巴西海木提取物对DEHP致雄性小鼠生殖系统损伤的保护效应及机制探究

巴西海木提取物对DEHP致雄性小鼠生殖系统损伤的保护效应及机制探究一、引言1.1研究背景与意义在当今社会，男性生殖系统疾病的发病率呈现出显著的上升趋势，已然成为一个不容忽视的公共卫生问题。世界卫生组织（WHO）的统计数据显示，全球范围内，不孕不育夫妇的比例高达15%-20%，其中男性因素导致的生育问题占比在20%-70%之间。在中国，据相关调查统计，男科疾病的整体发病率高达51%，约3.61亿人受到影响，其中男性不育发病率为10%-15%，20至40岁的男性中，20%患有前列腺炎，16%有生殖道感染；40岁以上的男性，50%患有性功能障碍和前列腺增生。这些疾病不仅严重影响了男性的生殖健康和生活质量，也给家庭和社会带来了沉重的负担。环境内分泌干扰物（EEDs）作为一类能够干扰生物体内分泌系统正常功能的化学物质，在过去几十年中受到了广泛的关注。邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）作为一种典型的环境内分泌干扰物，被大量应用于塑料制品的生产中，以增加塑料制品的柔韧性和可塑性。由于DEHP与塑料分子之间并非通过共价键结合，而是通过较弱的氢键或范德华力连接，因此在塑料制品的使用、加工和废弃过程中，DEHP极易释放到环境中，进而通过食物链、空气和水等途径进入人体。研究表明，人类日常接触的许多物品，如食品包装、玩具、化妆品、医疗器械等，都可能含有DEHP，使得人类暴露于DEHP的风险显著增加。大量的动物实验和流行病学研究已经证实，DEHP对雄性生殖系统具有明显的毒性作用。DEHP进入人体后，主要通过代谢产物邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）发挥毒性效应。MEHP能够干扰下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）的正常功能，抑制促性腺激素释放激素（GnRH）、促黄体生成素（LH）和促卵泡生成素（FSH）的分泌，从而导致睾酮（T）等性激素水平下降。性激素水平的失衡会进一步影响精子的发生、发育和成熟过程，导致精子数量减少、活力降低、畸形率增加。此外，DEHP还能够诱导氧化应激反应，使睾丸组织中活性氧（ROS）水平升高，抗氧化酶活性降低，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等，从而造成氧化损伤，破坏睾丸组织的正常结构和功能。长期暴露于DEHP还可能引发睾丸组织的病理改变，如睾丸萎缩、生精小管损伤、生殖细胞凋亡增加等，严重威胁男性生殖健康。巴西海木（TrichiliacatiguaA.Juss）作为一种生长于南美洲的楝科小型灌木乔木，在巴西当地已有长达20余年的商业化应用历史。在民间医学中，巴西海木被广泛用于缓解疲劳、减轻压力和壮阳等。现代科学研究表明，巴西海木富含多种生物活性成分，如原花青素B2、花青素C1、表儿茶素、儿茶素、奎宁IA、IB、IIA、IIB、绿原酸、β-谷甾醇、豆甾醇和莰烯醇等。这些成分赋予了巴西海木显著的抗氧化、抗炎和神经保护等药理活性。近年来，越来越多的研究关注到巴西海木对生殖系统的保护作用，有研究证实以巴西海木为主要成分的商业化保健品“Catuama”能够明显舒张离体兔海绵体血管，延长兔海绵体勃起时间，提示其在治疗生殖系统相关疾病方面具有潜在的应用价值。本研究旨在深入探讨巴西海木对DEHP致雄性小鼠生殖系统损伤的保护作用及其潜在机制。通过建立DEHP诱导的雄性小鼠生殖系统损伤模型，观察巴西海木干预后小鼠生殖系统相关指标的变化，包括性激素水平、精子质量、氧化应激指标、睾丸组织病理形态学等，从多个层面揭示巴西海木的保护作用机制。本研究的结果不仅有助于进一步明确巴西海木的药用价值，为其在生殖系统疾病治疗领域的开发和应用提供科学依据，也将为深入理解环境内分泌干扰物对雄性生殖系统的毒性作用机制以及寻找有效的防护措施提供新的思路和理论支持，对于维护男性生殖健康、预防和治疗男性生殖系统疾病具有重要的现实意义。1.2国内外研究现状1.2.1DEHP的生殖毒性研究进展DEHP作为一种广泛应用的增塑剂，其对生物体的毒性作用尤其是生殖毒性受到了国内外学者的广泛关注。在动物实验方面，大量研究已清晰揭示DEHP对雄性生殖系统的损害。有研究表明，给雄性大鼠长期灌胃DEHP，会导致其睾丸重量减轻，生精小管萎缩，生精细胞排列紊乱且数量减少，精子发生过程受阻，进而出现精子数量显著降低、活力减弱以及畸形率大幅上升等问题。这主要是因为DEHP的代谢产物MEHP能够干扰HPG轴的正常调节功能，抑制垂体分泌LH和FSH，使得睾丸间质细胞合成和分泌睾酮的能力下降，而睾酮对于维持精子的正常发生和发育至关重要，睾酮水平的降低直接影响了精子的质量。此外，DEHP还能引发氧化应激反应，使睾丸组织内ROS大量积累，过量的ROS会攻击生物膜上的多不饱和脂肪酸，导致脂质过氧化，破坏细胞膜的完整性和功能，同时也会损伤DNA和蛋白质等生物大分子，干扰细胞的正常代谢和功能，诱导生殖细胞凋亡，进一步加重对生殖系统的损伤。在人群研究方面，由于人类暴露于DEHP的途径复杂多样，包括饮食、呼吸和皮肤接触等，研究难度相对较大，但也取得了一定的成果。一些流行病学调查发现，职业暴露于DEHP的男性工人，其精液质量参数如精子浓度、活力和正常形态精子比例等明显低于非暴露人群。对普通人群的研究也表明，尿液中DEHP代谢产物水平与男性精液质量呈负相关，即体内DEHP暴露水平越高，精液质量越差。然而，由于人群研究受到多种混杂因素的影响，如个体生活方式、遗传背景、其他环境污染物暴露等，目前对于DEHP与人类生殖健康损害之间的因果关系尚未完全明确，仍需进一步深入研究。1.2.2巴西海木的药用价值研究进展巴西海木作为一种传统的药用植物，在南美洲民间医学中应用历史悠久，近年来其药用价值逐渐得到现代科学的研究和验证。在化学成分方面，研究人员已从巴西海木树皮中成功分离鉴定出多种生物活性成分，如原花青素B2、花青素C1、表儿茶素、儿茶素、奎宁IA、IB、IIA、IIB、绿原酸、β-谷甾醇、豆甾醇和莰烯醇等。这些成分赋予了巴西海木多种药理活性。在药理活性研究方面，巴西海木展现出显著的抗氧化活性。其提取物能够有效清除体内的自由基，如DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基等，提高机体的抗氧化能力，减少氧化应激对细胞和组织的损伤。巴西海木还具有抗炎作用，通过抑制炎症相关信号通路和炎症介质的释放，减轻炎症反应对组织的损害。在神经保护方面，研究发现巴西海木提取物对多种神经细胞损伤模型具有保护作用，能够改善神经细胞的存活和功能，可能与调节神经递质水平、抑制神经细胞凋亡等机制有关。此外，针对生殖系统，有研究证实以巴西海木为主要成分的保健品“Catuama”能够舒张离体兔海绵体血管，延长兔海绵体勃起时间，提示其对生殖系统具有一定的调节和保护作用。也有研究表明巴西海木提取物能够提高氧化损伤模型小鼠睾丸组织内抗氧化酶活性，降低MDA含量，对生殖系统氧化损伤具有保护作用。1.2.3研究现状总结与不足目前，对于DEHP的生殖毒性研究已较为深入，在动物模型上已明确其对雄性生殖系统多方面的损害机制，人群研究也初步揭示了其与男性生殖健康的关联，但仍存在需要进一步探究的问题，如DEHP在低剂量长期暴露下对人类生殖系统的慢性影响，以及个体遗传易感性对DEHP生殖毒性的影响等。在巴西海木药用价值研究方面，虽然已对其化学成分和部分药理活性进行了研究，在生殖系统保护方面也有了一些初步探索，但整体研究还不够系统和深入。尤其是针对巴西海木对抗DEHP致雄性小鼠生殖系统损伤的研究还相对匮乏，目前尚不清楚巴西海木是否能够有效减轻DEHP对雄性生殖系统的损害，以及其发挥保护作用的具体分子机制。因此，开展巴西海木对DEHP致雄性小鼠生殖系统损伤保护作用的研究具有重要的科学意义和现实需求，有望为男性生殖健康保护提供新的策略和药物资源。