流式细胞术对PNH检测的应用价值

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目录摘要 ⅠAbstract Ⅱ前言 11.材料与方法 21.1材料 21.1.1仪器设备 21.1.2试剂 21.2方法 31.2.1研究对象 31.2.2流式细胞仪检测步骤 41.2.3统计学分析 52.实验结果 62.1CD55、CD59检测结果 72.2流式结果图 93.讨论 124.结论 13参考文献 14致谢 16

摘要目的：探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)通过利用流式细胞术检测的方法来诊断的临床应用价值，从而为确诊并治疗PNH寻求更为有效的实验方案。方法：选取2015-2019年在309医院就诊的不同类型的贫血患者41例和血常规正常的健康人群18例，在所研究的41例贫血患者中包括PNH患者8例、再生障碍性贫血(AA)患者7例、骨髓增生异常综合征(MDS)患者15例、缺铁性贫血患者5例和巨幼红细胞性贫血患者6例，抽取这59例研究对象的外周血并采用流式细胞术检测其对应红细胞（WBC）和白细胞（RBC）细胞膜上CD55和CD59的阳性表达情况。结果：流式细胞仪上机检测结果显示，8例PNH患者的WBC和RBC细胞膜上CD55和CD59分子的阳性表达率均明显低于健康对照组和其他类型的贫血患者，差异均有统计学意义（P<0.05），具体来说，对照组的18例健康人群的外周血细胞膜上CD55+、CD59+的检测结果均>95%，5例缺铁性贫血(IDA)患者、6例巨幼红细胞性贫血患者、15例骨髓增生异常综合征(MDS)患者和6例再生障碍性贫血(AA)患者的外周血细胞膜上CD55+、CD59+的检测结果也均>95%，但是其中有1例AA患者的外周血细胞膜上的检测结果CD55+<90%、而CD59+则在正常范围内，8例PNH患者外周血细胞膜上CD55+的检测结果在20.5%～74.50%,CD59+的检测结果在46.80%～86.50%。结论：通过采用流式细胞仪的技术和抗CD55、CD59的单克隆抗体可以直接检测PNH患者的细胞膜上有缺陷的异常细胞，其优势是特异性强，快速，准确，能够有效帮助诊断PNH，对临床诊断具有重要意义。关键词流式细胞术；阵发性睡眠性血红蛋白尿症；CD55；CD59AbstractObjective:Toexploretheclinicalvalueofthediagnosisofparoxysmalnocturnalhemoglobinuria(PNH)byflowcytometry,soastofindamoreeffectiveexperimentalschemeforthediagnosisandtreatmentofPNH.Methods:41patientswithdifferenttypesofanemiaand18healthypeoplewithnormalbloodroutinewereselectedfrom309hospitalfrom2015to2019.41Theperipheralbloodsamplesofthe59patientswerecollectedandtheexpressionofCD55andCD59onthecorrespondingredbloodcell(WBC)andwhitebloodcell(RBC)membranewasdetectedbyflowcytometry.Results:theexpressionofCD55+andCD59+onWBCandRBCcellmembraneof8PNHpatientswassignificantlylowerthanthatofhealthycontrolgroupandothertypesofanemiapatients,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05),specifically,CD55+andCD59onperipheralbloodcellmembraneof18healthypeopleincontrolgroup+TheresultsofCD55+andCD59+ontheperipheralbloodcellmembraneof5IDApatients,6megaloblasticanemiapatients,15MDSpatientsand6AApatientswereallover95%.ButtheresultsofCD55+andCD59+ontheperipheralbloodcellmembraneof1AApatientwerelessthan90%,andCD59+wereinthenormalrange,8PNHpatientswereinthenormalrangeTheresultsofCD55+andCD59+were20.5%-74.50%and46.80%-86.50%respectively.Conclusion:byusingflowcytometryandmonoclonalantibodiesagainstCD55andCD59,wecandirectlydetectthedefectiveabnormalcellsonthecellmembraneofpatientswithPNH.Itsadvantagesarestrongspecificity,fast,accurate,andcaneffectivelyhelpdiagnosePNH,whichisofgreatsignificanceforclinicaldiagnosis.Keywords:flowcytometry;paroxysmalnocturnalhemoglobinuria;CD55;CD59前言阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是由造血干细胞PIG-A基因突变引起的一种后天获得性的细胞膜缺陷的溶血性贫血，主要是细胞膜上的衰变加速因子(DAF)和同种限制因子(HRF)缺陷，以红细胞更明显，由于一种或几种造血干细胞中染色体xp22，1上的PIG-A基因突变使糖基磷脂酰肌醇（GPI）I的合成受阻，导致由GPI锚链在细胞膜上的一组膜蛋白丢失，其突变部位遍布在一些内含子之中以及第2～6外显子整个编码区的多个位置，没有突变热点。临床上可有血红蛋白尿发作，常在睡眠后表现酱油色或葡萄酒色尿，还会伴有全血细胞减少、感染与出血、血栓形成、黄疸和肝脾轻度肿大等表现。为了探讨流式细胞术用于检测外周血细胞膜上CD55、CD59中的临床意义和应用价值,建立流式细胞术检测阵发性睡眠性血红蛋白尿症的标准方法，展开了本课题的研究。各类贫血性疾病与PNH的相关性：再障，与PNH可以相互转化或同时兼有，以上这些情况统称PNH-再障综合征两者的主要鉴别点是PNH骨髓增生活跃，而再障骨髓增生减低；缺铁性贫血，在补铁后可以使贫血得到彻底纠正，而PNH因长期反复血红蛋白尿而失铁，可伴有缺铁现象，但此种情况补铁也无法纠正；巨幼细胞贫血，因溶血促使骨髓代偿性过度增生而导致此病，可以通过补充叶酸后彻底纠正，而由PNH所致引起巨幼贫血的患者却不能因补充叶酸而得到纠正；骨髓增生异常综合征，个别PNH患者骨髓可看到病态造血现象，有些学者甚至将PNH也视为MDS的一种，极个别患者可完全变为MDS，极少部分MDS患者也会偶尔发生典型的血红蛋白尿或PNH的表现，可具有类似PNH的异常血细胞，PNH起病缓慢，呈慢性过程且多变，以贫血和出血为首发症状者占绝大部分，以血红蛋白尿起病者占较少部分。病态血细胞都来自同一克隆，之前主要是通过溶血试验测定红细胞对补体的敏感度从而诊断PNH，即实验室检查如酸化血清溶血试验(Ham试验)、蛇毒因子溶血试验、糖水溶血试验、补体溶血敏感试验、尿潜血或尿含铁血黄素试验，其诊断依据是以上实验中有两项表现为阳性，或者其中一项为阳性但是应保证操作正规且伴有溶血现象，所以以上几种传统试验敏感性低、特异性差。