幽门螺杆菌感应调节蛋白CrdR：原核表达解析与酸适应调控机制探究

幽门螺杆菌感应调节蛋白CrdR：原核表达解析与酸适应调控机制探究一、引言1.1研究背景幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，H.pylori）是一种主要生存在人的胃部及十二指肠内的革兰氏阴性菌，呈螺旋状或S形、弧形。2023年发布的《中国幽门螺杆菌感染防控》白皮书指出，中国幽门螺杆菌人群感染率近50%，不同人群感染率在35.4%-66.4%之间，具有人群感染率高、疾病负担重、耐药率高的特征。幽门螺杆菌与多种严重疾病的发生发展密切相关。它是导致慢性胃炎、消化性溃疡的主要病因，长期感染幽门螺杆菌会引发胃黏膜反复炎症，进而造成胃及十二指肠黏膜的损伤，形成溃疡。世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，幽门螺杆菌被列为第Ⅰ类生物致癌因子，它引发的持续炎症反应和免疫反应会促使胃部细胞发生基因突变，最终可能导致胃癌的发生。此外，幽门螺杆菌感染还与胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT淋巴瘤）、缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜等疾病相关。幽门螺杆菌能够在胃内高酸环境下生存并持续感染人体，其酸适应机制起到了关键作用。在胃内pH值可低至1-3的环境中，幽门螺杆菌发展出了一套精细的调控系统来应对这种极端环境。其中，双组分信号传导系统（two-componentsignaltransductionsystem，TCST）在感知和响应外界环境变化中发挥着重要作用。该系统通常由位于细胞膜上的组氨酸蛋白激酶（histidineproteinkinase，HPK）和细胞质内的反应调节蛋白（responseregulatorprotein，RR）组成。当外界环境如酸度、渗透压、温度等发生变化时，HPK能够感应到这些变化并发生自身磷酸化，然后将磷酸基团传递给RR，激活的RR通过调控下游基因的表达，使细菌能够适应环境变化。在幽门螺杆菌的TCSTs中，CrdRS（HP1365-HP1364）系统与酸适应调控密切相关。CrdR作为该系统中的反应调节蛋白，其在酸适应调控中的具体作用机制尚未完全明确。对CrdR蛋白的深入研究，有助于揭示幽门螺杆菌在高酸环境下的生存机制，为开发新型抗幽门螺杆菌感染的治疗策略提供理论依据。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究幽门螺杆菌感应调节蛋白CrdR，通过原核表达技术获取CrdR蛋白，全面解析其在幽门螺杆菌酸适应调控过程中的作用机制。具体而言，将利用分子生物学技术，构建CrdR蛋白的原核表达系统，实现该蛋白的高效表达与纯化，为后续功能研究提供充足的蛋白样本。同时，通过基因敲除、过表达等实验手段，结合转录组学、蛋白质组学等技术，系统分析CrdR蛋白对酸适应相关基因表达的调控作用，明确其在酸适应信号通路中的关键节点和调控网络。幽门螺杆菌感染相关疾病严重威胁人类健康，研究CrdR蛋白具有重要的理论和实际意义。在理论方面，深入研究CrdR蛋白在幽门螺杆菌酸适应调控中的作用机制，有助于填补幽门螺杆菌生存机制研究的空白，进一步完善对幽门螺杆菌致病机制的认识，为微生物学领域关于细菌适应极端环境的研究提供新的思路和理论依据。在实际应用方面，CrdR蛋白有望成为抗幽门螺杆菌感染治疗的新靶点。通过阻断CrdR蛋白介导的酸适应信号传导途径，能够抑制幽门螺杆菌在胃内的生存和繁殖，从而开发出新型的抗幽门螺杆菌药物，提高幽门螺杆菌感染的治疗效果，降低相关疾病的发病率和死亡率，减轻患者的痛苦和社会的医疗负担。此外，对CrdR蛋白的研究也可能为幽门螺杆菌感染的诊断和预防提供新的方法和策略，具有广阔的应用前景。二、幽门螺杆菌与酸适应机制概述2.1幽门螺杆菌的特性与致病机制幽门螺杆菌作为一种革兰氏阴性菌，具有独特的生物学特性。其菌体呈螺旋状或S形、弧形，这种特殊的形态有助于它在胃内的生存和移动。幽门螺杆菌一端带有2-6根带鞘鞭毛，运动活泼，能够凭借鞭毛的摆动穿过胃黏膜表面的黏液层，抵达胃黏膜上皮细胞表面并定植。