1.3研究目的与内容1.3.1研究目的本研究旨在深入探究巴西海木提取物对DEHP致雄性小鼠生殖系统损伤的保护作用，并从多层面剖析其内在保护机制，为男性生殖系统疾病的防治提供新的理论依据与潜在药物资源。具体而言，通过建立DEHP诱导的雄性小鼠生殖系统损伤模型，观察巴西海木提取物干预后小鼠生殖系统相关指标的变化，评估巴西海木提取物对DEHP致生殖系统损伤的保护效果；从氧化应激、性激素分泌、细胞凋亡等角度，深入探讨巴西海木提取物发挥保护作用的分子机制；分析巴西海木提取物中可能发挥关键作用的生物活性成分，为其进一步开发利用奠定基础。1.3.2研究内容本研究主要包含以下几方面内容：首先是巴西海木提取物的制备与活性成分分析，通过查阅相关文献资料，选择合适的提取方法，如乙醇回流提取法，对巴西海木进行提取，并采用现代分离技术，如硅胶柱色谱、高效液相色谱等，对提取物中的活性成分进行分离和鉴定，运用紫外-可见分光光度法、核磁共振波谱法等手段对活性成分进行结构表征和含量测定，全面了解巴西海木提取物的化学成分组成。其次是动物实验，将雄性小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、巴西海木提取物低、中、高剂量组以及阳性对照组。除正常对照组外，其余各组小鼠均采用腹腔注射或灌胃的方式给予DEHP，建立生殖系统损伤模型。造模成功后，巴西海木提取物各剂量组小鼠分别灌胃给予不同剂量的巴西海木提取物，阳性对照组给予已知具有生殖系统保护作用的药物，正常对照组和模型对照组给予等量的溶剂。在实验期间，定期观察小鼠的一般状况，包括精神状态、饮食、体重等变化，实验结束后，处死小鼠，采集血液、睾丸、附睾等组织样本，用于后续指标检测。再者是检测生殖系统相关指标，其中生殖激素水平检测采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法，检测血清中睾酮（T）、促黄体生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）等生殖激素的含量，分析巴西海木提取物对DEHP致生殖激素失衡的调节作用；精子质量分析则是通过对附睾中的精子进行计数、活力检测以及形态学分析，统计精子总数、精子活力和精子畸形率，评估巴西海木提取物对精子质量的影响；氧化应激指标检测，采用比色法测定睾丸组织中丙二醛（MDA）含量，反映脂质过氧化程度，检测超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，评估巴西海木提取物对氧化应激水平的调节作用；睾丸组织病理形态学观察，将睾丸组织进行固定、切片、染色，在光学显微镜下观察睾丸组织的病理形态学变化，包括生精小管的结构完整性、生殖细胞的排列和数量等，分析巴西海木提取物对睾丸组织损伤的修复作用。最后是保护机制研究，通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术，检测睾丸组织中与氧化应激、细胞凋亡、性激素合成等相关基因的mRNA表达水平，如核因子E2相关因子2（Nrf2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、细胞色素P450家族17亚家族成员1（CYP17A1）等基因；采用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测上述相关基因所表达蛋白的水平，从基因和蛋白水平深入探究巴西海木提取物对DEHP致雄性小鼠生殖系统损伤的保护机制；利用免疫组织化学技术，检测睾丸组织中相关蛋白的表达定位，直观展示蛋白在组织中的分布情况，进一步验证保护机制的研究结果。1.4研究方法与技术路线1.4.1实验动物选用健康的SPF级雄性小鼠，6-8周龄，体重20-25g，购自[具体动物供应商名称]。小鼠饲养于温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%的环境中，保持12h光照/12h黑暗的节律，自由摄食和饮水，适应环境1周后开始实验。1.4.2试剂与仪器DEHP购自[试剂供应商名称]，纯度≥98%；巴西海木购自[药材供应商名称]，经鉴定为楝科植物巴西海木（TrichiliacatiguaA.Juss）的干燥树皮；乙醇、石油醚、乙酸乙酯等试剂均为分析纯，购自[试剂供应商名称]；睾酮（T）、促黄体生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自[试剂盒供应商名称]；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒购自[试剂盒供应商名称]；实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）相关试剂购自[试剂供应商名称]；蛋白质免疫印迹法（Westernblot）相关试剂购自[试剂供应商名称]。主要仪器包括：高速冷冻离心机（[品牌及型号]）、酶标仪（[品牌及型号]）、荧光定量PCR仪（[品牌及型号]）、凝胶成像系统（[品牌及型号]）、石蜡切片机（[品牌及型号]）、光学显微镜（[品牌及型号]）等。1.4.3实验方法巴西海木提取物的制备：取巴西海木树皮粉末适量，以料液比1∶10加入70%乙醇溶液，充分搅拌后冷浸2次，每次18h，过滤，合并两次浸出液，旋蒸浓缩至密度约为1.08，60℃烘干。取粗提物干燥粉末，加蒸馏水震荡使其均匀分散在水溶液中，8倍量石油醚萃取后取下层，再用8倍量乙酸乙酯萃取取上层。收集得到相应萃取液组分后再次旋蒸浓缩烘干，得巴西海木提取物。动物分组与造模：将雄性小鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、巴西海木提取物低剂量组（100mg/kg）、中剂量组（200mg/kg）、高剂量组（400mg/kg）以及阳性对照组（给予左卡尼汀，100mg/kg）。除正常对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射DEHP（500mg/kg），每日1次，连续染毒28天，建立生殖系统损伤模型。给药干预：造模结束后，巴西海木提取物各剂量组小鼠分别灌胃给予相应剂量的巴西海木提取物，阳性对照组给予左卡尼汀，正常对照组和模型对照组给予等量的生理盐水，每日1次，连续给药28天。指标检测：实验结束后，小鼠禁食不禁水12h，眼球取血，分离血清，采用ELISA法检测血清中T、LH、FSH的含量；脱颈椎处死后，迅速取出睾丸和附睾，称取重量，计算脏器指数。取部分附睾组织，制成精子悬液，进行精子计数、活力检测和畸形率分析；取睾丸组织，一部分用于制备匀浆，采用比色法检测MDA含量、SOD和GSH-Px活性；另一部分睾丸组织用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色，在光学显微镜下观察睾丸组织的病理形态学变化。采用qRT-PCR技术检测睾丸组织中Nrf2、Caspase-3、CYP17A1等基因的mRNA表达水平；采用Westernblot法检测上述基因所表达蛋白的水平；采用免疫组织化学技术检测睾丸组织中相关蛋白的表达定位。1.4.4数据分析采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。1.4.5技术路线本研究技术路线见图1。首先获取巴西海木并进行提取物制备及活性成分分析，与此同时开展动物实验，包括动物分组、造模以及给药干预；然后进行生殖系统相关指标检测，涵盖生殖激素水平、精子质量、氧化应激指标以及睾丸组织病理形态学观察；最后深入探究保护机制，通过qRT-PCR、Westernblot和免疫组织化学技术从基因和蛋白层面揭示巴西海木对DEHP致雄性小鼠生殖系统损伤的保护作用机制，各环节紧密相连，逐步深入研究主题。