后来流式细胞术检测法因高敏感度和准确性被逐渐运用于临床诊断，而且通过查阅文献研究表明CD55和CD59对补体调节蛋白有非常重要的作用，在PNH、AA、MDS、缺铁性贫血和巨幼红细胞性贫血患者的细胞上均有不同程度的改型，不同类型的贫血患者其红细胞的CD59/FS的表现特征不同，研究发现所有PNH患者的外周血异常细胞均缺乏某些细胞膜表面蛋白，例如衰变加速因子（CD55）、膜攻击复合物抑制因子（CD59），而且PNH患者体内的异常细胞和所缺乏的蛋白都是由于一种糖脂类复合体，此类复合体是细胞膜表面的缺乏蛋白在生理情况可以准确锚定在细胞膜表面的关键物，而PNH患者体内的这类糖脂类复合物的生物合成通路中存在着酶蛋白基因突变，致使酶的活力下降且合成受阻，从而导致其锚定蛋白不能有效地联结在细胞膜表面，其中CD55通过调节C3和C5补体蛋白转化酶调控早期补体级联反应，能增加转化酶复合物解离或衰变的速度，CD59可以阻止补体C9掺入C5b-8复合物中，抑制补体活化过程中C8和C9之间的相互作用，从而抑制补体终末攻击反应。外周血细胞膜表面这类蛋白的缺陷能够通过流式细胞术检测从而可以准确测定出异常细胞，而且近年来CD55、CD59抗原的检测大大提高了PNH克隆的检出率，细胞膜表面的CD55+、CD59+的表达率不但使典型PNH的诊断更加可靠，同时也可使一些亚临床型PNH例如无典型血红蛋白尿发作的PNH得到诊断。因此，本次课题是借助中国人民解放军总医院第八医学中心器官移植研究室流式平台，使用BDFACSCantoTM多参数流式细胞仪对送检的外周血标本进行PNH检测，即所有健康对照组和各种类型的贫血患者均抽取其外周血，采用流式细胞仪对标本细胞膜上的补体蛋白CD55和CD59分子进行检测，本实验以研究红细胞和白细胞膜上的补体分子为主，通过利用流式细胞术对PNH患者进行检测诊断，探讨是否可以有效提高临床诊断率，从而降低误诊率和漏诊率，以便实现对病情的有效控制，增强治疗效果，将此类方法进行普遍临床推广与应用。1材料和方法1.1材料1.1.1仪器设备名称公司流式细胞仪美国BD公司漩涡振荡器美国Thermo公司加样枪(1000ul、200u1、10ul)德国Eppendorf公司台式离心机TDZ5-WS湘仪公司流式专用试管美国BD公司EP管美国BD公司1.1.2试剂：名称公司CD55-FITC,、CD59-PE美国BD公司溶血素美国BD公司鞘液美国BD公司仪器校正微珠美国BD公司注释：固定液：用PBS液配置4％多聚甲醛，加热，用玻璃棒搅拌至完全溶解，然后调整pH为7.2～7.4，置于4℃下保存。1.2方法1.2.1研究对象选取2015-2019年在中国人民解放军总医院第八医学中心做过PNH检测的就诊病人进行回顾性研究，其中包括18例健康对照者、PNH患者8例、再生障碍性贫血(AA)患者7例、骨髓增生异常综合征(MDS)患者15例、5例缺铁性贫血患者和巨幼红细胞性贫血患者6例。1.2.2实验步骤抽取研究人群的EDTA抗凝全血，即采用EDTA抗凝血真空血管收集观察对象2 ml外周静脉血，针对其外周血的成熟红细胞和白细胞细胞膜表面的分化抗原CD55、CD59做分子表达的检测，室温放置，且需在24h之内处理、检测。处理步骤如下：1.处理标本每个血样准备4支流式试管，分别标记为W1、W2、R1、R2。用1mlPBS稀释红细胞200倍，即5ul全血+1mlPBS，混匀备用（采用正向加血，加血时需擦拭枪头）。于四支准备好的试管中加入相应抗体。试管编号抗体R1空白对照R2CD55、CD59W1CD45W2CD55、CD59、CD45注：CD55、CD59各6ul，CD45各3ul。于R1、R2试管中分别加入100ul稀释血，同时于W1、W2试管中分别加入100ul全血（采用正向加血，且同一标本的四支试管加入血样时不用擦拭枪头）。将四支试管分别混匀、避光，室温孵育15min。取出孵育好的血样管，于W1、W2两支试管中分别加入2ml溶血素，R1、R2两支试管中分别加入2mlPBS。将四支试管分别混匀、避光，孵育10min。取出四支试管，离心1500r、5min，离心前需将每支试管混匀。弃去上清液，于四支试管中分别加入2mlPBS溶液，混匀后离心，1500r、5min。弃去上清液，避光2h。注：如不能立即上机，则在上述步骤所得标本中加入1ml固定液，4℃保存。