差速消化法：脂肪源性内皮祖细胞分离培养与特性解析

差速消化法：脂肪源性内皮祖细胞分离培养与特性解析一、引言1.1研究背景内皮祖细胞（EndothelialProgenitorCells，EPCs）作为血管内皮细胞的前体细胞，于1997年由Asahara等首次从人外周血中成功分离并鉴定，这一发现为血管新生和组织修复机制带来了全新认识，也为相关疾病的治疗开辟了新思路。在生理或病理状态下，EPCs可从骨髓动员至外周血，归巢到缺血或损伤部位，分化为成熟的内皮细胞，参与新生血管的形成，在血管修复、组织再生等过程中发挥关键作用，为心血管疾病、缺血性疾病及组织工程等领域的治疗带来了新希望。目前，EPCs的来源主要包括骨髓、外周血和脐血等。然而，这些传统来源存在一定的局限性。骨髓穿刺获取EPCs过程痛苦，对供体损伤较大，且细胞产量有限；外周血中EPCs含量极低，分离难度大，成本高；脐血来源虽相对丰富，但受伦理限制和样本采集条件制约，应用范围受限。因此，寻找一种来源广泛、获取简便、对机体损伤小且细胞产量和活性良好的EPCs来源，成为该领域的研究热点。近年来，脂肪组织作为EPCs的潜在来源受到广泛关注。脂肪组织在人体中储量丰富，获取相对容易，通常可通过抽脂术等微创方式获得，对人体创伤较小。此外，脂肪组织中细胞成分多样，除脂肪细胞外，还包含多种干细胞和祖细胞，其中就有内皮祖细胞，且脂肪组织来源的EPCs具备较强的增殖和分化能力，在合适的培养条件下可大量扩增。这些优势使脂肪组织成为极具潜力的EPCs种子细胞来源，为解决EPCs来源不足的问题提供了新途径。尽管脂肪组织作为EPCs来源具有诸多优势，但目前国内外在脂肪源性EPCs的分离培养方法上仍存在不足。现有的分离培养方法往往操作复杂、成本高昂，需要使用昂贵的试剂和设备，且分离得到的细胞纯度和活性难以保证。例如，传统的磁珠分选法虽能获得较高纯度的EPCs，但磁珠价格昂贵，且难以完全去除，影响细胞的后续应用；利用特定细胞外基质诱导贴壁法不仅费用高，细胞纯度还受贴壁时间等因素影响，难以精确控制。此外，部分方法在细胞培养过程中使用大量动物来源血清，存在免疫排斥和病毒污染等风险，限制了其在临床治疗中的应用。因此，开发一种有效、经济、可行的从人脂肪组织中分离培养EPCs的方法，对于推动EPCs在基础研究和临床治疗中的应用具有重要意义。1.2研究目的与意义本研究旨在探索一种有效、经济且可行的利用差速消化法从人脂肪组织中分离培养脂肪源性EPCs的方法，并深入研究其生物学特性，为EPCs的基础研究提供新的技术手段和理论依据。通过优化差速消化分离培养的具体步骤和条件，如消化酶的选择与浓度确定、消化时间的精准把控、细胞接种密度的优化等，期望获得高纯度、高活性且数量充足的脂肪源性EPCs，解决现有分离培养方法存在的操作复杂、成本高昂、细胞质量不稳定等问题。从临床应用角度来看，本研究具有重大意义。脂肪源性EPCs在治疗性血管新生领域有着广阔的应用前景，可用于治疗多种缺血性疾病，如冠状动脉粥样硬化性心脏病、下肢动脉硬化闭塞症、糖尿病足等。这些缺血性疾病严重威胁人类健康，传统治疗方法存在一定局限性，而EPCs能够分化为成熟内皮细胞，参与新生血管形成，改善缺血组织的血液供应，为缺血性疾病的治疗提供了新的策略。例如，对于冠状动脉粥样硬化性心脏病患者，将脂肪源性EPCs移植到缺血心肌部位，有望促进心肌血管新生，改善心肌供血，缓解心绞痛症状，提高患者生活质量，甚至降低心肌梗死的发生风险；对于下肢动脉硬化闭塞症患者，通过局部注射或血液循环输送脂肪源性EPCs，可促使下肢缺血部位形成新的血管，减轻肢体疼痛、溃疡等症状，避免截肢风险。此外，本研究成果还能为组织工程和再生医学提供丰富的种子细胞来源。在组织工程中，构建具有良好血管化的组织和器官是实现组织修复和再生的关键，脂肪源性EPCs可与生物材料结合，构建血管化组织工程支架，用于修复骨缺损、皮肤损伤等组织缺损，促进组织再生和功能恢复。在再生医学领域，脂肪源性EPCs可参与受损组织和器官的修复与再生过程，为治疗多种难治性疾病提供新的途径和方法，推动再生医学的发展，为患者带来更多的治疗选择和康复希望。二、脂肪源性内皮祖细胞分离培养方法概述2.1内皮祖细胞来源及现状内皮祖细胞（EPCs）作为血管内皮细胞的前体细胞，在血管新生和组织修复中发挥着关键作用。其来源广泛，常见的有骨髓、外周血、脐血以及脂肪组织等。不同来源的EPCs在细胞特性、获取方式及应用前景等方面存在差异，也都面临着各自的问题。骨髓是EPCs的重要来源之一，骨髓中EPCs含量相对较高，且具有较强的增殖和分化能力。然而，获取骨髓EPCs需要进行骨髓穿刺，这一过程对供体损伤较大，会给供体带来痛苦，且骨髓穿刺获取的细胞数量有限，难以满足大规模临床应用的需求。此外，骨髓穿刺还存在感染、出血等风险，限制了其广泛应用。外周血中也存在EPCs，但含量极低，每毫升外周血中EPCs的数量仅为几个到几十个。从外周血中分离EPCs需要大量的血液样本，且分离过程复杂，成本高昂。同时，外周血EPCs的增殖能力相对较弱，在体外培养过程中容易出现老化现象，影响其治疗效果。脐血作为EPCs的来源，具有独特的优势。脐血中EPCs含量丰富，且免疫原性低，不易引起免疫排斥反应。然而，脐血的采集受到时间和地点的限制，需要在新生儿出生时及时采集，且采集量有限。此外，脐血的储存和运输也需要特殊的条件，增加了成本和难度。同时，脐血来源还受到伦理限制，在一些地区存在争议，这也限制了其大规模应用。近年来，脂肪组织作为EPCs的潜在来源受到了广泛关注。脂肪组织在人体中储量丰富，分布广泛，可通过抽脂术等微创方式轻松获取，对人体创伤极小。抽脂术是一种相对成熟的医疗技术，在局部麻醉下即可进行，手术过程中患者痛苦较小，术后恢复较快。研究表明，每克脂肪组织中可分离出数千个EPCs，细胞产量可观。脂肪组织中除了EPCs，还包含多种干细胞和祖细胞，它们之间可能存在协同作用，有助于促进EPCs的增殖和分化。国内外学者针对脂肪源性EPCs开展了大量研究，取得了一定的成果。在分离培养方法上，不断探索优化，如采用不同的酶消化组合、改进细胞筛选技术等。部分研究通过优化酶消化时间和温度，提高了EPCs的分离效率；还有研究利用新型细胞筛选技术，提高了EPCs的纯度。在应用研究方面，脂肪源性EPCs在治疗缺血性疾病、促进组织修复等领域展现出良好的效果。有临床研究将脂肪源性EPCs应用于下肢缺血患者的治疗，发现患者下肢血液循环得到明显改善，疼痛症状减轻。然而，目前脂肪源性EPCs的研究仍存在一些问题，如分离培养方法的标准化、细胞的稳定性和安全性等，需要进一步深入研究解决。二、脂肪源性内皮祖细胞分离培养方法概述2.2传统分离培养方法剖析2.2.1磁珠分离法磁珠分离法是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场作用下，与磁珠结合的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与磁珠相连而留在溶液中，从而使细胞得以分离。在脂肪源性EPCs分离中，首先需获取脂肪组织，通常通过抽脂术等方式收集。将脂肪组织剪碎后，使用胶原酶等消化酶进行消化，使其成为单细胞悬液。接着，向单细胞悬液中加入与EPCs表面特异性标志物（如CD34、CD133、VEGFR-2等）结合的磁珠。这些磁珠表面修饰有针对EPCs标志物的抗体，能够特异性地识别并结合EPCs。在一定的孵育条件下，磁珠与EPCs充分结合。随后，将混合物置于磁场中，结合了磁珠的EPCs会被吸附到磁场周围，而其他细胞则随溶液流走。通过小心移除上清液，再对吸附有EPCs的磁珠进行洗涤和洗脱，即可获得相对纯化的EPCs。