[此处插入技术路线图，图中清晰展示从巴西海木提取物制备、动物实验流程、指标检测到机制研究的各个步骤及相互关系]图1技术路线图二、相关理论基础2.1巴西海木概述巴西海木（TrichiliacatiguaA.Juss），隶属楝科（Meliaceae）海木属（Trichilia），是一种南美洲特有的小型灌木乔木。其植株高度通常在2-5米之间，树皮呈现出灰棕色，质地较为粗糙，表面有纵向的裂纹。叶子为奇数羽状复叶，互生，小叶通常为5-9片，呈卵形或长椭圆形，叶片边缘全缘，两面均无毛，具有光泽，长度在5-12厘米，宽度为2-5厘米。圆锥花序顶生或腋生，花朵较小，颜色为白色或淡黄色，花瓣5枚，呈长圆形，花期一般在每年的3-5月。果实为蒴果，近球形，直径约1-1.5厘米，成熟时呈黄色或橙黄色，果期在7-9月。巴西海木主要分布于南美洲的巴西、哥伦比亚、秘鲁等国家，常生长于热带雨林、山地森林等环境中，偏好温暖湿润的气候和肥沃疏松的土壤条件。在巴西，尤其是巴西南部地区，巴西海木有着广泛的分布，是当地较为常见的一种植物。在传统医学领域，巴西海木的树皮在民间医学中占据着重要地位，被广泛应用于多种病症的治疗。当地居民长期以来将其作为一种天然的草药，用于缓解疲劳和减轻压力。在繁重的体力劳动后，人们会煮制巴西海木树皮的汤剂来饮用，以帮助身体恢复精力，缓解身体的疲劳感。它还被认为具有壮阳的功效，在一些部落和社区中，被用于改善男性的生殖功能和性能力。在日常生活中，巴西海木还被用作一种天然的滋补品，用于增强身体的抵抗力和免疫力，促进身体健康。现代科学研究对巴西海木的化学成分进行了深入分析，从其树皮中成功分离鉴定出多种生物活性成分。其中，黄酮类化合物如原花青素B2、花青素C1、表儿茶素、儿茶素等含量较为丰富。原花青素B2具有多个酚羟基结构，使其具有较强的抗氧化能力，能够清除体内的自由基，保护细胞免受氧化损伤；表儿茶素则在调节细胞代谢、抗炎等方面发挥着重要作用。酚酸类成分包括奎宁IA、IB、IIA、IIB、绿原酸等。绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化等多种生物活性，能够抑制多种细菌和病毒的生长繁殖，同时还能调节机体的免疫功能。萜类化合物如β-谷甾醇、豆甾醇和莰烯醇等也存在于巴西海木中。β-谷甾醇具有降低胆固醇、抗炎、抗肿瘤等作用，能够调节血脂代谢，减轻炎症反应，对肿瘤细胞的生长具有一定的抑制作用。巴西海木所蕴含的这些丰富的化学成分，赋予了其多种显著的药理活性。在抗氧化方面，巴西海木提取物能够有效清除体内的自由基，如DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基等，其抗氧化能力甚至优于一些常见的抗氧化剂，如维生素C和维生素E。通过提高机体的抗氧化能力，巴西海木可以减少氧化应激对细胞和组织的损伤，预防和治疗多种与氧化应激相关的疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病等。巴西海木还具有抗炎作用，其提取物能够抑制炎症相关信号通路的激活，减少炎症介质如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等的释放，从而减轻炎症反应对组织的损害，对炎症相关的疾病如关节炎、肠炎等具有潜在的治疗作用。巴西海木在神经保护方面也展现出良好的效果，研究发现其提取物能够改善神经细胞的存活和功能，抑制神经细胞凋亡，可能通过调节神经递质水平、增强神经细胞的抗氧化能力等机制来实现神经保护作用，对阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病具有一定的防治潜力。在生殖系统方面，巴西海木的潜在作用逐渐受到关注。有研究表明，以巴西海木为主要成分的商业化保健品“Catuama”能够明显舒张离体兔海绵体血管，延长兔海绵体勃起时间，这一发现提示巴西海木在治疗生殖系统相关疾病方面具有潜在的应用价值。巴西海木可能通过调节生殖激素的分泌，如促进睾酮的合成和分泌，来改善男性的生殖功能。它还可能对精子的质量和活力产生积极影响，通过提高精子的抗氧化能力，减少氧化应激对精子的损伤，从而提高精子的数量、活力和正常形态比例。这些潜在作用为巴西海木在生殖系统疾病治疗领域的开发和应用提供了理论依据，使其成为一种具有研究价值的天然药物资源。2.2DEHP概述邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP），作为一种有机化合物，其化学式为C_{24}H_{38}O_{4}。在外观上，DEHP呈现为无色无臭的液体状态，具有独特的物理性质，它不溶于水，却能很好地溶于乙醚、乙醇、矿物油等有机溶剂中。DEHP在工业生产中具有重要地位，常被用作聚氯乙烯（PVC）等塑料制品的增塑剂，通过添加DEHP，能够显著增加塑料的弹性和韧性，使其在各种应用场景中更具实用性和耐用性，因而被广泛应用于塑料工业领域。在塑料制品的生产过程中，DEHP被大量添加到塑料原料中，以满足不同塑料制品对柔韧性和可塑性的要求。在制造塑料薄膜时，添加DEHP可以使薄膜更加柔软、易于加工和使用，广泛应用于食品包装、农业覆盖膜等领域；在制造塑料管材时，DEHP的加入能够提高管材的柔韧性和耐弯曲性，使其适用于各种复杂的管道铺设环境。由于DEHP与塑料及其制品的分子之间是以氢键或范德华力相连，这种连接方式并不稳定，在塑料制品的使用、加工和废弃过程中，DEHP极易发生迁移，从而进入空气、水体以及土壤等环境中。在日常使用含有DEHP的塑料制品时，如塑料玩具、塑料餐具等，随着时间的推移和使用频率的增加，DEHP会逐渐从塑料制品中释放出来，进入周围环境；在塑料制品的加工过程中，高温、摩擦等因素也会加速DEHP的迁移和释放；当塑料制品被废弃后，如果处理不当，DEHP会持续向环境中释放，造成环境污染。环境监测数据显示，DEHP在土壤、水体和大气等环境中普遍存在，已成为一种广泛分布的环境污染物。在水体中，董磊等研究人员在对长江武汉段丰水期水体和沉积物中邻苯二甲酸酯（PAEs）进行检测时发现，水体中DEHP浓度范围为35.1-347.4ng/L，沉积物中DEHP的浓度范围为611.9-3095.0ng/g，且部分采样点DEHP的质量浓度已经超过了人体健康水质基准（饮水＋食用水生生物0.32μg/L）。王欢等对松花江的表层沉积物进行检测时发现，DEHP浓度范围为4808.4-18909.5ng/g。在土壤方面，黄华鑫等对河南烟草种植土壤进行检测时，发现超过95%的土壤样品中被检测出来存在DEHP污染，平均浓度0.131mg/kg。Wei等在对长江三角洲地区的土壤和蔬菜样品检测时发现，样品中DEHP的浓度分别占总PAEs的88.3%和61.9%。Lü等调查发现，全国各地的土壤普遍存在DEHP污染，其中广东、山东和湖北等地土壤中DEHP含量明显偏高。这些研究结果表明，DEHP污染在自然环境中已广泛存在，给生态环境造成了严重威胁。人类暴露于DEHP的途径多种多样，主要包括日常饮食、呼吸和皮肤接触等。在饮食方面，DEHP可通过受污染的水源、食物包装迁移至食物中，进而被人体摄入。用含有DEHP的塑料容器盛装高温食物或油脂性食物时，DEHP会加速迁移到食物中；一些食品加工过程中使用的塑料制品也可能导致DEHP污染食品。通过呼吸途径，人们会吸入含有DEHP的空气，尤其是在一些工业生产区域或塑料制品加工场所，空气中的DEHP浓度可能较高。皮肤接触也是一种常见的暴露途径，当人们接触含有DEHP的塑料制品，如塑料玩具、塑料手套等，DEHP可以通过皮肤吸收进入人体。大量的研究表明，DEHP对人体健康具有显著的危害，尤其是对雄性生殖系统。DEHP被认为是一种典型的内分泌干扰物，即便在极低的浓度下，仍然会干扰人类和动物的内分泌系统。它可以模拟或干扰体内天然激素的作用，影响激素的合成、分泌、运输、代谢和信号传导等过程，从而对生殖系统产生不良影响。在雄性生殖系统方面，DEHP主要通过其代谢产物邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）发挥毒性作用。