2.上机（1）打开BDFACSDiva软件，选择PNH文件夹，建立标本各自对应的新文件夹。（2）将做好的外周血红细胞、白细胞血样通过与荧光标记的CD55、CD59单克隆抗体作用，进行其阳性表达的检测。（3）开始依次将样本管上机。编号操作R1P1、20000evt、Medium→AcquireData→RecordData→RemoveR2P1、20000evt、Medium→AcquireData→RecordData→RemoveW1P3、10000evt、Medium→AcquireData→RecordData→RemoveW2P3、10000evt、Medium→AcquireData→RecordData→Remove（4）分析圈选目标门编号操作R1圈选出红细胞所在的区域门，标为P1R2圈选出红细胞所在的区域门，标为P1，将P1门下的CD55、CD59的数值删除，并将R1试管P1下对应的CD55、CD59的数值复制粘贴到R2试管的P1区域W1P1→显示Allevents,调节横纵坐标P2→显示P1，圈选区域门，调节横纵坐标P3→显示P2，圈选区域门，调节横纵坐标W2同W1试管，并将P3下的CD55、CD59的数值删除，将W1试管P1下对应的CD55、CD59的数值复制粘贴到W2试管的P1区域（5）做红细胞分析时，选取单色分析，因为多色分析时需要考虑红细胞聚集造成的影响与误差。（6）做白细胞分析时，选取三色分析，即非GPI相关蛋白的系列抗原/SSC设门的方法。（7）保存数据，分类汇总。3.图示说明每例患者的流式上机实验结果图一共分为两张，每张均包括两支试管的结果图，即两支同种细胞不同试剂的试管进行流式荧光上机检测的数据结果。第一张图反映的是红细胞的结果，预先采用一个正常健康人的血样，要求该标本所有红细胞上都表达的是非GPI相关的糖蛋白抗原，并根据红细胞的物理特性，采取FSC/SSC设门（FSC即前向散射光、SSC即侧向散射光），计算所选标本的阳性百分率，以判断FSC/SSC设门的纯度。红细胞包括R1、R2两支试管的样本，其中R1为空白对照，R2为实验组即加有CD55和CD59抗原的红细胞。第二张图反映的是白细胞的结果，同红细胞一样预先采用一个正常人的血样，采取系列抗原/SSC设门，由于粒细胞重度缺乏的患者仅单独使用FSC/SSC设门很难找到确切的靶细胞群，所以需要使用非GPI锚蛋白/SSC设门的方法，进行三色分析检测，同时使用SSC/非GPI相关蛋白的系列抗原设定白细胞门，另外两个荧光通道用来检测GPI相关抗原。白细胞包括W1、W2两支试管的样本，其中W1为对照组只加有CD45抗原，W2为实验组即加有CD45、CD55、CD59三种抗原的白细胞。1.2.3统计学处理：采用SPSS统计学软件进行数据分析，P＜0.05表示具有统计学意义。2结果2.1数据统计18例健康对照组和41例贫血患者的外周血细胞细胞膜上CD55+和CD59+的测定结果见附表2.1.1。具体来说，18例正常人外周血红细胞和白细胞细胞膜上CD55、CD59分子的阳性表达率的百分比均>95％；而8例PNH患者红细胞CD55+的百分比检测结果在29.6%～74.5%、CD59+检测结果在42.1%～78.5%，白细胞CD55+检测结果在20.5%～62.5%、CD59+在35.6%～86.5%；7例AA患者中CD55+红细胞为41.89％的有1例，其余结果均>93.2％,CD55+白细胞检测结果>95％的有6例，剩下1例患者的白细胞CD55+表达率为89.5%，而所有AA患者的红细胞和白细胞的CD59+检测结果均>90％；15例MDS患者的外周血细胞细胞膜上CD55+和CD59+检测结果也均>90％；其余的5例缺铁性贫血和6例巨幼细胞性贫血患者的外周血细胞膜上的CD55和CD59分子检测结果的阳性表达率均在正常范围内。2.2数据统计正常对照组和各类贫血患者外周血CD55+和CD59+细胞测定结果（%）表2.1.1组别WBCCD55+RBCCD55+WBCCD59+RBCCD59+PNHMDSAA缺铁性贫血巨幼贫血健康组43.499.785.699.999.899.960.291.289.795.698.398.255.698.698.698.299.399.458.399.597.798.299.399.4注：表格中为各组数据的均值，数值以百分比表示。