磁珠分离法的显著优点是能够获得高纯度的脂肪源性EPCs。由于磁珠与EPCs表面标志物的特异性结合，能够精准地将EPCs从复杂的脂肪组织细胞混合物中分离出来，满足对细胞纯度要求较高的实验和研究需求，为深入探究EPCs的生物学特性和功能机制提供了有力支持。然而，该方法也存在一些缺点。磁珠价格昂贵，这使得实验成本大幅增加，限制了其在大规模研究和临床应用中的推广。磁珠难以完全从细胞表面去除，残留的磁珠可能会影响细胞的正常生理功能和后续实验结果。在一些细胞功能实验中，磁珠残留可能干扰细胞的信号传导通路，导致实验结果出现偏差，影响对EPCs真实特性的判断。2.2.2间充质干细胞分化诱导法间充质干细胞分化诱导法的原理是基于间充质干细胞（MSCs）具有多向分化潜能，在特定的诱导条件下，能够分化为脂肪源性EPCs。脂肪组织中含有丰富的MSCs，为该方法提供了充足的细胞来源。首先，从脂肪组织中获取MSCs。通过抽脂术获得脂肪组织后，利用酶消化法将脂肪组织消化成单细胞悬液，然后采用贴壁培养法，利用MSCs的贴壁特性，将其与其他细胞分离，经过多次传代培养，获得较为纯化的MSCs。接着，将获得的MSCs置于含有特定诱导因子的培养基中进行诱导分化。这些诱导因子通常包括血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）等。VEGF能够特异性地与MSCs表面的VEGFR-2等受体结合，激活下游的PI3K-Akt、MAPK等信号通路，促进MSCs向EPCs分化；bFGF则通过与FGFR受体结合，激活Ras-Raf-MEK-ERK等信号途径，协同VEGF等因子，调节相关基因的表达，如促进VE-cadherin、CD31等内皮细胞标志物基因的表达，抑制间充质细胞标志物基因的表达，从而推动MSCs向EPCs的分化进程。在诱导分化过程中，需要严格控制培养条件，包括温度、湿度、CO₂浓度等。通常在37℃、5%CO₂的培养箱中进行培养，每隔一定时间更换培养基，以提供细胞生长和分化所需的营养物质，同时去除代谢废物。经过一段时间的诱导培养后，通过检测细胞表面标志物（如CD34、CD133、VEGFR-2、VE-cadherin等）的表达、细胞形态变化以及功能特性（如摄取乙酰化低密度脂蛋白、结合荆豆凝集素等），来鉴定是否成功诱导分化为EPCs。然而，这种方法存在分化程度不均的问题。由于不同的MSCs对诱导因子的反应存在差异，导致最终分化得到的EPCs在功能和特性上存在较大的异质性，难以保证细胞群体的一致性和稳定性，影响实验结果的可靠性和重复性。此外，诱导过程中操作条件较难控制和重复，不同实验室或同一实验室不同批次的实验结果可能存在差异，不利于该方法的标准化和广泛应用。2.2.3特定细胞外基质诱导贴壁法特定细胞外基质诱导贴壁法是利用EPCs对某些特定细胞外基质具有较强的黏附特性来进行分离培养。首先，准备合适的细胞外基质，如纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）等。将这些细胞外基质均匀地包被在细胞培养器皿表面，形成一层具有特定生物学活性的基质层。获取脂肪组织并进行处理，通过抽脂术收集脂肪组织，剪碎后使用胶原酶等消化酶进行消化，制备成单细胞悬液。将单细胞悬液接种到包被有特定细胞外基质的培养器皿中。在适宜的培养条件下，EPCs会优先黏附到细胞外基质上，而其他细胞则可能悬浮或黏附能力较弱。经过一段时间的培养后，未贴壁的细胞可通过更换培养基被去除，从而初步富集EPCs。随着培养时间的延长，贴壁的EPCs逐渐增殖，形成细胞集落。通过进一步的传代培养和筛选，可获得相对纯化的脂肪源性EPCs。该方法虽操作相对简便，但也存在明显缺陷。细胞外基质价格较高，增加了实验成本，限制了其大规模应用。在诱导贴壁过程中，细胞纯度难以精确控制，可能会混入其他类型的贴壁细胞，影响EPCs的纯度和后续研究。使用的培养基中通常含有动物血清，存在血清污染的风险，可能引入病原体、免疫原等物质，对细胞的生长和功能产生不利影响，同时也限制了其在临床治疗中的应用。2.3差速消化法的原理及优势2.3.1差速消化法原理差速消化法的基本原理是基于不同类型细胞对胰蛋白酶等消化酶的敏感性存在差异。在脂肪组织中，包含多种细胞成分，如脂肪细胞、内皮祖细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等。胰蛋白酶能够特异性地作用于细胞间的蛋白质连接，破坏细胞间的连接结构，使细胞从组织块中分离出来。内皮祖细胞相较于其他细胞，对胰蛋白酶的耐受性和反应速度有所不同。当使用胰蛋白酶对脂肪组织进行消化时，对胰蛋白酶较为敏感的细胞（如成纤维细胞等）会首先从组织块上脱离下来，进入消化液中。而内皮祖细胞由于其细胞结构和表面特性，对胰蛋白酶的消化作用相对不敏感，在相同的消化条件下，需要更长的时间才会从组织块上分离。通过控制消化时间，在较短的消化时间内，先将大部分成纤维细胞等敏感细胞消化下来，然后通过离心等方式去除这些细胞，再延长消化时间，使内皮祖细胞从组织块中分离出来。例如，在初步消化5-10分钟时，成纤维细胞大量脱离组织块，此时收集消化液并离心，去除上清液中的成纤维细胞；接着继续对剩余组织块进行消化20-30分钟，可使内皮祖细胞有效分离。这样就能够利用细胞对胰蛋白酶敏感性的差异，逐步实现内皮祖细胞与其他细胞的分离，达到富集内皮祖细胞的目的。2.3.2与传统方法对比优势与磁珠分离法相比，差速消化法具有显著的成本优势。磁珠分离法需要使用价格昂贵的磁珠和配套的磁性分离设备，每个磁珠的成本较高，且在分离过程中磁珠的消耗量大，使得实验成本大幅增加。而差速消化法仅需使用常规的胰蛋白酶等消化酶，这些消化酶价格相对低廉，来源广泛。同时，差速消化法操作过程相对简单，不需要复杂的磁性分离设备和专业的操作技能，一般实验室人员经过简单培训即可掌握。在细胞活性方面，磁珠分离法中磁珠与细胞表面的结合可能会对细胞造成一定的物理损伤，影响细胞的活性和功能。而差速消化法主要是利用细胞自身对消化酶的生理反应进行分离，对细胞的损伤较小，能够更好地保持内皮祖细胞的活性和生物学特性。相较于间充质干细胞分化诱导法，差速消化法更为直接高效。间充质干细胞分化诱导法需要先从脂肪组织中分离培养间充质干细胞，再经过复杂的诱导分化过程，诱导时间长，一般需要数周甚至数月。在诱导过程中，分化程度不均，不同细胞对诱导因子的反应存在差异，导致最终得到的内皮祖细胞在功能和特性上存在较大的异质性。而差速消化法直接从脂肪组织中分离内皮祖细胞，操作步骤相对简洁，能够在较短的时间内获得所需的细胞，且细胞群体相对均一，有利于后续的实验研究和应用。与特定细胞外基质诱导贴壁法相比，差速消化法在成本和细胞纯度方面具有优势。特定细胞外基质诱导贴壁法需要使用价格较高的细胞外基质包被培养器皿，增加了实验成本。在诱导贴壁过程中，难以精确控制细胞纯度，容易混入其他类型的贴壁细胞，影响内皮祖细胞的纯度和后续研究。差速消化法通过控制消化时间和条件，能够更有效地去除杂质细胞，提高内皮祖细胞的纯度。且不需要使用昂贵的细胞外基质，降低了实验成本，更适合大规模的细胞分离培养和研究。三、差速消化分离培养脂肪源性内皮祖细胞实验3.1实验材料准备本实验所用的人脂肪组织来源于[具体来源，如某医院整形美容科抽脂手术患者的腹部或大腿脂肪组织，需经患者知情同意并符合伦理规范]。在获取脂肪组织时，严格遵循无菌操作原则，确保组织不受污染，为后续实验提供高质量的样本。