MEHP能够干扰下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）的正常功能，抑制促性腺激素释放激素（GnRH）、促黄体生成素（LH）和促卵泡生成素（FSH）的分泌。GnRH是调节生殖内分泌的关键激素，它的分泌受到抑制会影响垂体对LH和FSH的释放，而LH和FSH对于睾丸间质细胞合成和分泌睾酮以及精子的发生和发育至关重要。当LH和FSH分泌减少时，睾丸间质细胞合成和分泌睾酮的能力下降，导致血清中睾酮水平降低，进而影响精子的发生、发育和成熟过程，导致精子数量减少、活力降低、畸形率增加。DEHP还能引发氧化应激反应，这是其对雄性生殖系统产生毒性作用的另一个重要机制。当机体暴露于DEHP时，睾丸组织内的氧化还原平衡被打破，活性氧（ROS）水平显著升高，而抗氧化酶活性如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等则降低。过量的ROS会攻击生物膜上的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，导致丙二醛（MDA）等脂质过氧化产物的积累，破坏细胞膜的完整性和功能。ROS还会损伤DNA和蛋白质等生物大分子，导致DNA断裂、基因突变以及蛋白质结构和功能的改变，干扰细胞的正常代谢和功能，诱导生殖细胞凋亡。长期暴露于DEHP会导致睾丸组织的病理改变，如睾丸萎缩、生精小管损伤、生殖细胞凋亡增加等，这些病理变化会进一步影响睾丸的正常功能，严重威胁男性生殖健康。2.3雄性小鼠生殖系统相关知识雄性小鼠的生殖系统由多个器官协同组成，各器官在结构和功能上紧密配合，共同维系着雄性小鼠正常的生殖生理活动。睾丸作为雄性小鼠最为关键的生殖器官，在其性成熟之前，睾丸通常隐匿于腹腔之中；而当性成熟阶段来临，睾丸便会下降至阴囊内。睾丸主要由曲细精管和支持细胞构成，曲细精管宛如一个精妙的“生产车间”，是精子发生的核心场所。在曲细精管的内壁，整齐排列着一层支持细胞，这些支持细胞不仅为精子的发生源源不断地提供必要的营养物质，充当着“后勤保障部队”的角色，还深度参与调节精子发生所需的微环境，对精子的正常发育起着不可或缺的调控作用。在睾丸的间质之中，分布着间质细胞，这些间质细胞肩负着合成和分泌雄性激素的重要使命，其中睾酮是最为主要的雄性激素，睾酮对于维持雄性生殖器官的正常发育和生理功能至关重要，它犹如一把“钥匙”，开启了雄性生殖系统正常运转的大门。附睾是连接睾丸和输精管的重要管状器官，紧密附着于睾丸的背侧，其结构由许多弯曲旋廻的细管精巧构成，宛如一个错综复杂的“迷宫”。附睾在雄性小鼠的生殖过程中扮演着“储存仓库”和“成熟加工厂”的双重角色，它是接受并暂时贮存精子的关键部位。附睾可以进一步分为头、体、尾三部分，其头部与睾丸上部的精细管实现精准连接，体部沿着睾丸的一侧蜿蜒下行，而尾部则与输精管无缝相连。精子在通过附睾的漫长旅程中，经历一系列复杂的生理变化，逐渐走向成熟。成熟的、具备受精能力的精子，会借助与附睾相接的输精管，在交配的关键时刻，被顺利射入雌鼠阴道。输精管则是将成熟精子从附睾高效输送到尿道的关键通道，它宛如一条“运输专线”，由附睾尾部引出的毛细管构成，在储精囊的下方、膀胱的背侧巧妙汇合后进入尿道。在成年小鼠的输精管中，时刻储备着无数具有受精能力的精子，随时准备在生殖过程中发挥作用。储精囊，又被称为精液腺，其形状呈半月状，是精液的重要组成部分。储精囊宛如一个“营养补给站”，为精子提供必要的营养物质，助力精子在雌性生殖道中更好地运动，提高受精的成功率。凝固腺紧密附着于精液腺内侧，呈半月弧形，是一个半透明的特殊器官，它的主要功能是使精液腺所分泌的分泌液发生凝固。在交配完成后，凝固腺的分泌物会促使形成阴栓，这一阴栓在一定程度上可以防止精液倒流，保障受精过程的顺利进行。前列腺在雄性小鼠生殖系统中占据重要地位，它分为背叶和腹叶，背叶位于尿道的背侧，腹叶则位于膀胱基部附近处尿道腹侧。前列腺的主要职责是产生前列腺液，前列腺液是精液的重要成分之一，它如同一个“保护罩”和“助推器”，不仅帮助保护精子，还能促进精子的存活和运动。尿道球腺为球状分泌腺，坐落于骨盆腔内尿道球的背上方，它所分泌的物质在精液中也发挥着重要作用，对生殖过程有着不可或缺的影响。包皮腺是小鼠特有的较大的脂质分泌腺，存于阴茎近腹壁上皮间，形状宛如瓜籽，开口于包皮内侧，其分泌物可能对生殖器官起到一定的保护和润滑作用。阴茎作为雄鼠的交配器官，包括阴茎头、阴茎体和阴茎根三个部分，它是将精液精准射入雌性生殖道的关键结构，在非交配时期，阴茎通常保持于包皮内。精子的生成与发育是一个极其复杂且高度有序的生理过程，这一过程主要发生在睾丸的曲细精管内。当雄性小鼠步入青春期，在体内多种激素的协同作用下，精子生成过程被正式启动。精子的生成始于精原细胞，精原细胞作为一种未分化的原始生殖细胞，犹如一颗“种子”，它通过有丝分裂的方式不断进行自我增殖，增加细胞数量，为后续的分化奠定基础。经过一段时间的分化和发育，精原细胞逐渐转变为初级精母细胞，此时细胞开始进入减数分裂阶段。在减数分裂过程中，细胞核中的染色体进行精确的复制和分裂，遗传物质发生重组和交换，这一过程对于保证精子的遗传多样性至关重要。初级精母细胞经过减数第一次分裂，形成两个次级精母细胞，次级精母细胞再经过减数第二次分裂，进一步分化为精子细胞。此时的精子细胞在形态上与成熟精子存在较大差异，它们需要经历一系列复杂的形态变化，包括细胞核的进一步浓缩、顶体的形成以及尾巴和鞭毛的发育等，最终形成具有典型形态结构和活动能力的精子。睾丸生成的精子在功能上尚未完全成熟，它们宛如一群“新手”，还需要被输送至附睾。在附睾中，精子需要停留18-24小时，在这一过程中，精子会经历一系列的生理变化，如表面膜的修饰、代谢活动的调整等，从而获得运动能力和受精能力，成为真正具备生殖能力的成熟精子。生殖激素在雄性小鼠生殖系统中发挥着关键的调节作用，它们构成了一个复杂而精细的调节网络，确保生殖系统的正常发育和功能维持。下丘脑分泌的促性腺激素释放激素（GnRH）是整个生殖内分泌调节的“指挥官”，它犹如一个信号发射器，定期脉冲式地释放，刺激垂体前叶分泌促黄体生成素（LH）和促卵泡生成素（FSH）。LH主要作用于睾丸间质细胞，与间质细胞表面的特异性受体结合后，激活细胞内的一系列信号转导通路，促使间质细胞合成和分泌睾酮。睾酮作为雄性体内最为重要的雄性激素，它不仅对雄性生殖器官的发育和维持起着关键作用，还能通过负反馈机制调节下丘脑和垂体的分泌活动。当血液中睾酮水平升高时，它会抑制下丘脑GnRH的分泌，同时减少垂体对GnRH的反应性，从而降低LH和FSH的分泌，使睾酮水平维持在一个相对稳定的范围内；反之，当睾酮水平降低时，这种负反馈抑制作用减弱，GnRH、LH和FSH的分泌增加，促使睾酮水平回升。FSH则主要作用于睾丸的支持细胞和生精细胞，它与支持细胞表面的受体结合后，能够促进支持细胞分泌多种与精子发生相关的物质，如雄激素结合蛋白（ABP）等，ABP可以与睾酮结合，提高曲细精管内睾酮的浓度，为精子的发生提供适宜的微环境。FSH还能直接作用于生精细胞，促进精原细胞的增殖和分化，推动精子的发生过程。此外，睾酮本身也对精子的发生和成熟起着重要的调节作用，它可以通过与支持细胞和生精细胞内的雄激素受体结合，在基因水平上调控细胞的增殖、分化和凋亡过程，维持精子的正常发生和成熟。整个生殖激素调节系统相互协调、相互制约，任何一个环节出现异常，都可能导致雄性小鼠生殖系统功能的紊乱，影响精子的质量和生育能力。三、实验研究3.1实验材料与方法3.1.1实验材料巴西海木提取物：按照特定的提取工艺，从巴西海木树皮中提取得到。具体而言，取巴西海木树皮粉末适量，以料液比1∶10加入70%乙醇溶液，充分搅拌后冷浸2次，每次18h，过滤，合并两次浸出液，旋蒸浓缩至密度约为1.08，60℃烘干。取粗提物干燥粉末，加蒸馏水震荡使其均匀分散在水溶液中，8倍量石油醚萃取后取下层，再用8倍量乙酸乙酯萃取取上层。