5s.

2nd

内扩散-吸附时间:利用tD=L2D/D

计算,BSA在粒径为100umSepharose中扩散-吸附所需平均时间为(5010-4)2/(610-7)=41s，实验材料比较优点1st

传质阻力小,达到吸附平衡的时间短;2nd

压降小，流速快;3rd

设备体积小;4th

配基利用率高,配基用量低.缺点:1st

从分离效率的角度，因膜的厚度(柱高)很小(一般为10~100um)，理论板数很低;2nd

膜的污染和膜孔的堵塞使操作速度、吸附效率和亲和膜的寿命下降.1 亲和膜过滤

结果:利用含10cm3膜材料的小型亲和膜设备可在15分钟内完成1.2dm3粗料液的纯化处理，单抗回收率为97%，其中除去了95%的核酸和99.5%的牛血清白蛋白3rd

Sepracor公司实验结果表明，利用300美元A蛋白可纯化8万美元的单抗。由于该纯化系统将除菌、纯化和浓缩操作一步完成，分离速度可达到传统层析法的100倍。

应用1st

螺旋卷式膜组件(美国CunoCo.)

膜材料:

纤维素一A蛋白/

乙烯配基

操作方式:

流体沿径透过膜组件，中心管流出，

操作压:低于0.07MPa,透过流量达100~1000cm3/min

结果:

利用固定化A蛋白吸附各种来源不同的IgG实验表明，每克膜材料吸附7~19mgIgG，回收率为91~100%。

2nd

中空纤维型微滤膜组件(美国Sepracor公司):

膜材料:

纤维素一A蛋白实验:

纯化含血清培养液中的小鼠单抗的实验Why?2 亲和过滤4th

利用CibacronblueF3G-A修饰的微滤膜(膜厚210um，孔径0.45um，修饰密度为7umol/cm3)吸附葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)

动力学实验结果:

当料液中含有相当于膜吸附容量约67%G6PDH时，0.25s(压力=0.4MPa，线速度=5cm/min)的平均停留时间就足以使吸附达到饱合。当G6PDH含量达到膜吸附容量的130%时，所需的平均停留时间不超过1s。

纯化结果:

利用体积仅4.83cm3的亲和膜在9分钟内即完成了0.6dm3料液的纯化处理，G6PDH收率达82%，比活提高27倍。非常有用的实验技术2 亲和错流过滤超滤膜/微滤膜存在问题:

孔径有很宽的分布范围，因此，单纯的超滤/微滤分离蛋白质等生物大分子的选择性很低，一般只有当两种组分的分子量相差10倍以上时才有可能得到完全分离。办法:

亲和错流过滤(affinitycross-flowfiltration,ACFF)or亲和过滤(affinityfiltration),or亲和超滤(affinityultrafiltration).是亲和技术与膜分离相结合的分离纯化技术，是亲和层析的另一种变形.操作:

2 亲和错流过滤优点(兼备亲和吸附与膜分离):1st

亲和作用高选择性+不溶性微粒固定相的亲和配基，从而增大目标分子与杂分子的尺寸差别，大大提高膜分离的选择性。使亲和过滤的纯化水平可接近或达到亲和层析；2nd

膜分离以压差为传质推动力，速度快，易于放大和实现连续化操作;3rd

制备亲和过滤介质所用的载体一般为水溶性聚合物(如聚丙烯酰胺)或无孔微粒(如聚合脂质体、纳米硅胶)，无内扩散传质阻力，目标分子的亲和结合速度快，从而可最大程度地分挥膜分离法速度快的优势.4th

传统的亲和吸附介质(如琼脂糖凝胶)也可用做亲和过滤介质，此时内扩散传质阻力可能成为分离操作的速度控制步骤。但是，由于膜分离法易于放大，只要保证在吸附过程中目标分子与亲和过滤介质有足够长的接触时间，利用较大的吸附接触器仍可在较高的过滤速度下操作.缺点:单板性

目标分子与亲和过滤介质的接触在全混槽中进行，最多只能达到一级吸附平衡，相当于层析过程的一个塔板。这一单板属性决定了其分离效率不如亲和层析，特别是对于亲和常数小于105dm3/mol的亲和体系.2 亲和错流过滤应用:1st

酵母细胞特点:直径约5um,表面含有多糖残基2nd

应用:用高温死的酵母细胞为亲和过滤介质进行亲和过滤纯化伴刀豆球蛋白A(conA)。3rd

右图为利用中空纤维膜组件的间歇亲和过滤流程亲和吸附conA。Why?2 亲和错流过滤4th

结果:

图为从Jack豆抽提液中纯化conA的实验结果。经一步亲和过滤，conA的收率为70%，产品(右图的第2个峰)经凝胶电泳分析仅显示一条电泳带.3 亲和双水相分配

传统的双水相体系亲和分配(Affinitypartitioning):

利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取，可在配基的亲和作用下促进目标产物在PEG相的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。这就是亲和萃取，又称亲和分配.

PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol)DX=葡聚糖(dextran)3 亲和双水相分配

机理:对于多效价目标分子与配基结合,P-目标分子，L-配基，PLn-单目标分子与n配基形成的复合体.影响因素:1st

Kd2nd[L]/or[PEG–L]3 亲和双水相分配

3rd[PEG-L]/{[PEG-L]+[PEG]}4th

配基种类操作:

与其他亲和纯化技术一样，亲和分配纯化过程也可经过三步:

亲和分配(进料)，杂蛋白质反萃取(清洗)

目标产物反萃取(洗脱)。3 亲和双水相分配应用 图为利用PEG-色素/Aquaphase-PPT(一种淀粉的羟丙基衍生物的商品名)系统从猪肌组织中连续萃取LDH的流程。猪肌组织直接在成相系统中匀浆，固形物分配在下相，而目标产物分配在上相。用离心机分相后，上相用纯下相溶液清洗一次，进入第二个离心机。从第二个离心机流出的上相与磷酸钠溶液(50%，pH6.9~7.0)混合，形成PEG/磷酸钠双水相系统。由于LDH与色素的亲和作用下降，LDH被反萃到下相(磷钠溶液)中得到回收，而上相的PEG和PEG-色素返回匀浆机中循环再利用。

4 亲和反胶团萃取胶束(micelles):

向水中加入S,水溶液的

随[S]增大而下降。当[S]达到一定值后，S缔合形成水溶性胶束,溶液的表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低。亲和反胶团萃取(Affinity-basedreversedmicellarextraction)

是指在反胶团相中除通常的表面活性剂（如AOT）以外，添加另一种助表面活性剂(cosurfactant):

S-配基，通过配基与目标分子的亲和作用，促进目标产物在反胶团相的分配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性。一般将含有配基的助表面活性剂称为亲和助表面活性剂(affinityco-surafctant)。理论亲和反胶团萃取的分配系数其中mL为亲和助表面活性剂的分配系数。如果亲和助表面活性剂主要存在于反胶团相，则mL非常大，上式简化为意义:影响因素实验:

正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(octyl-β-D-glucopyra-noside，OGP)萃取conA.4 亲和反胶团萃取1st

提高conA的萃取率和选择性

如图示，在OGP的存在下conA的萃取率增大，而与OGP无亲和结合作用的核糖核酸酶A的萃取率不变。2nd

配基浓度对mA作用 图为OGP浓度对conA分配系数的影响，随着OGP浓度增大，conA的分配系数增大4 亲和反胶团萃取3rd

对适应pH范围的作用 图示:通过添加亲和助表面活性剂可使目标产物的萃取pH范围增宽。因此利用亲和反胶团萃取不仅可以提高目标产物的分配系数，(回收率),而且由于萃取操作的pH范围较宽，便于通过调节pH值提高萃取分离的选择性。意义?4 亲和反胶团萃取4th盐浓度的影响

引入亲和助表面活性剂无疑是提高反胶团萃取选择性的有效手段。与一般的反胶团萃取一样，亲和反胶团萃取的目标产物也可通过调节水相pH和盐浓度进行反萃取。如图8.37所示，随着水相盐浓度的增大，不管亲和助表面活性剂添加与否，反胶团相的对蛋白质的空间排阻作用增大的结果。

意义4 亲和反胶团萃取5th

葡萄糖 向水相中添加目标产物的水溶性亲和配基，也可抑制目标产物向反胶团相反分配。例如，葡萄糖与conA具有亲和结合作用，在利用OGP进行conA的反胶团萃取时，随着水相葡萄糖浓度增大，conA的萃取率下降。利用目标产物亲和配基的以萃取法相当于亲和层析的特异洗脱，有利于提高目标产物的纯度。

意义?5 亲和沉淀

现象

免疫扩散沉淀:血型检查:亲和沉淀(Affinityprecipitation)

生物亲和相互作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术。一次作用亲和沉淀

水溶性化合物分子上偶联有两个或两个以上的亲和配基，形成双配基/或多配基(polyligand)。双或多配基可与含有两上以上亲和结合部位的多价蛋白质)产生和交联，形成交联网络而沉淀。这

与抗原-抗体的沉淀作用相似.当配基与蛋白质的亲和结合部位的效价比为1时沉淀率最高.一次亲和沉淀的应用1stin1983,利用bis-NAD从牛心组织抽提液中纯化了LDH，收率为90%，纯化倍数达48。但NAD价格较高，且易生物降解，难于实现大规模应用。2nd1983年后，人们开始研究利用三嗪色素为配基的一次作用亲和沉淀法，其中的代表性工作是利用ProconBlueH-B的类似物制备双配基，一次作用亲和沉淀化免肌LDH，收率达97%，纯度达电泳纯.5 亲和沉淀存在问题1stNAD价格较高，且易生物降解，难于实现大规模应用;2nd

一次作用亲和沉淀虽然简单，但仅适用于多价、特别是4价以上的蛋白质，要求配基与目标分子的亲和结合常数较高，沉淀条件难于掌握，3rd

沉淀的目标分子与双配基的分离需要透析或凝胶过滤等难于大规模应用的附加工具，实用上存在较大难度。解决办法二次作用亲和沉淀

可溶性结合(一次沉淀)场致沉淀(二次沉淀)离心洗脱目标分子5 亲和沉淀例1:胰蛋白酶纯化 苄脒基为胰蛋白酶的亲和配基，而苯甲酸基为pH敏感基团，影响聚合物的溶解度。该聚合物可溶解于pH>6的水溶液，但当pH<5时即可发生完全的沉淀。 将该聚合物加入到pH8.0的牛胰抽提液中，充分混合后加酸至pH4.0，则聚合物-胰蛋白质酶复合物沉淀。离心回收沉淀并用pH为4.0的水溶液清洗后，再加酸至pH2.0，即可洗脱回收胰蛋白酶。利用该方法纯化牛胰蛋白酶的收率为76%，纯度提高5.4倍，达92%

5 亲和沉淀例2聚合脂质体特性

二十五-10，12-二炔-1-醇磷脂乙醇胺为含有共轭二炔结构单元的双亲性化合物，其水悬浮液在超声波处理下形成0.1~0.2um的球形液泡状磷脂双分子膜，即脂质体(liposome，见图)，表面为亲水性乙醇胺基团。该脂质体溶液在紫外线照射下可发生聚合反应，形成聚合脂质体(polymerizedliposome，PLS)。 向PLS溶液加入NaCl，当NaCl浓度超过0.17mol/dm3时，在渗透压作