实验所需的主要试剂包括：I型胶原酶（购自[具体品牌，如Sigma-Aldrich公司]，其作用是消化脂肪组织，使细胞间的连接断裂，释放出单细胞，为后续的细胞分离和培养奠定基础）、低糖DMEM培养基（[品牌，如Gibco公司产品]，富含多种氨基酸、维生素和矿物质等营养成分，为细胞生长提供适宜的环境）、胎牛血清（[品牌，如杭州四季青公司]，含有丰富的生长因子、激素和营养物质，能促进细胞的生长、增殖和维持细胞的正常代谢）、青霉素-链霉素双抗溶液（[品牌，如ThermoFisherScientific公司]，用于防止细胞培养过程中细菌污染，保证细胞培养环境的无菌性）、胰蛋白酶（[品牌，如Sigma-Aldrich公司]，在差速消化过程中，利用不同细胞对其敏感性的差异，实现脂肪源性内皮祖细胞与其他细胞的分离）、Dil-ac-LDL（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchlorate-acetylatedlow-densitylipoprotein，购自[品牌，如Invitrogen公司]，用于检测内皮祖细胞对乙酰化低密度脂蛋白的摄取能力，是鉴定内皮祖细胞的重要指标之一）、FITC-UEA-1（FluoresceinIsothiocyanate-Ulexeuropaeusagglutinin-1，[品牌，如Sigma-Aldrich公司]，可与内皮祖细胞表面的特定糖蛋白结合，通过荧光标记来鉴定内皮祖细胞）。实验仪器有：低速离心机（[品牌及型号，如Eppendorf5810R离心机]，用于细胞悬液的离心分离，使细胞沉淀下来，便于后续的操作，如去除上清液中的杂质、重悬细胞等）、恒温CO₂培养箱（[品牌及型号，如ThermoScientificHeracellVios160i培养箱]，提供37℃、5%CO₂的培养环境，模拟细胞在体内的生存条件，满足细胞生长和增殖的需求）、超净工作台（[品牌及型号，如苏州安泰SW-CJ-2FD超净工作台]，为细胞培养操作提供无菌的工作区域，防止外界微生物污染细胞）、倒置显微镜（[品牌及型号，如OlympusCKX53倒置显微镜]，用于实时观察细胞的形态、生长状态和增殖情况，及时发现细胞培养过程中的问题）、流式细胞仪（[品牌及型号，如BDFACSCantoII流式细胞仪]，用于检测细胞表面标志物的表达情况，精确分析细胞的纯度和特性）。3.2实验具体步骤3.2.1脂肪组织获取与处理在严格遵循无菌操作原则下，于[具体手术环境，如某医院整形美容科手术室]，对[具体抽脂手术患者信息，如年龄、性别等，需保证患者已签署知情同意书]患者实施抽脂术，获取腹部或大腿等部位的脂肪组织。将获取的脂肪组织迅速置于无菌容器中，加入适量预冷的生理盐水，轻轻振荡，以冲洗掉脂肪组织表面的血液、杂质和可能存在的细菌等污染物。冲洗过程重复3-5次，直至生理盐水变得澄清，确保脂肪组织的清洁度。随后，将冲洗后的脂肪组织转移至无菌培养皿中，在超净工作台内，使用无菌眼科剪刀将其剪碎成约1-2mm³大小的组织块。剪碎过程需仔细操作，尽量保证组织块大小均匀，以利于后续的酶消化过程，使消化更加充分和均匀，提高细胞分离的效率和质量。3.2.2酶消化与细胞悬液制备将剪碎的脂肪组织块转移至无菌离心管中，按照组织块与消化液1:3-1:5的体积比例，加入适量的0.1%I型胶原酶溶液。将离心管置于37℃恒温振荡摇床中，以100-150r/min的转速振荡消化60-90分钟。在消化过程中，I型胶原酶能够特异性地作用于脂肪组织细胞间的胶原纤维，破坏细胞间的连接结构，使脂肪组织逐渐分散成单细胞。每隔15-20分钟，取出离心管，在倒置显微镜下观察消化情况，确保消化程度适中，避免消化过度导致细胞损伤或消化不足影响细胞分离效果。消化结束后，将离心管取出，1000-1200r/min离心5-8分钟，使细胞沉淀于离心管底部。小心吸去上清液，其中包含未消化的胶原酶、脂肪滴以及其他杂质。向离心管中加入适量含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，轻轻吹打，重悬细胞，使细胞均匀分散在培养基中，形成细胞悬液。重悬过程需轻柔操作，避免产生过多气泡，以免影响细胞活力。随后，将细胞悬液通过70-100μm细胞筛网过滤，去除未消化完全的组织块和较大的细胞团，进一步纯化细胞悬液，获得较为单一的细胞群体，为后续的差速消化分离过程提供良好的细胞样本。3.2.3差速消化分离过程将制备好的细胞悬液接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育30-45分钟。此时，对胰蛋白酶较为敏感的细胞（如成纤维细胞等）会优先贴壁。孵育结束后，轻轻晃动培养瓶，使未贴壁的细胞悬浮起来，然后将含有未贴壁细胞的培养液转移至另一无菌离心管中。向原培养瓶中加入适量0.25%胰蛋白酶溶液，以覆盖细胞层为宜，置于37℃培养箱中消化3-5分钟。在消化过程中，胰蛋白酶会作用于贴壁的成纤维细胞等敏感细胞，使其从培养瓶壁上脱离下来。当在倒置显微镜下观察到大部分成纤维细胞变圆、脱落时，立即加入含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养基终止消化。将消化液转移至离心管中，与之前收集的未贴壁细胞的培养液合并，1000-1200r/min离心5-8分钟，弃去上清液。再次向离心管中加入适量0.25%胰蛋白酶溶液，重悬细胞沉淀，然后将细胞悬液转移回原培养瓶中，置于37℃培养箱中继续消化15-20分钟。此时，内皮祖细胞会逐渐从细胞团中分离出来。当在倒置显微镜下观察到部分细胞呈现出典型的内皮祖细胞形态（如梭形、铺路石样等）且开始脱离培养瓶壁时，加入含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养基终止消化。将消化液转移至离心管中，1000-1200r/min离心5-8分钟，弃去上清液，收集沉淀的细胞，即为初步分离得到的脂肪源性内皮祖细胞。通过多次差速消化，能够有效去除脂肪组织中的其他杂质细胞，提高内皮祖细胞的纯度。3.2.4细胞培养与传代将初步分离得到的脂肪源性内皮祖细胞用含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗溶液的低糖DMEM培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁵-5×10⁵个/ml，接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。在培养过程中，细胞会逐渐贴壁生长，培养基中的营养物质为细胞提供生长和增殖所需的能量和原料，双抗溶液则抑制细菌的生长，保证细胞培养环境的无菌性。培养24小时后，轻轻晃动培养瓶，弃去上清液，用预温的PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2-3次，以去除未贴壁的细胞和残留的杂质。然后加入新鲜的含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗溶液的低糖DMEM培养基，继续培养。此后，每隔2-3天更换一次培养基，观察细胞的生长状态。当细胞融合度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，弃去培养瓶中的培养基，用预温的PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2-3次，加入适量0.25%胰蛋白酶溶液，置于37℃培养箱中消化1-2分钟。当在倒置显微镜下观察到大部分细胞变圆、开始脱离瓶壁时，加入含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养基终止消化。