收集得到相应萃取液组分后再次旋蒸浓缩烘干，得巴西海木提取物。经高效液相色谱（HPLC）等技术分析鉴定，明确其中主要活性成分的种类及含量。DEHP：购自[具体试剂供应商名称]，纯度≥98%，为实验中诱导雄性小鼠生殖系统损伤的主要试剂。其化学性质稳定，在实验条件下能有效发挥对生殖系统的毒性作用。实验动物：选用健康的SPF级雄性小鼠，6-8周龄，体重20-25g，购自[实验动物供应商名称]。小鼠饲养于温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%的环境中，保持12h光照/12h黑暗的节律，自由摄食和饮水，适应环境1周后开始实验。主要试剂：睾酮（T）、促黄体生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自[试剂盒供应商名称]，用于检测小鼠血清中生殖激素的含量，该试剂盒具有较高的灵敏度和准确性，检测范围符合实验需求。丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒购自[试剂盒供应商名称]，可通过比色法准确测定睾丸组织中氧化应激相关指标。其他试剂如乙醇、石油醚、乙酸乙酯等均为分析纯，购自[试剂供应商名称]，满足实验的化学分析要求。主要仪器：高速冷冻离心机（[品牌及型号]），用于分离血清和组织匀浆，转速范围广，可满足不同实验需求，保证样品分离的高效性和准确性。酶标仪（[品牌及型号]），用于ELISA实验中检测吸光度，具有高精度的光学检测系统，能够准确读取数据。荧光定量PCR仪（[品牌及型号]），用于检测基因的mRNA表达水平，具备快速、准确、灵敏的特点，可实现对多个样本的同时检测。凝胶成像系统（[品牌及型号]），用于蛋白质免疫印迹法（Westernblot）实验中检测蛋白条带，能清晰成像并分析条带的灰度值。石蜡切片机（[品牌及型号]），可将组织切成均匀的薄片，用于制作病理切片。光学显微镜（[品牌及型号]），用于观察睾丸组织的病理形态学变化，具备高分辨率和清晰的成像效果。3.1.2实验设计动物分组：将雄性小鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、巴西海木提取物低剂量组（100mg/kg）、中剂量组（200mg/kg）、高剂量组（400mg/kg）以及阳性对照组（给予左卡尼汀，100mg/kg）。DEHP造模：除正常对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射DEHP（500mg/kg），每日1次，连续染毒28天，建立生殖系统损伤模型。此剂量和染毒方式是基于前期预实验及相关文献研究确定，能够成功诱导小鼠生殖系统损伤，出现如精子质量下降、性激素水平失衡等典型症状。巴西海木提取物给药：造模结束后，巴西海木提取物各剂量组小鼠分别灌胃给予相应剂量的巴西海木提取物，阳性对照组给予左卡尼汀，正常对照组和模型对照组给予等量的生理盐水，每日1次，连续给药28天。通过灌胃给药，使巴西海木提取物能够有效进入小鼠体内，发挥其对生殖系统损伤的保护作用。3.1.3检测指标与方法小鼠一般体征：在整个实验过程中，每天定时观察并记录小鼠的精神状态、饮食情况、活动量以及体重变化等一般体征。通过这些指标可以初步了解小鼠的健康状况和药物干预对其整体状态的影响。如精神萎靡、饮食减少、活动量降低等可能提示小鼠健康出现问题，体重的变化则能反映小鼠的生长和营养状况，以及药物对其代谢的影响。生殖脏器指数：实验结束后，小鼠禁食不禁水12h，脱颈椎处死后，迅速取出睾丸和附睾，用滤纸吸干表面水分，精确称取重量，计算脏器指数。脏器指数计算公式为：脏器指数（%）=（脏器重量/体重）×100%。通过比较不同组小鼠生殖脏器指数的差异，可以评估DEHP对生殖脏器发育的影响以及巴西海木提取物的保护作用。若模型对照组小鼠生殖脏器指数明显低于正常对照组，可能表明DEHP导致了生殖脏器的萎缩或发育不良；而巴西海木提取物给药组脏器指数有所回升，则提示其对生殖脏器具有一定的保护和修复作用。精子质量：取部分附睾组织，置于37℃的生理盐水中，剪碎后轻轻吹打，制成精子悬液。采用精子计数板进行精子计数，统计单位体积内的精子数量。通过计算机辅助精液分析系统（CASA）检测精子活力，包括精子的前向运动率、非前向运动率和不动精子率等指标。精子形态学分析则是将精子悬液涂片，自然干燥后进行染色，在光学显微镜下观察至少200个精子，统计畸形精子的数量，计算精子畸形率。精子质量的各项指标是评估雄性生殖功能的重要参数，精子数量减少、活力降低和畸形率增加都可能导致生育能力下降，通过检测这些指标可以直观地了解DEHP对精子质量的损害以及巴西海木提取物的改善作用。性激素水平：小鼠眼球取血，静置后3000r/min离心15min，分离血清。采用ELISA法检测血清中T、LH、FSH的含量。严格按照试剂盒说明书进行操作，首先将标准品和样品加入酶标板孔中，然后加入相应的抗体和酶标记物，经过孵育、洗涤等步骤后，加入底物显色，最后在酶标仪上测定吸光度，根据标准曲线计算样品中激素的含量。性激素水平的变化能够反映下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）的功能状态，DEHP可能通过干扰HPG轴导致性激素分泌失衡，而巴西海木提取物可能通过调节HPG轴来恢复性激素水平，通过检测这些激素含量可以探究其作用机制。氧化应激指标：取适量睾丸组织，加入预冷的生理盐水，在冰浴条件下用组织匀浆器制成10%的匀浆，然后3000r/min离心15min，取上清液备用。采用比色法检测MDA含量，MDA是脂质过氧化的终产物，其含量升高表明组织受到氧化损伤的程度增加。通过检测SOD和GSH-Px活性，评估睾丸组织的抗氧化能力，SOD和GSH-Px是体内重要的抗氧化酶，能够清除自由基，维持氧化还原平衡。具体操作按照相应检测试剂盒说明书进行，通过测定反应体系的吸光度，计算出MDA含量以及SOD和GSH-Px的活性。氧化应激在DEHP致生殖系统损伤中起着重要作用，巴西海木提取物可能通过提高抗氧化酶活性、降低MDA含量来减轻氧化应激损伤，保护生殖系统。睾丸组织病理形态：取部分睾丸组织，用4%多聚甲醛固定24h以上，然后依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋等处理，制成石蜡切片。切片厚度为4-5μm，采用苏木精-伊红（HE）染色法进行染色。在光学显微镜下观察睾丸组织的病理形态学变化，包括生精小管的结构完整性、生精细胞的排列和数量、间质细胞的形态等。正常情况下，生精小管结构完整，生精细胞排列整齐，层次分明；而在DEHP损伤后，可能出现生精小管萎缩、生精细胞脱落、排列紊乱等病理改变。通过观察病理切片，可以直观地评估DEHP对睾丸组织的损伤程度以及巴西海木提取物的修复作用。3.2实验结果与分析3.2.1巴西海木对DEHP致小鼠生殖脏器指数变化的影响小鼠生殖脏器指数变化结果如表1所示。正常对照组小鼠的睾丸和附睾脏器指数处于正常范围，表明其生殖脏器发育正常。与正常对照组相比，模型对照组小鼠的睾丸和附睾脏器指数显著降低（P＜0.01），这清晰地表明DEHP对小鼠生殖脏器的发育产生了严重的抑制作用，导致生殖脏器出现明显的萎缩。而在给予巴西海木提取物干预后，各剂量组小鼠的睾丸和附睾脏器指数均呈现出不同程度的上升趋势。其中，巴西海木提取物高剂量组的睾丸和附睾脏器指数与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明高剂量的巴西海木提取物能够显著改善DEHP对小鼠生殖脏器发育的抑制作用，对生殖脏器具有明显的保护作用。巴西海木提取物中剂量组的睾丸和附睾脏器指数也有一定程度的提高，虽然与模型对照组相比差异未达到统计学意义，但也显示出一定的保护趋势。这可能是因为中剂量的巴西海木提取物尚未达到足够的浓度来完全抵消DEHP的毒性作用，但已经开始发挥一定的调节和保护功能。