2.4结果分析就流式细胞仪的检测结果显示，所有的PNH患者组外周血细胞膜上CD55和CD59分子的阳性百分率与健康对照组比较有显著性差异，其余33例非PNH贫血类型的患者红细胞和白细胞膜上CD55+、CD59+的百分率与对照组比较无显著性差异。具体来说，18例健康对照组的检测结果中红细胞和白细胞膜上的CD55+和CD59+表达均大于95%（见图2.4.1）；8例PNH患者细胞膜上CD55+、CD59+的检测结果在20.5%～86.5%（见图2.4.2）；7例AA患者的CD59+检测结果均>90％，但是红细胞膜上的CD55+表达率为41.89％的有1例，其余结果均>93.2％,白细胞膜上CD55+表达率为89.5%有1例，其余6例结果均>95％（见图2.4.3）；MDS组的15例患者的外周血细胞膜上CD55+、CD59+的检测结果均>90%（见图2.4.4）；5例缺铁性贫血和6例巨幼贫血患者的红细胞和白细胞CD55+、CD59+的检测结果都在正常范围内均>95%（分别见图2.4.5和图2.4.6）。图2.4.1图2.4.2图2.4.3图2.4.4图2.4.5图2.4.63讨论贫血会严重影响患者的身体健康和生活质量，阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、再生障碍性贫血(AA)、骨髓增生异常综合征(MDS)、缺铁性贫血(IDA)以及巨幼红细胞性贫血等均是常见的贫血类型，因此早日诊断、对症治疗就变的尤为重要。近年来，人们不断研究PNH的发病机制并对其做了进一步深入的了解。目前认为PNH主要是造血干细胞基因突变和自身免疫缺陷，PNH患者细胞膜表面缺乏一组糖肌醇磷脂(GPI)连接蛋白，GPI锚连蛋白能抑制血细胞表面补体的激活，而PIGA编码的蛋白质和GPI的生物合成相关，所以磷脂酰肌醇聚糖A（PIGA）是PNH患者溶血的分子病因，即PIGA的突变能直接影响GPI的合成，相关补体中最重要的是CD55和CD59两种分子，所以PNH患者的细胞膜缺乏CD55和CD59两种膜蛋白，也是红细胞对补体的溶血作用敏感性增强的主要原因，也因此导致CD55、CD59对膜表面补体活化的调控作用减弱,最终导致患者发生血管内溶血、骨髓衰竭、贫血、血栓形成、正常造血功能减低及血红蛋白尿等临床症状。传统的PNH诊断试验是通过抽取患者的去纤维蛋白血做酸化溶血试验（Ham试验）和蔗糖溶血试验，或者采取晨尿进行尿含铁血黄素（Rous）试验，从而证明出存在有对补体敏感的红细胞，在之前的临床诊断中往往以Ham试验阳性作为PNH的确诊试验。而且根据查阅相关文献资料了解到，蔗糖溶血试验最为敏感，但该试验会存在一定的假阳性率，但本试验敏感性高，PNH患者经检测约88%阳性，所以可以将其作为最好的初筛试验；Ham试验具有较强的特异性，PNH患者的病态红细胞在pH为6.4的条件下容易被替代途径激活的补体溶破，而正常红细胞则不会被溶破，但也有个别的PNH患者在进行Ham试验时会出现阴性反应，所以不能就Ham试验的阴性结果而否定诊断，还需要结合其他诊断方法来进行判断；Rous试验阳性仅仅能表明体内存在有慢性溶血，但是PNH是红细胞膜获得性缺陷血管内溶血的疾病，在溶血初期可呈阴性，也不能直接确诊。所以这些传统实验都存在不同程度的假阴性或假阳性，不利于PNH的准确诊断。随着研究发现利用流式细胞术检测PNH不仅特异性强，而且快速、准确，大大提高了检测效率，需要注意的是在采用外周血做PNH分析时要求对患者的红细胞和白细胞进行筛查，而且骨髓中的CD55、CD59细胞检测更为准确，所以为了快速、有效地提高其诊断的准确性，PNH早期患者和重度溶血患者可以通过检测骨髓CD55、CD59。其中，标本选用抗凝外周血时，CD55、CD59分子检测报告显示的是红系及粒系FSC/SSC设门图；标本选用骨髓血细胞时，CD55、CD59分子检测报告显示的是血细胞CD45/SSC设门图。