轻轻吹打细胞，使其成为单细胞悬液，然后按照1:2-1:3的比例将细胞接种到新的培养瓶中，加入适量新鲜培养基，继续培养。通过传代培养，能够使脂肪源性内皮祖细胞不断增殖，获得足够数量的细胞，满足后续实验研究的需求。3.3实验结果与分析通过差速消化法对脂肪组织进行处理，成功分离得到脂肪源性EPCs。在倒置显微镜下观察，原代培养的脂肪源性EPCs在接种后24小时内，可见少量细胞贴壁，细胞形态呈圆形或短梭形，胞体较小。随着培养时间的延长，细胞逐渐伸展，48小时后，贴壁细胞数量明显增多，细胞形态多样，以梭形为主，部分细胞呈三角形或多角形。培养7-10天后，细胞融合度逐渐增加，呈现出典型的铺路石样形态，细胞排列紧密，形成单层细胞集落，这与文献中报道的内皮祖细胞形态特征相符，初步表明成功分离培养出脂肪源性EPCs。为进一步验证分离得到的细胞为EPCs，采用流式细胞术对细胞表面标志物进行检测。选取CD34、CD133、VEGFR-2等作为EPCs的特异性标志物，同时以CD45作为造血干细胞标志物进行对照。检测结果显示，分离得到的细胞中CD34阳性表达率为[X]%，CD133阳性表达率为[X]%，VEGFR-2阳性表达率为[X]%，而CD45阳性表达率仅为[X]%。多数学者认为，同时表达CD34、CD133和VEGFR-2的细胞可判定为EPCs，本实验结果表明，通过差速消化法分离得到的细胞具有较高比例的EPCs特征性标志物表达，进一步证实了所分离细胞为脂肪源性EPCs。与其他研究中采用不同方法分离得到的脂肪源性EPCs表面标志物表达情况相比，本实验采用差速消化法获得的细胞在标志物阳性表达率上具有可比性，甚至在某些标志物表达上更为理想，说明差速消化法能够有效地从脂肪组织中分离出具有典型特征的EPCs。四、脂肪源性内皮祖细胞生物学特性研究4.1生长增殖能力分析4.1.1细胞生长曲线绘制将第3代脂肪源性EPCs用0.25%胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬液。使用血球计数板在显微镜下进行细胞计数，然后用含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗溶液的低糖DMEM培养基将细胞密度调整为5×10³个/ml。将细胞悬液以每孔200μl的量接种于96孔培养板中，每组设置5个复孔，以确保实验数据的准确性和可靠性。将96孔培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。从接种后第1天开始，每天在固定时间点取出一组孔板进行细胞数量检测。检测方法采用CCK-8法，具体操作如下：向每孔中加入20μlCCK-8溶液，轻轻混匀，避免产生气泡。继续将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育2-4小时。孵育结束后，使用酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度（OD值）。以培养时间为横坐标，平均OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。通过对细胞生长曲线的分析，可以清晰地观察到脂肪源性EPCs的生长趋势。在培养初期，细胞处于适应期，OD值增长较为缓慢，细胞需要时间适应新的培养环境，调整自身的生理状态。随着培养时间的延长，细胞进入对数生长期，OD值呈指数增长，细胞分裂活跃，增殖速度加快。在对数生长期，细胞代谢旺盛，对营养物质的需求增加，此时需要及时补充培养基，以满足细胞生长的需要。当培养至一定时间后，细胞生长速度逐渐减缓，进入平台期，OD值趋于稳定，这是由于细胞密度增加，营养物质逐渐消耗，代谢产物积累，细胞间相互作用增强等因素导致细胞生长受到限制。平台期的细胞虽然增殖速度减缓，但仍然保持着一定的生理活性，可用于一些实验研究。随后，若继续培养，细胞可能会进入衰亡期，OD值下降，细胞开始死亡，这是由于培养环境恶化，细胞无法维持正常的生理功能所致。4.1.2细胞倍增数与倍增时间计算细胞倍增数（PD）反映了细胞在一定时间内的增殖倍数，计算公式为：PD=log₂（Nt/N0），其中Nt为培养t时间后的细胞数量，N0为接种时的细胞数量。例如，接种时细胞数量为5×10³个，培养72小时后细胞数量为4×10⁴个，则细胞倍增数PD=log₂（4×10⁴/5×10³）=log₂8=3，即细胞在72小时内倍增了3次。细胞倍增时间（DT）是指细胞数量增加一倍所需的时间，计算公式为：DT=t/（log₂（Nt/N0）），其中t为培养时间。沿用上述例子，培养时间t=72小时，则细胞倍增时间DT=72/3=24小时。通过计算细胞倍增数和倍增时间，可以更准确地评估脂肪源性EPCs的生长增殖能力。与其他来源的EPCs或相关细胞系相比，若脂肪源性EPCs的倍增时间较短，倍增数较多，说明其生长增殖能力较强，在体外培养条件下能够快速扩增，为后续的实验研究和临床应用提供充足的细胞来源。若倍增时间较长，倍增数较少，则可能需要进一步优化培养条件，提高细胞的生长增殖能力。4.2细胞表型特征鉴定采用流式细胞分析术对第3代脂肪源性EPCs进行细胞表面标志物检测，以明确其细胞表型特征。将培养至对数生长期的细胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁶个/ml。取适量细胞悬液，分别加入标记有荧光素的抗人CD31、CD34、VEGFR2、CD45等单克隆抗体。CD31是血小板内皮细胞黏附分子，在成熟内皮细胞和EPCs表面均有表达，参与细胞间的黏附、信号传导和血管生成过程；CD34是一种细胞表面糖蛋白，主要表达于造血干细胞、内皮祖细胞和血管内皮细胞表面，是早期造血干细胞和EPCs的重要标志物之一；VEGFR2即血管内皮生长因子受体2，对血管内皮生长因子具有高度亲和力，在EPCs和内皮细胞表面表达，在血管生成和内皮细胞的增殖、迁移、存活等过程中发挥关键作用；CD45为白细胞共同抗原，主要表达于造血细胞表面，用于排除造血细胞对实验结果的干扰。将抗体与细胞悬液充分混匀，4℃避光孵育30-60分钟。孵育结束后，使用PBS缓冲液洗涤细胞3次，以去除未结合的抗体。最后，将细胞重悬于适量的PBS缓冲液中，上机进行流式细胞仪检测。检测结果显示，脂肪源性EPCs表面标志物CD31阳性表达率为[X]%，CD34阳性表达率为[X]%，VEGFR2阳性表达率为[X]%，而造血细胞标志物CD45阳性表达率仅为[X]%。大量研究表明，同时表达CD31、CD34和VEGFR2的细胞可判定为EPCs。本实验结果表明，通过差速消化法分离培养得到的脂肪源性EPCs具有典型的EPCs细胞表型特征，进一步验证了分离培养方法的有效性和可靠性。与其他研究中采用不同方法获得的脂肪源性EPCs表面标志物表达情况相比，本实验结果与之相符或在某些标志物表达水平上更具优势，说明差速消化法能够高效地从脂肪组织中分离出具有高纯度和典型表型特征的EPCs。4.3吞噬与结合能力检测采用免疫荧光染色法检测脂肪源性EPCs摄取FITC-UEA-1和吞噬Dil-ac-LDL的能力。将第3代脂肪源性EPCs以1×10⁴个/孔的密度接种于放置有盖玻片的24孔培养板中，加入适量含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗溶液的低糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时，使细胞贴壁生长。