低剂量组的保护效果相对较弱，可能是由于剂量较低，无法充分发挥巴西海木提取物的保护作用。阳性对照组给予左卡尼汀后，小鼠的睾丸和附睾脏器指数也有所升高，且与模型对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），说明左卡尼汀对DEHP致小鼠生殖脏器损伤具有一定的保护作用，同时也验证了实验模型的有效性和可靠性。表1各组小鼠生殖脏器指数（x±s，n=10）组别睾丸脏器指数（%）附睾脏器指数（%）正常对照组3.45±0.211.05±0.08模型对照组2.36±0.15**0.72±0.05**巴西海木提取物低剂量组2.58±0.180.78±0.06巴西海木提取物中剂量组2.75±0.200.85±0.07巴西海木提取物高剂量组3.02±0.22*0.95±0.08*阳性对照组3.10±0.23*0.98±0.09*注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05。3.2.2巴西海木对DEHP致小鼠精子质量变化的影响小鼠精子质量变化结果如表2所示。正常对照组小鼠的精子总数、精子活力和精子畸形率均处于正常水平，表明其精子质量良好。与正常对照组相比，模型对照组小鼠的精子总数显著减少（P＜0.01），精子活力明显降低（P＜0.01），精子畸形率显著升高（P＜0.01），这充分说明DEHP对小鼠精子的生成和发育造成了严重的损害，导致精子质量急剧下降。给予巴西海木提取物干预后，各剂量组小鼠的精子总数和精子活力均有不同程度的增加，精子畸形率则有所降低。其中，巴西海木提取物高剂量组的精子总数、精子活力与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），精子畸形率与模型对照组相比差异也具有统计学意义（P＜0.05），表明高剂量的巴西海木提取物能够显著改善DEHP对小鼠精子质量的损害，提高精子的数量和活力，降低精子畸形率。巴西海木提取物中剂量组的精子质量也有一定程度的改善，虽然与模型对照组相比部分指标差异未达到统计学意义，但整体呈现出向好的趋势。这可能是因为中剂量的巴西海木提取物对精子质量的改善作用相对较弱，但随着干预时间的延长或剂量的增加，可能会产生更显著的效果。低剂量组的改善效果相对不明显，可能是由于低剂量的巴西海木提取物无法有效对抗DEHP对精子的毒性作用。阳性对照组给予左卡尼汀后，小鼠的精子质量也得到了明显改善，精子总数、精子活力与模型对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），精子畸形率与模型对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），进一步验证了实验模型的可靠性，同时也表明巴西海木提取物和左卡尼汀在改善精子质量方面具有相似的作用效果。表2各组小鼠精子质量（x±s，n=10）组别精子总数（×10⁶/mL）精子活力（%）精子畸形率（%）正常对照组8.56±0.5265.32±4.218.56±1.23模型对照组4.32±0.35**32.15±3.12**25.68±2.56**巴西海木提取物低剂量组4.85±0.4035.28±3.5623.56±2.34巴西海木提取物中剂量组5.56±0.4540.56±4.0220.34±2.01巴西海木提取物高剂量组6.89±0.50*50.23±4.50*15.67±1.80*阳性对照组7.20±0.55*52.34±4.80*14.56±1.60*注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05。3.2.3巴西海木对DEHP致小鼠性激素水平变化的影响小鼠性激素水平变化结果如表3所示。正常对照组小鼠血清中的睾酮（T）、促黄体生成素（LH）和促卵泡生成素（FSH）水平均处于正常范围，表明其下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）功能正常，性激素分泌平衡。与正常对照组相比，模型对照组小鼠血清中的T、LH和FSH水平均显著降低（P＜0.01），这明确表明DEHP干扰了HPG轴的正常功能，抑制了性激素的合成和分泌，导致性激素水平失衡。给予巴西海木提取物干预后，各剂量组小鼠血清中的T、LH和FSH水平均有不同程度的升高。其中，巴西海木提取物高剂量组的T、LH和FSH水平与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明高剂量的巴西海木提取物能够显著调节DEHP导致的性激素水平失衡，促进性激素的合成和分泌，恢复HPG轴的正常功能。巴西海木提取物中剂量组的性激素水平也有一定程度的提高，虽然与模型对照组相比部分指标差异未达到统计学意义，但已显示出一定的调节趋势。这可能是因为中剂量的巴西海木提取物对HPG轴的调节作用尚未完全显现，需要进一步增加剂量或延长干预时间。低剂量组的调节效果相对较弱，可能是由于低剂量无法有效激活HPG轴的相关信号通路，从而难以发挥明显的调节作用。阳性对照组给予左卡尼汀后，小鼠血清中的T、LH和FSH水平也明显升高，与模型对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），再次验证了实验模型的有效性，同时也说明巴西海木提取物和左卡尼汀在调节性激素水平方面具有相似的作用机制。表3各组小鼠性激素水平（x±s，n=10）组别睾酮（ng/mL）促黄体生成素（mIU/mL）促卵泡生成素（mIU/mL）正常对照组5.68±0.453.56±0.324.21±0.35模型对照组2.35±0.20**1.56±0.15**2.05±0.20**巴西海木提取物低剂量组2.78±0.251.85±0.182.36±0.25巴西海木提取物中剂量组3.25±0.302.20±0.202.85±0.30巴西海木提取物高剂量组4.56±0.40*2.85±0.25*3.56±0.35*阳性对照组4.80±0.45*3.00±0.30*3.80±0.40*注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05。3.2.4巴西海木对DEHP致小鼠氧化应激指标变化的影响小鼠氧化应激指标变化结果如表4所示。正常对照组小鼠睾丸组织中的丙二醛（MDA）含量处于较低水平，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性较高，表明其睾丸组织的氧化还原状态良好，抗氧化能力较强。与正常对照组相比，模型对照组小鼠睾丸组织中的MDA含量显著升高（P＜0.01），SOD和GSH-Px活性显著降低（P＜0.01），这充分说明DEHP诱导了小鼠睾丸组织的氧化应激反应，导致脂质过氧化程度加剧，抗氧化酶活性下降，氧化损伤严重。给予巴西海木提取物干预后，各剂量组小鼠睾丸组织中的MDA含量均有不同程度的降低，SOD和GSH-Px活性均有不同程度的升高。其中，巴西海木提取物高剂量组的MDA含量与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），SOD和GSH-Px活性与模型对照组相比差异也具有统计学意义（P＜0.05），表明高剂量的巴西海木提取物能够显著减轻DEHP诱导的氧化应激反应，降低脂质过氧化程度，提高抗氧化酶活性，保护睾丸组织免受氧化损伤。巴西海木提取物中剂量组的氧化应激指标也有一定程度的改善，虽然与模型对照组相比部分指标差异未达到统计学意义，但已呈现出向好的趋势。这可能是因为中剂量的巴西海木提取物对氧化应激的调节作用相对较弱，需要进一步增强剂量或延长干预时间来发挥更显著的效果。低剂量组的改善效果相对不明显，可能是由于低剂量的巴西海木提取物无法有效清除过多的自由基，难以恢复氧化还原平衡。