本次实验结果中显示，PNH组患者的红细胞和白细胞膜上CD55、CD59的阳性表达率检测结果明显低于健康对照组和其他贫血患者小组；再生障碍性贫血患者、骨髓增生异常综合征患者、缺铁性贫血患者和巨幼贫血患者与对照组比较均无显著性差异，即这些患者的细胞膜上CD55+、CD59+的表达在正常范围之内，但需要注意的是，AA患者中有1例患者细胞膜上CD55、CD59存在一定程度的缺失，后期该例患者最终修改诊断为PNH，经查阅资料发现，再障(或骨髓增生低下)与PNH有关联，且发病有两种类型，均属于再障-PNH综合征，同时发现部分AA病人的外周血细胞中也有PNH样阴性细胞的存在，近几年在临床上也发现PNH的发生和再生障碍性贫血关系密切，绝大部分表现为再障过程中或痊愈后经过一段时间才转化为PNH，也存在极少一部分PNH患者经过一段时间后转为AA，所以AA病人也有克隆异常性造血，只是这种机制目前还不清楚，因此在治疗过程中还需注意观察疾病是否有进行性变化。本实验提示，所有健康人群的红细胞和白细胞膜上CD55、CD59分子的阳性表达百分比均>90％，而PNH患者外周血细胞膜上CD55、CD59表面抗原分子的表达明显降低，此外，有经验和研究表明同时检测CD55+、CD59+和中性粒细胞对PNH的诊断意义更大，因为红细胞的寿命一般较长且患者容易受输血的影响。4结论采用流式细胞仪通过荧光标记检测外周血红细胞和白细胞细胞膜上CD55和CD59的阳性表达，在PNH诊断中具有良好的前景应用价值。而且，要求做检测的患者提供近期输血记录，外周血和骨髓均可以做PNH克隆分析，同时检测红细胞和白细胞膜上CD55和CD59能避免严重溶血或反复输血造成的结果误差，能早期发现PNH克隆细胞，可以更加准确地诊断PNH，是目前诊断PNH最可靠、最敏感的方法，是检测PNH的金指标及PNH、AA患者的长期监测指标，也是临床鉴别诊断PNH和其他贫血性疾病的较好方法，可以为临床治疗提供有效依据，对贫血疾病临床诊断与预后具有着重要的意义和应用价值。参考文献[1]张国材，郑冬，孔庆瑜.用流式细胞术检测CD55及CD59表型对诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿的意义[J].新医学,2003,34(4):212-213.[2]楚青.流式细胞术在PNH诊断中的应用体会[J].《世界最新医学信息文摘》2019，94.[3]吴敏乐，张臣青，黄家福，曾绍毅，王丹林.阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者血细胞表面CD55和CD59的检测及临床意义[J].检验医学与临床,2013,10(7):771-772.[4]冯玉虎,夏瑞祥,王卫国.贫血患者外周血CD55、CD59检测及对阵发性睡眠性血红蛋白尿症的诊断意义[J].实用医学杂志,2015(8):1262-1265.[5]母璨，陈科，韦静.流式细胞术检测对阵发性睡眠性血红蛋白尿症的诊断价值.[J]《西部医学》2017，1587-1589,1593.[6]肖作淼，张丽琴，张荣山.PNH实验室检测项目在赣南地区综合医院开展现状调查[J].实验与检验医学,2016,34(6):788-790.[7]郑小江，廖丽娟，李春晓，陈宇锋.流式细胞术检测用于贫血患者血细胞CD55、CD59中的临床意义[J]ModDiagnTreat现代诊断与治疗，2017，Aug28，15.[8]华建媛，张凌，石庆之.流式细胞仪检测CD55和CD59表型对贫血性疾病诊断的意义[J].实用临床医学，2011，12(2)：11-13.[9]王艳，左雅蓓，王玉昭．阵发性睡眠性血红蛋白尿症的诊治[J]河北医药，2012，34（3）：430一432.[10]刘志祥，李瑞明，王晓勋.CD55和CD59检测对诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿的意义[J]中国误诊学杂志2008年11月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