生物技术药品分析方法研究现状

PAGE1生物技术药品分析方法研究现状生物制药包括通过直接分离和纯化生物获得的生化药物，以及通过基因重组技术或其他生物技术开发的生物技术药物和生物制品。由于生物制药具有毒性低，副作用小，易吸收，以及多种生物活性和功能，因此在疾病预防，诊断和治疗方面具有突出的作用。随着人们对生命和身体健康的关注度的提高，生物制药的研究和开发不断增加，生物制药的质量得到控制，药物分析和检测技术也越来越受到关注。本文将分析和比较生物制药鉴定，测试和含量测定方法，并讨论近年来新方法，新技术和生物技术的进展和应用前景。一、生物药物分析方法生物制药分析主要包括化学方法，仪器分析方法和生物测定。1、化学方法化学方法可分为重量法和滴定法两种。重量法是通过称取一定重量的供试品，根据待测物经处理后分离出的与待测组相关的单质或化合物的重量，计算出该物质在供试品中含量的定量方法。而滴定法是实验室中用来对药物进行滴定分析的一种常用方法。目前，氨基酸类药物和糖类药物多应用滴定法进行含量测定。用化学方法对药物进行含量测定的优点是准确度较高，缺点是操作相对复杂，耗时较长，不利于实现自动化。2、仪器分析方法仪器分析方法用于高灵敏度痕量和痕量分析。主要包括光学法，电化学法，色谱法，电泳法，酶法，免疫分析法。（1）光学法通常用于生物药物分析的光学分析方法包括紫外/可见分光光度法，荧光法，红外吸收分光光度法，核磁共振法和质谱法。紫外/可见分光光度法：主要使用一组特定的生物聚合物吸收特定波长的光，或者特定的特殊基团与特定的化学试剂反应形成稳定的颜色，以吸收光的波长和强度为特征。并进行定量分析。物质。紫外/可见分光光度法因其设备简单，成本低，操作简单，易于涂抹而广泛应用于药物分析。测量的药物包括蛋白质多肽类、维生素类酶类、抗生素类、和卟啉类。然而，UV/Vis分光光度法的灵敏度不高，通常为10-4至10-7g/mL。荧光：在吸收能量，定性和定量分析物质后，使用特定波长发出特定波长的特定基团。近年来，使镧系元素光敏化的方法已广泛用于氨基酸，肽，蛋白质，核酸，核苷酸，脱氧核苷酸等的分析和药代动力学。荧光是灵敏，准确，选择性的，并且具有许多荧光特征参数。动态线性范围宽，灵敏度比分光光度法高2到4个数量级。敏感和准确的药物测试具有显着的优势。激光诱导荧光光谱的灵敏度已达到10-22g，可以检测单个分子和癌症的早期诊断。荧光法作为一种结合其他技术的高灵敏度分析方法具有更广阔的发展前景。红外光谱主要用于鉴定生物制药和分析中国药典中的有效成分。近红外光谱是目前红外分析的热点。大光谱信息，出色的稳定性和重现性，无需样品制备。没有化学废物污染或其他好处。在制药生产过程中，产品质量可以在整个生产周期中进行监控，但21世纪具有极好的应用前景。核磁共振光谱法是确定生物聚合物结构的有效方法。二维和三维核磁共振光谱应用于生物技术中蛋白质的三维结构分析。质谱法用于确定基因工程药物多肽，蛋白质和核酸的分子量和结构和序列。（2）色谱法色谱法是使用物理或物理化学性质分离和分析混合物的方法。薄层色谱是药物色谱领域的关键领域之一，这是一种定性和半定量方法，在自动化，分辨率和再现性方面不如气体和高效液相色谱法。薄层色谱主要用于药物的鉴定和杂质检测，如氨基酸药物（丝氨酸，亮氨酸，甘氨酸），酶（抑肽酶），蛋白质肽（bac细菌），萜类化合物（硫唑嘌呤）等。近年来，薄层色谱技术引入了重要的流动技术，可以再现薄层，为标准化，测量和自动化带来显着改进，包括自动点样设备，自动可编程多扩展设备和薄层扫描仪等应用，准确性得到了很大提高。气相色谱（GC）：气相色谱是一种常用的分析工具，用于含有挥发性成分的药物。在美国药典中检测诸如氨基酸的药物中的有机挥发性杂质是通过气相色谱法进行的。人们越来越关注残留在药物中的有机溶剂的毒性和致癌作用。用于测量药物中残留有机溶剂的气相色谱法也是一个显着的研究方向。GC-MS-SIM可用于测量药物浓度在10-9和10-12g/mL之间的体液样本。这在药物分析和体内药代动力学研究中具有重要的优点。高效液相色谱（HPLC）：HPLC具有高压，高速，高效和高灵敏度。它在生物制药鉴定，检测和内容分析中发挥着重要作用。衍生化技术的发展提高了测试物质的检测特性，提高了检测灵敏度。HPLC广泛用于氨基酸分析。HPLC也是蛋白质结构和纯度分析，英国药典和美国药典胰岛素的重要工具。通过HPLC方法鉴定相关蛋白质和滴度测量和极限测定。HPLC仅用于鉴定中国药典。对于类固醇药物甲氨蝶呤，叶酸和糖，HPLC用于内容分析。