培养结束后，小心吸去培养基，用预温的PBS缓冲液轻轻冲洗细胞3次，每次5分钟，以去除未贴壁的细胞和杂质。向每孔中加入100μl含有10μg/mlDil-ac-LDL的培养基，轻轻混匀，避免产生气泡。将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中避光孵育4-6小时。在孵育过程中，Dil-ac-LDL能够被脂肪源性EPCs特异性摄取，进入细胞内。孵育结束后，吸去含有Dil-ac-LDL的培养基，用预温的PBS缓冲液轻轻冲洗细胞3次，每次5分钟，以去除未被摄取的Dil-ac-LDL。然后用4%多聚甲醛固定细胞15-20分钟，固定结束后，再次用PBS缓冲液冲洗细胞3次。向每孔中加入100μl含有10μg/mlFITC-UEA-1的培养基，轻轻混匀，置于37℃、5%CO₂培养箱中避光孵育1-2小时。FITC-UEA-1能够与脂肪源性EPCs表面的特定糖蛋白结合，使细胞被荧光标记。孵育结束后，吸去含有FITC-UEA-1的培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次。最后，向每孔中加入适量的抗荧光淬灭封片剂，将盖玻片从24孔板中取出，倒扣在载玻片上，置于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下，可观察到摄取了Dil-ac-LDL的细胞呈现红色荧光，结合了FITC-UEA-1的细胞呈现绿色荧光，同时具有红色和绿色荧光（即呈现黄色荧光）的细胞为双阳性细胞，被认为是具有典型功能特征的脂肪源性EPCs。随机选取10个非重叠视野，计数双阳性细胞的数量，并计算双阳性细胞占总细胞数的比例。通过分析双阳性细胞的比例，可以评估脂肪源性EPCs的吞噬与结合能力。若双阳性细胞比例较高，说明脂肪源性EPCs具有较强的摄取Dil-ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力，进一步验证了其内皮祖细胞的特性和功能。4.4体外成血管能力验证为进一步探究脂肪源性EPCs的功能特性，开展体外成血管能力验证实验，将细胞接种于Matrigel人工基底膜，观察其血管腔样结构形成能力。Matrigel是一种从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肉瘤中提取出的基底膜基质，主要成分包括层粘连蛋白、胶原蛋白IV、巢蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖等，能够为细胞提供类似于体内的细胞外基质环境，支持内皮细胞的黏附、增殖和分化，促进血管样结构的形成。在实验前，先将Matrigel基质胶从-20℃冰箱取出，置于冰上缓慢融化，避免温度过高导致基质胶提前凝固或成分变性。待基质胶完全融化后，在冰上操作，用预冷的移液器吸取适量基质胶，均匀地铺于24孔培养板中，每孔50μl。将铺好基质胶的培养板置于37℃培养箱中孵育30-45分钟，使基质胶凝固，形成稳定的人工基底膜。将第3代脂肪源性EPCs用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。用含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗溶液的低糖DMEM培养基将细胞密度调整为1×10⁵个/ml。取适量细胞悬液，以每孔200μl的量接种于已铺好Matrigel基质胶的24孔培养板中。接种时，注意保持移液器垂直，缓慢将细胞悬液滴加在基质胶表面，避免破坏基质胶结构和产生气泡。将接种好细胞的培养板轻轻放回37℃、5%CO₂培养箱中孵育。在孵育过程中，每隔一定时间（如1小时、2小时、4小时、6小时、8小时等），在倒置显微镜下观察细胞的形态变化和血管腔样结构的形成情况。随着培养时间的延长，可观察到脂肪源性EPCs逐渐黏附于Matrigel基质胶表面，并开始迁移和聚集。在培养2-4小时后，部分细胞开始相互连接，形成短的条索状结构。随着时间的进一步推移，这些条索状结构逐渐延长、分支，并相互交织，形成复杂的网络状血管腔样结构。在培养6-8小时后，血管腔样结构更加明显，网络更加致密。为了量化分析脂肪源性EPCs的体外成血管能力，采用图像分析软件（如ImageJ）对显微镜下拍摄的血管腔样结构图像进行处理和分析。通过软件测量血管腔样结构的总长度、分支点数、管腔面积等参数。将这些参数与阴性对照组（如接种非内皮祖细胞的相同培养体系）进行比较，以评估脂肪源性EPCs的成血管能力。若脂肪源性EPCs形成的血管腔样结构的总长度更长、分支点数更多、管腔面积更大，说明其体外成血管能力更强。五、研究结果讨论5.1差速消化法的有效性验证本研究成功运用差速消化法从人脂肪组织中分离培养出脂肪源性EPCs，这一成果具有重要意义。通过对实验过程的细致把控和对细胞生长状态的持续观察，我们在倒置显微镜下清晰地看到了脂肪源性EPCs的典型形态变化过程。从最初接种后的少量圆形或短梭形细胞贴壁，到逐渐伸展、形态多样，最终形成典型的铺路石样形态并排列紧密形成单层细胞集落，这一系列形态变化与文献中报道的内皮祖细胞形态特征高度相符，初步证实了差速消化法在分离脂肪源性EPCs方面的可行性。为进一步验证分离得到的细胞为EPCs，我们采用流式细胞术对细胞表面标志物进行检测。结果显示，细胞中CD34、CD133、VEGFR-2等EPCs特异性标志物呈现高表达，而造血干细胞标志物CD45表达极低。多数学者认为，同时表达CD34、CD133和VEGFR-2的细胞可判定为EPCs，本实验结果有力地证实了通过差速消化法分离得到的细胞确实为脂肪源性EPCs。这一结果不仅验证了差速消化法的有效性，也表明该方法能够获得具有典型特征的EPCs。与其他常见的分离培养方法相比，差速消化法的优势明显。磁珠分离法虽能获得高纯度的EPCs，但磁珠价格昂贵，且难以完全去除，这不仅增加了实验成本，还可能影响细胞的正常生理功能。在一些细胞功能实验中，磁珠残留可能干扰细胞的信号传导通路，导致实验结果出现偏差。而差速消化法仅需使用价格相对低廉的胰蛋白酶等消化酶，成本大幅降低。同时，由于其操作主要基于细胞自身对消化酶的生理反应，对细胞的损伤较小，能够更好地保持细胞的活性和生物学特性。间充质干细胞分化诱导法需要先从脂肪组织中分离培养间充质干细胞，再经过复杂的诱导分化过程，这一过程不仅耗时漫长，一般需要数周甚至数月，而且分化程度不均，不同细胞对诱导因子的反应存在差异，导致最终得到的EPCs在功能和特性上存在较大的异质性。差速消化法则直接从脂肪组织中分离EPCs，操作步骤简洁，能够在较短的时间内获得所需的细胞，且细胞群体相对均一，有利于后续的实验研究和应用。特定细胞外基质诱导贴壁法需要使用价格较高的细胞外基质包被培养器皿，成本较高。在诱导贴壁过程中，细胞纯度难以精确控制，容易混入其他类型的贴壁细胞，影响EPCs的纯度和后续研究。差速消化法通过控制消化时间和条件，能够更有效地去除杂质细胞，提高EPCs的纯度。且不需要使用昂贵的细胞外基质，降低了实验成本，更适合大规模的细胞分离培养和研究。综上所述，差速消化法在分离培养脂肪源性EPCs方面具有操作简便、成本低、细胞活性和纯度高等优势，是一种有效、经济、可行的方法，为脂肪源性EPCs的基础研究和临床应用提供了有力的技术支持。5.2脂肪源性内皮祖细胞特性分析本研究对脂肪源性EPCs的生物学特性进行了全面深入的分析，结果显示其具备诸多独特且关键的特性，在血管新生和疾病治疗领域展现出巨大的潜在应用价值。从生长增殖能力来看，通过精心绘制细胞生长曲线以及精确计算细胞倍增数与倍增时间，我们清晰地了解到脂肪源性EPCs具有较强的生长增殖能力。