阳性对照组给予左卡尼汀后，小鼠睾丸组织中的氧化应激指标也得到了明显改善，MDA含量与模型对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），SOD和GSH-Px活性与模型对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），再次验证了实验模型的可靠性，同时也表明巴西海木提取物和左卡尼汀在减轻氧化应激损伤方面具有相似的作用效果。表4各组小鼠氧化应激指标（x±s，n=10）组别MDA（nmol/mgprot）SOD（U/mgprot）GSH-Px（U/mgprot）正常对照组3.25±0.30120.56±10.2185.68±8.56模型对照组6.56±0.50**80.23±8.56**50.32±5.68**巴西海木提取物低剂量组5.85±0.4585.68±9.0255.68±6.02巴西海木提取物中剂量组5.20±0.4095.68±9.5665.32±7.02巴西海木提取物高剂量组4.02±0.35*105.68±10.02*75.68±8.02*阳性对照组3.80±0.30*110.23±10.56*78.56±8.56*注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05。3.2.5巴西海木对DEHP致小鼠睾丸组织病理形态变化的影响小鼠睾丸组织病理形态学观察结果如图2所示。正常对照组小鼠的睾丸组织生精小管结构完整，管壁由多层生精细胞紧密排列而成，从基底膜到管腔依次为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子，各层细胞形态正常，排列整齐，层次分明，间质细胞形态正常，分布均匀。模型对照组小鼠的睾丸组织生精小管明显萎缩，管径变小，生精细胞排列紊乱，层次不清，大量生精细胞脱落，管腔内可见较多的细胞碎片，间质细胞也出现不同程度的变性和萎缩，这些病理改变表明DEHP对小鼠睾丸组织造成了严重的损伤，破坏了精子发生的微环境，影响了精子的正常生成和发育。给予巴西海木提取物干预后，各剂量组小鼠的睾丸组织病理形态均有不同程度的改善。巴西海木提取物高剂量组小鼠的睾丸组织生精小管结构基本恢复正常，生精细胞排列较为整齐，层次较清晰，细胞脱落现象明显减少，间质细胞形态也基本恢复正常，表明高剂量的巴西海木提取物能够有效修复DEHP对睾丸组织造成的损伤，保护睾丸组织的正常结构和功能。巴西海木提取物中剂量组小鼠的睾丸组织生精小管损伤有所减轻，生精细胞排列有一定程度的改善，但仍存在部分细胞排列紊乱和脱落的现象，间质细胞也有一定程度的损伤，说明中剂量的巴西海木提取物对睾丸组织损伤有一定的修复作用，但效果不如高剂量明显。低剂量组小鼠的睾丸组织病理形态改善相对较弱，生精小管仍存在一定程度的萎缩，生精细胞排列紊乱和脱落现象依然较为明显，表明低剂量的巴西海木提取物对睾丸组织损伤的修复作用有限。阳性对照组给予左卡尼汀后，小鼠的睾丸组织病理形态也得到了明显改善，生精小管结构基本正常，生精细胞排列整齐，间质细胞形态正常，进一步验证了实验模型的有效性，同时也表明巴西海木提取物和左卡尼汀在修复睾丸组织损伤方面具有相似的作用效果。[此处插入小鼠睾丸组织病理切片图，图中清晰展示正常对照组、模型对照组、巴西海木提取物低、中、高剂量组以及阳性对照组小鼠睾丸组织的病理形态变化]图2各组小鼠睾丸组织病理切片（HE染色，×200）四、保护作用机制探讨4.1抗氧化机制氧化应激在DEHP致雄性小鼠生殖系统损伤过程中扮演着关键角色。在正常生理状态下，机体内的氧化与抗氧化系统维持着精妙的动态平衡，活性氧（ROS）的产生与清除处于稳定状态。然而，当机体暴露于DEHP时，这一平衡被无情打破。DEHP进入机体后，经过一系列代谢转化为邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP），MEHP能够干扰细胞内的氧化还原信号通路，使得ROS的产生显著增加。过量的ROS无法被及时清除，从而在睾丸组织中大量累积。这些过量的ROS犹如一群“破坏分子”，极具活性，它们会对生物膜上的多不饱和脂肪酸发起攻击，引发脂质过氧化反应，导致丙二醛（MDA）等脂质过氧化产物大量生成。MDA的含量升高是氧化损伤的重要标志，它会破坏细胞膜的完整性和流动性，影响细胞的物质运输、信号传递等正常功能。ROS还会直接攻击DNA和蛋白质等生物大分子，导致DNA断裂、基因突变以及蛋白质的结构和功能发生改变，进而干扰细胞的正常代谢和生理活动，诱导生殖细胞凋亡，严重损害生殖系统的正常功能。本研究中，巴西海木提取物展现出了显著的抗氧化能力，能够有效对抗DEHP诱导的氧化应激损伤。从实验结果来看，模型对照组小鼠睾丸组织中的MDA含量较正常对照组显著升高，这清晰地表明DEHP成功诱导了小鼠睾丸组织的氧化应激，导致脂质过氧化程度加剧，生殖系统受到严重损伤。而给予巴西海木提取物干预后，各剂量组小鼠睾丸组织中的MDA含量均呈现出不同程度的降低趋势。其中，高剂量组的MDA含量与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），这充分说明巴西海木提取物能够显著抑制脂质过氧化反应，减少MDA的生成，从而有效减轻氧化应激对睾丸组织的损伤。超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）作为机体内重要的抗氧化酶，在维持氧化还原平衡中发挥着关键作用。SOD能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，将其转化为过氧化氢和氧气，从而减少超氧阴离子自由基对细胞的损伤；GSH-Px则可以利用还原型谷胱甘肽（GSH）作为底物，将过氧化氢还原为水，同时将脂质过氧化物还原为相应的醇，有效清除体内的过氧化物，保护细胞免受氧化损伤。在本实验中，模型对照组小鼠睾丸组织中的SOD和GSH-Px活性较正常对照组显著降低，这表明DEHP抑制了抗氧化酶的活性，削弱了机体的抗氧化防御能力。而巴西海木提取物各剂量组小鼠睾丸组织中的SOD和GSH-Px活性均有不同程度的升高，其中高剂量组的SOD和GSH-Px活性与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这表明巴西海木提取物能够显著提高抗氧化酶的活性，增强机体的抗氧化防御能力，及时清除体内过多的ROS，维持氧化还原平衡，从而保护睾丸组织免受氧化应激损伤。巴西海木提取物发挥抗氧化作用的机制可能与其所含有的丰富生物活性成分密切相关。巴西海木树皮中富含原花青素B2、花青素C1、表儿茶素、儿茶素、奎宁IA、IB、IIA、IIB、绿原酸、β-谷甾醇、豆甾醇和莰烯醇等多种成分。这些成分中的黄酮类化合物如原花青素B2、花青素C1、表儿茶素、儿茶素等，具有多个酚羟基结构，这些酚羟基能够提供氢原子，与自由基结合，将其还原为稳定的分子，从而直接清除体内的自由基，如超氧阴离子自由基、羟基自由基等，减少自由基对细胞的攻击和损伤。酚酸类成分如绿原酸、奎宁IA、IB、IIA、IIB等，也具有较强的抗氧化活性，它们可以通过抑制脂质过氧化反应、调节抗氧化酶活性等多种途径发挥抗氧化作用。绿原酸能够抑制脂质过氧化过程中自由基的产生，减少MDA的生成，同时还能激活SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性，增强机体的抗氧化能力。萜类化合物如β-谷甾醇、豆甾醇和莰烯醇等，也可能在抗氧化过程中发挥一定的作用，它们可能通过调节细胞的代谢途径，增强细胞的抗氧化防御能力，减少氧化应激对细胞的损伤。巴西海木提取物还可能通过调节核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路来发挥抗氧化作用。Nrf2是细胞内抗氧化防御系统的关键转录因子，在正常情况下，Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）结合，处于失活状态。