近年来，使用蒸发光散射检测器的检测器的发展扩展了对不吸收近紫外光的药物的分析。二极管阵列和荧光检测器应用提供了灵敏，快速和有效的方法。HPLC用蒸发光散射检测器直接检测衍生的氨基酸。分离和定量HPLC检测，检测限达到ng水平，回收率为94％。液相色谱和质谱越来越多地用于生物聚合物，体内药物代谢和临床药物测试。多维色谱LC-LC-MS，LC-LC-LC-LC-MS-MS等用于药物和蛋白质。肽结构测定和整体操作的完全自动化是21世纪色谱分析的发展方向之一。由于样品和流动相的消耗，微柱液相色谱显着降低了检测灵敏度，具有广阔的发展前景。超临界流体色谱（SFC）：用于分析超临界流体作为流动相的色谱技术。适用于低热稳定性，高极性和低挥发性的药物分析。它是补充GC和HPLC的重要技术。对于激素，抗生素和成瘾药物的分析，SFC仅使用CO2作为物质，例如流动相分离结构，并用于测量含有多个极性基团的分子组的尿液中的咖啡因和激素，在分析分子量高达440的抗菌素时不需要衍生化，可以直接注入样品中。使用诸如Bagman的SFC研究了一系列光选择性抗蚀剂的分离和分析。基于分子模型，提出了手性识别机制。超临界流体色谱是一种环境友好的分析方法，使用很少或不使用有机溶剂。（3）电泳法电泳法是基于物理和化学分离分析的基本方法，以及生物材料分离的常规分析方法。醋酸纤维薄膜电泳用于常规血清蛋白、脂蛋白的分离和定量测定；聚丙稀酰胺凝胶电泳用于胰岛素有关蛋白质的检查、基因工程药物DNA的分离回收；琼脂糖凝胶电泳具有较大的凝胶孔径，特别适合于分离和鉴别核酸和核蛋白。高效毛细管电泳（HPCE）是近年来发展迅速的新型分离分析方法，在生物大分子的分析方面具有许多优势。根据分离模式分为：毛细管区带电泳（CZE）基于各被分离物质的净电荷与质量比之间的差异，不同离子按各自表面电荷密度的差异，以不同的速度在电解质中移动而致分离。适用于蛋白质、氨基酸、肽、对映体的分析，胶束电动毛细管色谱（MECC）通过将离子表面活性剂加入电解质溶液，形成胶束，使溶质在胶束相和水相之间分配，将分配与电动相结合，不仅能分离离子型物质，也能分离电中性物质；毛细管等电聚焦电泳（CIEF）将传统的等电聚焦过程移到毛细管内进行，多用于蛋白质，肽类物质的分析。毛细管凝胶电泳(CGE)是以凝胶作支持物进行的区带电泳可分离测定蛋白质和DNA等大分子化合物。毛细管电色谱(CEC)，多用于水溶性差的物质和水中难进行反应的物质的分析。高效毛细管电泳兼有电泳和色谱技术的双重优点，对基因工程药物的分析具有高效、低耗、快速、灵敏等特点，随着各种不同的预浓缩技术、堆积技术、场放大技术、固相预柱等技术以及新分离模式毛细管电色谱等的应用，仪器的不断改进，高效毛细管电泳将成为生物药物分析的重要工具。（4）电化学法电化学法是利用物质电化学性质根据电参量的大小确定待测物含量的分析方法。电位滴定法仍是氨基酸和嘌啉类药物的常用分析方法。目前微电极、超微电极、化学修饰电极的研究和应用是电化学分析领域中较为活跃的研究方向，如用聚吲哚乙酸修饰电极测定肾上腺素等。电化学检测器因灵敏度高，选择性好，应用于毛细管电泳和微柱液相色谱。（5）酶法分析利用酶试剂作为工具测定物质量的方法。酶法分析具有专属性强、灵敏度高的优点，与其它紫外、荧光、电化学或免疫方法联用可用于酶的活性分析以及与酶作用的底物或产物的分析以及抗体药物的效价测定。（6）免疫分析免疫分析方法是以特异性抗原－抗体的反应为基础的分析方法。免疫分析技术和放射性核素示踪技术、酶促反应或荧光分析等高灵敏度的分析技术相结合，具有高特异性和高灵敏度的特点，特别适合测定复杂体系中的微量组分，以及药物生产中发酵液或细胞培养液中有效成分的快速测定。如酶联免疫吸附法(ELISA)用于基因工程药品中微量致敏性杂质青霉噻唑蛋白的测定，胰岛素有关蛋白的检查等。免疫分析技术与色谱的联用，利用色谱技术对药物、激素等分子间微小差别的高识别性，可提高免疫分析的选择性与灵敏度。3、生物检定法利用药物对生物体或离体器官所起的生物活性作用的强弱而进行定量分析的一种方法，可用于药物的杂质检查、有害物的毒性测定和药物的效价测定。我国药典（1995）对肝素、绒促性素、缩宫素、胰岛素等均采用生物检定法进行效价的测定。生物检定法一般与药物的活性、药效密切相关，结果较为直观，但使用动物量较多，实验操作繁琐，影响因素多，精密度差，现正逐步被理化方法所取代。二、新方法和新技术应用最近几年,单克隆抗体免疫分析技术及基因分析技术等现代生物技术应用于生物药物的分析,大大提高了方法的检测限度和灵敏度。如用基因杂交技术,可以分析药品中1PG水平的外源DNA,从而保证了用药的安全可靠。随着生物药物研究的不断深入,分析技术也在不断更新,高效毛细管电泳等现代分析技术的应用更加广泛。1、高效毛细管电泳(HPCE)随着任技术的不断发展,逐渐出现了非水毛细管电泳(NACE)、毛细管陈列电泳(CAE)等分支。HPLC是一种高效的分离分析方法,但HPCE的理论塔板数比HPLC高1-2个数量级,分离效果高2-3倍。任的灵敏度很高,所需样品极少,分析时间短,只需少量缓冲液。从分离机理上看,CE和RP-HPI无是互补的两项技术。HPCE用于蛋白质类生物药物的分离,分离效果好且具有更高的自动化程度并使样品分析微量化。亲和毛细管电泳(ACE)既可用于药物手性体的分离,也可用于药物筛选。2、生物传感器生物传感器(Biosensors)又称生物电极,现己开发出如酶传感器、免疫传感器等多种,利用发光反应的发光免疫传感器正在开发和试验中。该分析技术已在生物药物分析中应用的有应用特异性反应的测定、应用生物催化反应的测定等。3、二维核磁共振谱(2D-NMR)利用2D-NM叹技术,结合计算机模拟,可以测定生物大分子在溶液中的三维空间结构、研究蛋白质折叠机制及动力学过程、酶催化过程、蛋白质和核酸的相互作用、药物同受体的相互作用等。近年来ZD-NMR还用于研究系列定位突变体的结构和功能变化等。4、基质辅助激光解吸离子化质谱(MALDI)20世纪80年代末期,MALDI作为一种新的质谱软电离技术,解决了非挥发性热不稳定的生物大分子的质谱离子化问题,使质谱法伍侣)在测定生物大分子方面成为最有发展前途的工具之一。MALDI技术不仅能在低于10-12mol的样品条件下和复杂混合物中准确测定大分子化合物,而且与生物化学方法结合,通过对酶解或化学降解产物的质谱分析,提供结构信息,确证多肤与蛋白质等的一级结构;随着研究的不断深入,MALDI-MS在多肤与蛋白质、低聚核昔酸、寡糖、糖结合物及合成高分子等方面获得了广泛应用,其灵敏度和测量准确度远高于常规的生化方法。5、新色谱分析法主要的有超压薄层色谱法(OPLC)、胶束色谱（MC）及微柱液相色谱等。微柱液相色谱很容易和其它仪器一起使用,在多方面得到应用,但目前主要应用于生物分析、神经科学和肤及蛋白质的分析。生物样品和肤及蛋白质的分析大多把微柱液相色谱和质谱甚至与串联质谱一起使用。三、发展趋势目前,国外对生物技术药物的分析,由于其来源的特殊性、复杂性以及异军突起的惊人速度,到目前为止,还没有形成一种较为理想的分析方法,但主要的分析方法有酶分析法、电泳分析法、免疫分析法等近20种。而体内药物分析研究,趋向于采用在线的联用微透析分析技术,如在线微透析一毛细管电泳系统(on-lineMD/CE)、液相色谱一质谱(LC/MS)联用等。我国在实现了“八五”和“九五”期间的基础研究发展战略目标后,生物药物分析学科整体水平较以往有长足的进步,用于生物药物分析的现代技术和方法日益增多,所用仪器类型日趋先进。尤其是色谱及其各种联用分析技术的应用在生物药物分析中所占比例愈来愈大,使常规生物药物分析方法更加准确、简便和自动化;对生物药物的体内分析方法更加趋向于灵敏、微量、专属和快速;应用研究水平发展迅速。目前,高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、免疫分析法已成为体内药物分析的主要手段,与世界先进水平相近。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)对大分子药物特别是当前基因工程药物的应用,迅速有效。从近年来生物药物分析的研究报道来看，HPLC已经成为大部分的生物药物的常规分析方法，而CE因其本身不可比拟的优势，在生物药物分析方面的应用日益增多，是未来生物药物发展的新趋势。目前，生物药物分析与检测技术仍属处于发展中的新技术，在实践操作中仍存在诸多问题，需要不断地进行完善和改进，有待于进一步开发和探索。从近年来关于生物药物分析的研究报道中可以看出，高效液相色谱法（HPLC）在生物药物分析等方面的应用日益增多，已逐渐成为大部分生物药物的常规检测分析方法。生物药物分析与检测技术的发展趋势主要有以下几个方面：①通过应用基因工程技术，制取天然来源较少或过去难以获得的生物活性物质。②应用蛋白质工程技术研制新型蛋白质类药物。③通过应用生物工程技术，制取大分子物质活性片段。④发展新剂型大分子药物。四、结论近年来，随着人