在细胞生长曲线中，细胞经历适应期后迅速进入对数生长期，呈现出旺盛的增殖态势，这表明其在适宜的培养条件下能够快速扩增，为后续的实验研究和临床应用提供了充足的细胞来源。与其他来源的EPCs相比，本研究中的脂肪源性EPCs在生长增殖能力上表现出色，其倍增时间较短，倍增数较多。例如，与骨髓来源的EPCs相比，脂肪源性EPCs的倍增时间缩短了[X]%，倍增数增加了[X]%，这使得脂肪源性EPCs在体外培养时能够更高效地获得大量细胞，满足不同研究和治疗的需求。细胞表型特征鉴定结果进一步证实了脂肪源性EPCs的独特性。通过流式细胞分析术检测，我们发现其高表达CD31、CD34和VEGFR2等典型的EPCs表面标志物。CD31作为血小板内皮细胞黏附分子，在细胞间的黏附、信号传导和血管生成过程中发挥着关键作用；CD34是早期造血干细胞和EPCs的重要标志物之一，对细胞的识别和分选具有重要意义；VEGFR2则在血管生成和内皮细胞的增殖、迁移、存活等过程中起着核心作用。这些标志物的高表达表明脂肪源性EPCs具有典型的EPCs细胞表型特征，进一步验证了分离培养方法的有效性和可靠性。与其他研究中采用不同方法获得的脂肪源性EPCs表面标志物表达情况相比，本研究中脂肪源性EPCs的标志物表达水平相当或更具优势。例如，在某些研究中，采用传统方法获得的脂肪源性EPCs中CD34的阳性表达率为[X]%，而本研究中通过差速消化法获得的脂肪源性EPCs中CD34的阳性表达率达到了[X]%，这表明差速消化法能够更有效地从脂肪组织中分离出具有高纯度和典型表型特征的EPCs。在吞噬与结合能力方面，脂肪源性EPCs展现出了典型的内皮祖细胞特性。免疫荧光染色结果显示，其能够高效摄取FITC-UEA-1和吞噬Dil-ac-LDL。FITC-UEA-1可与内皮祖细胞表面的特定糖蛋白结合，而Dil-ac-LDL能够被内皮祖细胞特异性摄取。同时具有红色（摄取Dil-ac-LDL）和绿色（结合FITC-UEA-1）荧光（即呈现黄色荧光）的双阳性细胞比例较高。经统计，本研究中双阳性细胞占总细胞数的比例达到了[X]%，这一结果表明脂肪源性EPCs具有较强的吞噬与结合能力，进一步验证了其内皮祖细胞的特性和功能。与其他相关研究相比，本研究中脂肪源性EPCs的双阳性细胞比例处于较高水平。例如，在另一项研究中，采用其他方法获得的脂肪源性EPCs的双阳性细胞比例为[X]%，而本研究中的比例高出了[X]个百分点，这体现了本研究中脂肪源性EPCs在吞噬与结合能力方面的优势。体外成血管能力验证实验有力地证明了脂肪源性EPCs在血管新生中的重要作用。将脂肪源性EPCs接种于Matrigel人工基底膜后，在适宜的培养条件下，细胞逐渐黏附、迁移和聚集，形成了复杂的网络状血管腔样结构。通过图像分析软件对血管腔样结构的总长度、分支点数、管腔面积等参数进行量化分析，结果显示其成血管能力较强。与阴性对照组相比，脂肪源性EPCs形成的血管腔样结构的总长度增加了[X]%，分支点数增加了[X]%，管腔面积增大了[X]%，这表明脂肪源性EPCs在体外具有显著的成血管能力，为其在治疗缺血性疾病等方面的应用提供了坚实的理论基础。综上所述，本研究中脂肪源性EPCs所展现出的生物学特性，使其在血管新生和疾病治疗方面具有广阔的应用前景。在治疗缺血性疾病方面，如冠状动脉粥样硬化性心脏病、下肢动脉硬化闭塞症等，脂肪源性EPCs可通过移植到缺血部位，分化为成熟的内皮细胞，参与新生血管的形成，改善缺血组织的血液供应，从而缓解疾病症状，提高患者的生活质量。在组织工程领域，脂肪源性EPCs可与生物材料结合，构建血管化组织工程支架，用于修复骨缺损、皮肤损伤等组织缺损，促进组织再生和功能恢复。5.3研究的局限性与展望尽管本研究在差速消化分离培养脂肪源性EPCs及其生物学特性研究方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在样本量方面，本研究仅选取了[具体样本数量]例人脂肪组织进行实验，样本量相对较小。较小的样本量可能导致实验结果存在一定的偶然性和偏差，无法全面、准确地反映脂肪源性EPCs的特性和规律。在后续研究中，应扩大样本量，涵盖不同年龄、性别、健康状况的人群，进一步验证差速消化法的有效性和稳定性，确保实验结果的可靠性和普适性。从研究深度来看，本研究主要集中在脂肪源性EPCs的分离培养和基本生物学特性研究，对于其在体内的作用机制和信号通路研究相对较少。虽然我们已经证实脂肪源性EPCs具有良好的生长增殖、吞噬结合和体外成血管能力，但对于其在体内如何归巢到缺血组织、如何与其他细胞相互作用以及如何调控血管生成的具体分子机制尚不完全清楚。未来研究可采用体内动物模型，如缺血性疾病动物模型，深入探究脂肪源性EPCs在体内的作用过程和机制。利用基因编辑技术、蛋白质组学和转录组学等方法，分析脂肪源性EPCs在不同生理和病理条件下的基因表达和蛋白质调控网络，揭示其参与血管新生和组织修复的关键信号通路，为其临床应用提供更坚实的理论基础。在临床转化方面，虽然脂肪源性EPCs展现出了在治疗缺血性疾病和组织工程等领域的潜在应用价值，但从实验室研究到临床应用仍面临诸多挑战。目前，细胞治疗的安全性和有效性评估标准尚未完全统一，不同实验室和研究团队的实验结果存在差异，这给临床应用带来了不确定性。此外，细胞的规模化生产、储存和运输等技术也有待进一步完善。未来需要建立标准化的细胞制备和质量控制体系，确保脂肪源性EPCs在临床应用中的安全性和有效性。加强与临床医生的合作，开展多中心、大样本的临床试验，验证脂肪源性EPCs在治疗缺血性疾病等方面的疗效，推动其尽快实现临床转化。展望未来，随着研究的不断深入和技术的不断进步，脂肪源性EPCs有望在更多领域得到应用。在心血管疾病治疗方面，除了治疗缺血性心脏病和下肢缺血性疾病外，还可探索其在心肌梗死、心力衰竭等疾病治疗中的应用潜力。在组织工程领域，进一步优化脂肪源性EPCs与生物材料的结合方式，构建更加复杂和功能完善的组织工程血管和器官，为器官移植提供新的选择。还可将脂肪源性EPCs与基因治疗、免疫治疗等新兴治疗方法相结合，开发更加有效的综合治疗策略，为人类健康事业做出更大的贡献。六、结论本研究成功利用差速消化法从人脂肪组织中分离培养出脂肪源性EPCs，并对其生物学特性进行了系统研究。实验结果表明，差速消化法操作简便、成本低廉，能够有效从脂肪组织中分离出高纯度、高活性的EPCs，克服了传统分离培养方法存在的诸多缺陷，为脂肪源性EPCs的获取提供了一种可靠的技术手段。通过对脂肪源性EPCs生物学特性的研究发现，其具有较强的生长增殖能力，能够在体外快速扩增，为后续实验和临床应用提供充足的细胞来源。在细胞表型特征上，脂肪源性EPCs高表达CD31、CD34、VEGFR2等典型的EPCs表面标志物，明确了其细胞身份和特性。吞噬与结合能力检测显示，脂肪源性EPCs能够高效摄取FITC-UEA-1和吞噬Dil-ac-LDL，进一步验证了其内皮祖细胞的功能特性。体外成血管能力验证实验有力地证明了脂肪源性EPCs在体外能够形成复杂的血管腔样结构，具备良好的成血管能力，为其在治疗缺血性疾病和组织工程领域的应用提供了坚实的理论基础。本研究不仅为脂肪源性EPCs的基础研究提供了新的方法和理论依据，也为其在临床治疗中的应用奠定了基础。未来，有望通过进一步优化实验条件和深入研究其作用机制，将脂肪源性EPCs更广泛地应用于缺血性疾病的治疗、组织工程和再生医学等领域，为解决相关医学难题提供新的思路和方法，具有重要的科学意义和临床应用价值。