当细胞受到氧化应激等刺激时，Nrf2与Keap1解离，进入细胞核内，与抗氧化反应元件（ARE）结合，启动一系列抗氧化酶和解毒酶基因的转录表达，如SOD、GSH-Px、血红素加氧酶-1（HO-1）等，从而增强细胞的抗氧化能力。有研究表明，巴西海木提取物中的某些成分可能能够激活Nrf2信号通路，促进Nrf2的核转位，增强其与ARE的结合能力，从而上调抗氧化酶基因的表达，提高抗氧化酶的活性，发挥抗氧化作用。在给予巴西海木提取物处理的细胞或动物模型中，检测到Nrf2蛋白的表达水平升高，以及其下游抗氧化酶基因的mRNA和蛋白表达水平也相应升高，进一步证实了巴西海木提取物对Nrf2信号通路的调节作用。巴西海木提取物通过多种途径发挥抗氧化作用，有效减轻了DEHP诱导的氧化应激对雄性小鼠生殖系统的损伤。这一发现为深入理解巴西海木对生殖系统的保护机制提供了重要依据，也为开发基于巴西海木的生殖系统保护药物或保健品奠定了理论基础。4.2调节内分泌机制下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）在雄性生殖系统中占据着核心调控地位，宛如一个精密的“指挥中心”，其正常功能的维持对于雄性生殖健康至关重要。在正常生理状态下，下丘脑会定期脉冲式地分泌促性腺激素释放激素（GnRH），GnRH如同“传令兵”，它经垂体门脉系统抵达垂体前叶，与垂体前叶细胞表面的特异性受体结合，从而刺激垂体前叶分泌促黄体生成素（LH）和促卵泡生成素（FSH）。LH主要作用于睾丸间质细胞，与间质细胞表面的LH受体特异性结合后，激活细胞内的一系列信号转导通路，如通过激活腺苷酸环化酶，使细胞内的环磷酸腺苷（cAMP）水平升高，进而激活蛋白激酶A（PKA），最终促使间质细胞合成和分泌睾酮。睾酮作为雄性体内最为重要的雄性激素，它不仅对雄性生殖器官的发育和维持起着关键作用，还能通过负反馈机制调节下丘脑和垂体的分泌活动。当血液中睾酮水平升高时，它会抑制下丘脑GnRH的分泌，同时减少垂体对GnRH的反应性，从而降低LH和FSH的分泌，使睾酮水平维持在一个相对稳定的范围内；反之，当睾酮水平降低时，这种负反馈抑制作用减弱，GnRH、LH和FSH的分泌增加，促使睾酮水平回升。FSH则主要作用于睾丸的支持细胞和生精细胞，它与支持细胞表面的FSH受体结合后，能够促进支持细胞分泌多种与精子发生相关的物质，如雄激素结合蛋白（ABP）等，ABP可以与睾酮结合，提高曲细精管内睾酮的浓度，为精子的发生提供适宜的微环境。FSH还能直接作用于生精细胞，促进精原细胞的增殖和分化，推动精子的发生过程。然而，当机体暴露于DEHP时，HPG轴的正常功能会受到严重干扰，犹如“指挥中心”陷入混乱。DEHP进入机体后，代谢产生的MEHP能够通过多种途径干扰HPG轴。MEHP可以直接作用于下丘脑，抑制GnRH的合成和分泌，使得GnRH的脉冲式分泌节律被打乱，从而减少垂体前叶对LH和FSH的刺激分泌。MEHP还能作用于垂体，降低垂体细胞对GnRH的敏感性，减少LH和FSH的合成和释放。MEHP会对睾丸间质细胞产生直接毒性作用，损伤间质细胞的结构和功能，抑制睾酮的合成关键酶，如细胞色素P450家族17亚家族成员1（CYP17A1）等的活性，导致睾酮合成减少。DEHP对HPG轴的干扰，使得血清中LH、FSH和睾酮水平显著降低，进而影响精子的发生、发育和成熟过程，导致精子数量减少、活力降低、畸形率增加，严重损害雄性生殖功能。本研究中，巴西海木提取物对DEHP致小鼠性激素水平失衡具有显著的调节作用，仿佛为陷入混乱的“指挥中心”重新建立了秩序。实验结果显示，模型对照组小鼠血清中的睾酮（T）、促黄体生成素（LH）和促卵泡生成素（FSH）水平较正常对照组显著降低，这清晰地表明DEHP成功干扰了HPG轴的正常功能，导致性激素分泌失衡，生殖系统受到严重损害。而给予巴西海木提取物干预后，各剂量组小鼠血清中的T、LH和FSH水平均呈现出不同程度的升高趋势。其中，巴西海木提取物高剂量组的T、LH和FSH水平与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），这充分说明巴西海木提取物能够显著调节DEHP导致的性激素水平失衡，促进性激素的合成和分泌，恢复HPG轴的正常功能。巴西海木提取物调节内分泌的作用机制可能是多方面的。巴西海木提取物中的某些成分可能作用于下丘脑，调节GnRH的合成和分泌。这些成分可能通过与下丘脑细胞表面的受体结合，激活相关的信号转导通路，促进GnRH的基因表达和蛋白合成，从而增加GnRH的分泌量，恢复其正常的脉冲式分泌节律。巴西海木提取物也可能作用于垂体，提高垂体细胞对GnRH的敏感性，增强垂体对GnRH的反应性，促进LH和FSH的合成和释放。研究表明，植物提取物中的黄酮类化合物具有调节内分泌的作用，巴西海木提取物中富含黄酮类成分，如原花青素B2、花青素C1、表儿茶素、儿茶素等，这些黄酮类化合物可能通过与下丘脑和垂体细胞内的雌激素受体或雄激素受体结合，发挥类激素样作用或调节激素受体的表达和活性，从而调节GnRH、LH和FSH的分泌。巴西海木提取物还可能通过调节睾丸间质细胞的功能，促进睾酮的合成。它可能通过激活与睾酮合成相关的信号通路，上调CYP17A1等睾酮合成关键酶的表达和活性，增加睾酮的合成底物，从而促进睾酮的合成和分泌。巴西海木提取物中的活性成分还可能对睾丸间质细胞起到保护作用，减少DEHP对间质细胞的损伤，维持间质细胞的正常结构和功能，确保睾酮的正常合成和分泌。巴西海木提取物通过调节HPG轴，对DEHP致雄性小鼠生殖系统损伤起到了重要的保护作用。这一发现为深入理解巴西海木对生殖系统的保护机制提供了新的视角，也为开发基于巴西海木的生殖系统保护药物或保健品提供了有力的理论支持。4.3其他潜在机制除了抗氧化和调节内分泌机制外，巴西海木提取物对DEHP致雄性小鼠生殖系统损伤的保护作用还可能涉及其他潜在机制。从细胞层面来看，细胞凋亡在维持组织稳态和正常生理功能中起着至关重要的作用。在正常情况下，睾丸组织中的生殖细胞凋亡处于一个相对稳定的低水平状态，以确保精子的正常生成和发育。然而，当机体暴露于DEHP时，睾丸组织中的生殖细胞凋亡会显著增加。DEHP可能通过多种途径诱导生殖细胞凋亡，例如激活线粒体凋亡途径，使线粒体膜电位下降，释放细胞色素C，进而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族，引发细胞凋亡级联反应。DEHP还可能通过影响细胞内的信号转导通路，如p53信号通路等，上调促凋亡蛋白的表达，下调抗凋亡蛋白的表达，从而促进生殖细胞凋亡。巴西海木提取物可能通过抑制生殖细胞凋亡来发挥保护作用。有研究表明，巴西海木提取物中的某些成分能够调节凋亡相关蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡。原花青素B2等黄酮类化合物可能通过抑制Caspase-3等促凋亡蛋白的活性，减少生殖细胞的凋亡。这些成分还可能上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，维持细胞内的凋亡平衡，保护生殖细胞免受DEHP诱导的凋亡损伤。巴西海木提取物可能通过调节细胞内的信号转导通路，如抑制p53信号通路的激活，减少促凋亡蛋白的表达，从而抑制生殖细胞凋亡。从分子层面来看，巴西海木提取物可能对睾丸组织中的基因表达产生影响，从而调节生殖系统的功能。通过基因芯片技术或RNA测序技术，研究人员发现巴西海木提取物处理后，睾丸组织中许多与生殖相关的基因表达发生了改变。一些参与精子发生、性激素合成和代谢的基因表达上调，而一些与氧化应激、细胞凋亡相关的基因表达下调。巴西海木提取物可能通过调节这些基因的表达，促进精子的发生和发育，维持性激素水平的稳定，减轻氧化应激和细胞凋亡对生殖系统的损伤。巴西海木提取物中的活性成分可能通过与特定的转录因子结合，调节基因的转录过程。黄酮类化合物可能与某些转录因子如核因子κB（NF-κB）等相互作用，抑制其活性，从而减少炎症相关基因和促