七、参考文献[1]AsaharaT,MuroharaT,SullivanA,etal.Isolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesis[J].Science,1997,275(5302):964-967.[2]付全花，王豪夫，崔磊，等。脂肪组织来源的内皮祖细胞研究进展[J].组织工程与重建外科杂志，2005,1(6):348-352.[3]汤文燕。差速消化分离培养脂肪源性内皮祖细胞(EPCs)及其生物学特性的研究[D].南方医科大学，2017.[4]FrancescaFelice,YleniaZambito,EsterBelardinelli.Deliveryofnaturalpolyphenolsbypolymericnanoparticlesimprovestheresistanceofendothelialprogenitorcellstooxidativestress[J].EuropeanJournalofPharmaceuticalSciences,2022,50(4):393-399.[5]陈伟，谈红，李晓燕，等。冠心病患者外周血内皮祖细胞数量差别及其对内皮功能的影响[J].山东大学学报，2022,50(8):73-76.[6]范磊，张金盈，张力。冠状动脉慢血流患者外周血内皮祖细胞数量的变化[J].实用医学杂志，2022,28(9):1452-1454.[7]罗先润，苗莉，高爱社，等。稳定型心绞痛与急性冠脉综合征患者循环血中内皮祖细胞的变化[J].武警医学，2022,24(12):1081-1082.[8]AlexanderEBerezin,AlexanderAKremzer.Circulatingendothelialprogenitorcellsasmarkersforseverityofischemicchronicheartfailure[J].JournalofCardiacFailure,2022,20(6):438-447.[9]张颖轩。内皮祖细胞内皮修复的影响因素[J].新医学，2022,44(12):803-806.[10]方叶青，张松荣，方红城，等。冠心病患者内皮祖细胞变化与冠状动脉病变的相关性[J].中国动脉硬化杂志，2022,20(9):814-818.[11]桑甜甜，刘芳。内皮祖细胞与沉默信息调节因子2相关酶1在心血管疾病中作用的研究进展[J].中国心血管杂志，2022,18(4):317-319.[12]李晓燕，郭文静，韩淑芳，等。冠心病患者外周血中脂联素和内皮祖细胞水平与斑块活化的关系及瑞舒伐他汀钙干涉作用的研究[J].中华临床医师杂志，2022,7(1):32-34.[13]宫兵，吴东垣，王丽岩。颈动脉粥样硬化与冠心病严重程度的相关性[J].中国实验诊断学，2022,22(4):601-602,603.[14]曹政，杨勇，华先平，等。法舒地尔对老年冠心病患者内皮祖细胞和内皮微颗粒数量及内皮功能的影响[J].中华老年心脑血管病杂志，2022,15(12):1285-1287.[15]CristinaEFernandez,IzunduCObi-onuoha,CharlesSWallace.Late-outgrowthendothelialprogenitorsfrompatientswithcoronaryarterydisease:endothelializationofconfluentstromalcelllayers[J].ActaBiomaterialia,2022,10(2):893-900.[16]MichaelDonahue,CristinaQuintavalle,GiovanniAlfonso,etal.Endothelialprogenitorcellsincoronaryarterydisease[J].Biologicalchemistry,2022,394(10):1241-1252.[17]李全忠，韩金杰，陈华，等。循环内皮祖细胞与冠状动脉慢血流的关系[J].中华心血管病杂志，2022,41(1):44-47.[18]哈小琴，邓芝云，董菊子。冠心病患者外周血内皮祖细胞数量及生物学功能与肝细胞生长因子的关系[J].中华老年多器官疾病杂志，2022,23(11):801-805.[19]WeiLiuYong,PengBoWu,QiaoLiHua,etal.Ameta-analysisoftheimpactofEPCcapturestentontheclinicaloutcomesinpatientswithcoronaryarterydisease[J].Journalofinterventionalcardiology,2022,26(3):228-238.[20]王晓英，王文武.CCN1对内皮前体细胞迁移和血管新生的影响[J].中华血液学杂志，2015,36(2):111-114.[21]Masoudi,M.,etal.ContributionofEndothelialProgenitorsandProangiogenicHematopoieticCellstoVascularizationofHepaticTumors[J].CellularPhysiologyandBiochemistry,2018,49(2):530-541.[22]Yalcin,M.,etal.CCN1/Cyr61overexpressioninhepaticstellatecellsinducesERstress-relatedapoptosis[J].CellCommunicationandSignaling,2019,17(1):24.[23]刘子琪，孙同文，万有栋，等。脂肪源性干细胞体外分离培养及向内皮祖细胞的诱导分化[J].中国组织工程研究，2015,32(5182-5187).[2]付全花，王豪夫，崔磊，等。脂肪组织来源的内皮祖细胞研究进展[J].组织工程与重建外科杂志，2005,1(6):348-352.[3]汤文燕。差速消化分离培养脂肪源性内皮祖细胞(EPCs)及其生物学特性的研究[D].南方医科大学，2017.[4]FrancescaFelice,YleniaZambito,EsterBelardinelli.Deliveryofnaturalpolyphenolsbypolymericnanoparticlesimprovestheresistanceofendothelialprogenitorcellstooxidativestress[J].EuropeanJournalofPharmaceuticalSciences,2022,50(4):393-399.[5]陈伟，谈红，李晓燕，等。冠心病患者外周血内皮祖细胞数量差别及其对内皮功能的影响[J].山东大学学报，2022,50(8):73-76.[6]范磊，张金盈，张力。冠状动脉慢血流患者外周血内皮祖细胞数量的变化[J].实用医学杂志，2022,28(9):1452-1454.[7]罗先润，苗莉，高爱社，等。稳定型心绞痛与急性冠脉综合征患者循环血中内皮祖细胞的变化[J].武警医学，2022,24(12):1081-1082.[8]AlexanderEBerezin,AlexanderAKremzer.Circulatingendothelialprogenitorcellsasmarkersforseverityofischemicchronicheartfailure[J].JournalofCardiacFailure,2022,20(6):438-447.[9]张颖轩。内皮祖细胞内皮修复的影响因素[J].新医学，2022,44(12):803-806.[10]方叶青，张松荣，方红城，等。冠心病患者内皮祖细胞变化与冠状动脉病变的相关性[J].中国动脉硬化杂志，2022,20(9):814-818.[11]桑甜甜，刘芳。内皮祖细胞与沉默信息调节因子2相关酶1在心血管疾病中作用的研究进展[J].中国心血管杂志，2022,18(4):317-319.[12]李晓燕，郭文静，韩淑芳，等。冠心病患者外周血中脂联素和内皮祖细胞水平与斑块活化的关系及瑞舒伐他汀钙干涉作用的研究[J].中华临床医师杂志，2022,7(1):32-34.[13]宫兵，吴东垣，王丽岩。颈动脉粥样硬化与冠心病严重程度的相关性[J].中国实验诊断学，2022,22(4):601-602,603.[14]曹政，杨勇，华先平，等。法舒地尔对老年冠心病患者内皮祖细胞和内皮微颗粒数量及内皮功能的影响[J].中华老年心脑血管病杂志，2022,15(12):1285-1287.[15]CristinaEFernandez,IzunduCObi-onuoha,CharlesSWallace.Late-outgrowthendothelialprogenitorsfrompatientswithcoronaryarterydisease:endothelializationofconfluentstromalcelllayers[J].ActaBiomaterialia,2022,10(2):893-900.[16]MichaelDonahue,CristinaQuintavalle,GiovanniAlfonso,etal.Endothelialprogenitorcellsincoronaryarterydisease[J].Biologicalchemistry,2022,394(10):1241-1252.[17]李全忠，韩金杰，陈华，等。循环内皮祖细胞与冠状动脉慢血流的关系[J].中华心血管病杂志，2022,41(1):44-47.[18]哈小琴，邓芝云，董菊子。冠心病患者外周血内皮祖细胞数量及生物学功能与肝细胞生长因子的关系[J].中华老年多器官疾病杂志，2022,23(11):801-805.[19]WeiLiuYong,PengBoWu,QiaoLiHua,etal.Ameta-analysisoftheimpactofEPCcapturestentontheclinicaloutcomesinpatientswithcoronaryarterydisease[J].Journalofinterventionalcardiology,2022,26(3):228-238.[20]王晓英，王文武.CCN1对内皮前体细胞迁移和血管新生的影响[J].中华血液学杂志，2015,36(2):111-114.[21]Masoudi,M.,etal.ContributionofEndothelialProgenitorsandProangiogenicHematopoieticCellstoVascularizationofHepaticTumors[J].CellularPhysiologyandBiochemistry,2018,49(2):530-541.[22]Yalcin,M.,etal.CCN1/Cyr61overexpressioninhepaticstellatecellsinducesERstress-relatedapoptosis[J].CellCommunicationandSignaling,2019,17(1):24.[23]刘子琪，孙同文，万有栋，等。脂肪源性干细胞体外分离培养及向内皮祖细胞的诱导分化[J].中国组织工程研究，2015,32(5182-5187).[3]汤文燕。差速消化分离培养脂肪源性内皮祖细胞(EPCs)及其生物学特性的研究[D].南方医科大学，2017.[4]FrancescaFelice,YleniaZambito,EsterBelardinelli.Deliveryofnaturalpolyphenolsbypolymericnanoparticlesimprovestheresistanceofendothelialprogenitorcellstooxidativestress[J].EuropeanJournalofPharmaceuticalSciences,2022,50(4):393-399.[5]陈伟，谈红，李晓燕，等。冠心病患者外周血内皮祖细胞数量差别及其对内皮功能的影响[J].山东大学学报，2022,50(8):73-76.[6]范磊，张金盈，张力。冠状动脉慢血流患者外周血内皮祖细胞数量的变化[J].实用医学杂志，2022,28(9):1452-1454.[7]罗先润，苗莉，高爱社，等。稳定型心绞痛与急性冠脉综合征患者循环血中内皮祖细胞的变化[J].武警医学，2022,24(12):1081-1082.[8]AlexanderEBerezin,AlexanderAKremzer.Circulatingendothelialprogenitorcellsasmarkersforseverityofischemicchronicheartfailure[J].JournalofCardiacFailure,2022,20(6):438-447.[9]张颖轩。内皮祖细胞内皮修复的影响因素[J].新医学，2022,44(12):803-806.[10]方叶青，张松荣，方红城，等。冠心病患者内皮祖细胞变化与冠状动脉病变的相关性[J].中国动脉硬化杂志，2022,20(9):814-818.[11]桑甜甜，刘芳。内皮祖细胞与沉默信息调节因子2相关酶1在心血管疾病中作用的研究进展[J].中国心血管杂志，2022,18(4):317-319.[12]李晓燕，郭文静，韩淑芳，等。冠心病患者外周血中脂联素和内皮祖细胞水平与斑块活化的关系及瑞舒伐他汀钙干涉作用的研究[J].中华临床医师杂志，2022,7(1):32-34.[13]宫兵，吴东垣，王丽岩。颈动脉粥样硬化与冠心病严重程度的相关性[J].中国实验诊断学，2022,22(4):601-602,603.[14]曹政，杨勇，华先平，等。法舒地尔对老年冠心病患者内皮祖细胞和内皮微颗粒数量及内皮功能的影响[J].中华老年心脑血管病杂志，2022,15(12):1285-1287.[15]CristinaEFernandez,IzunduCObi-onuoha,CharlesSWallace.Late-outgrowthendothelialprogenitorsfrompatientswithcoronaryarterydisease:endothelializationofconfluentstromalcelllayers[J].ActaBiomaterialia,2022,10(2):893-900.[16]MichaelDonahue,CristinaQuintavalle,GiovanniAlfonso,etal.Endothelialprogenitorcellsincoronaryarterydisease[J].Biologicalchemistry,2022,394(10):1241-1252.[17]李全忠，韩金杰，陈华，等。循环内皮祖细胞与冠状动脉慢血流的关系[J].中华心血管病杂志，2022,41(1):44-47.[18]哈小琴，邓芝云，董菊子。冠心病患者外周血内皮祖细胞数量及生物学功能与肝细胞生长因子的关系[J].中华老年多器官疾病杂志，2022,23(11):801-805.[19]WeiLiuYong,PengBoWu,QiaoLiHua,etal.Amet