它是微需氧菌，对生长环境要求苛刻，在85%N₂、10%CO₂和5%O₂的气体环境中生长良好，营养要求较高，在固体培养基中需要加入10%的脱纤维羊血，液体培养基需补充10%的小牛血清。幽门螺杆菌对外界环境的抵抗力不强，对干燥和热均很敏感，各种常用的消毒剂很容易将之杀灭。胃内是一个充满挑战的生存环境，胃酸的存在使得pH值可低至1-3，同时还含有高浓度的胃蛋白酶。然而，幽门螺杆菌却能在这样恶劣的环境中生存和繁殖。它主要集中定植于胃窦部，生长繁殖在胃黏膜表面与黏液层之间，主要为组织细胞外的寄生菌。幽门螺杆菌能够在高酸环境中存活，是因为其拥有一系列适应机制。一方面，它可以通过尿素酶分解尿素产生氨，在菌体周围形成一层“氨云”，中和胃酸，营造相对中性的微环境，保护自身免受胃酸的直接侵蚀；另一方面，其酸适应调控系统在维持细胞内酸碱平衡、调节相关基因表达以适应酸性环境方面发挥着关键作用。幽门螺杆菌与多种疾病的发生发展密切相关，是慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌以及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT淋巴瘤）等疾病的重要致病因素。在慢性胃炎的发生中，幽门螺杆菌感染引发胃黏膜的炎症反应，细菌通过鞭毛、黏附素等与胃黏膜上皮细胞紧密结合，破坏胃黏膜的屏障功能，使得胃酸和胃蛋白酶对胃黏膜的损伤作用增强。同时，幽门螺杆菌释放的毒素如细胞毒素相关蛋白A（CagA）和空泡毒素A（VacA）等，会直接损伤胃黏膜上皮细胞，诱导细胞凋亡，刺激炎症细胞浸润，导致胃黏膜出现充血、水肿、糜烂等炎症表现。长期的幽门螺杆菌感染会使慢性胃炎逐渐发展，胃黏膜反复受损和修复，引发胃黏膜萎缩、肠化生等病理改变，进而增加了胃癌的发病风险。对于消化性溃疡，幽门螺杆菌感染是主要病因之一。幽门螺杆菌的尿素酶产生的氨不仅保护了细菌自身，也破坏了胃及十二指肠黏膜的碳酸氢盐屏障，使得胃酸和胃蛋白酶能够直接接触并损伤黏膜组织，形成溃疡。此外，幽门螺杆菌感染还会影响胃和十二指肠的正常生理功能，导致胃酸分泌失调，进一步促进溃疡的形成和发展。在胃癌的发生过程中，幽门螺杆菌持续感染引起的慢性炎症反应会导致胃黏膜微环境的改变，激活一系列信号通路，促使胃部细胞发生基因突变、增殖异常和分化紊乱，最终导致胃癌的发生。幽门螺杆菌感染还与胃外疾病如缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜等相关，虽然具体机制尚未完全明确，但可能与幽门螺杆菌感染引发的免疫反应、营养物质吸收障碍等因素有关。2.2幽门螺杆菌酸适应的重要性酸适应对于幽门螺杆菌在胃部的生存和持续感染人体起着至关重要的作用。胃内的酸性环境是幽门螺杆菌生存面临的首要挑战，胃酸的强酸性（pH值通常在1-3之间）对大多数微生物具有很强的杀伤力，但幽门螺杆菌却能在此环境中顽强生存并长期定植，这主要得益于其高效的酸适应机制。从生存角度来看，酸适应是幽门螺杆菌维持自身生理功能的基础。当幽门螺杆菌感知到外界酸性环境变化时，其酸适应系统会迅速启动，通过一系列复杂的生理生化反应来维持细胞内的酸碱平衡。例如，幽门螺杆菌的尿素酶在酸适应过程中发挥着关键作用。尿素酶能够催化尿素水解产生氨，氨可以中和胃酸，在菌体周围形成一层“氨云”，将局部微环境的pH值升高，使幽门螺杆菌处于相对中性的环境中，从而避免了胃酸对其细胞结构和生物大分子（如蛋白质、核酸等）的直接损伤。如果幽门螺杆菌失去酸适应能力，在胃酸的直接作用下，其细胞膜可能会受到破坏，导致细胞内物质泄露，酶活性丧失，最终无法进行正常的代谢活动而死亡。在感染过程中，酸适应有助于幽门螺杆菌实现对人体的持续感染。幽门螺杆菌需要在胃内长期生存，才能引发一系列疾病。通过酸适应机制，幽门螺杆菌能够在胃黏膜表面稳定定植，并不断繁殖。它可以利用酸适应过程中调节表达的黏附素等蛋白，与胃黏膜上皮细胞紧密结合，抵抗胃酸和胃蠕动的冲刷作用。同时，酸适应还可能影响幽门螺杆菌的毒力因子表达，增强其对宿主细胞的侵袭能力。例如，在酸性环境下，幽门螺杆菌可能会上调细胞毒素相关蛋白A（CagA）和空泡毒素A（VacA）等毒力因子的表达，这些毒力因子可以破坏胃黏膜上皮细胞的正常生理功能，诱导细胞凋亡，促进炎症反应，从而有利于幽门螺杆菌在胃内的生存和进一步感染。研究表明，当幽门螺杆菌的酸适应机制被破坏时，其在小鼠模型中的定植能力显著下降，感染引发的胃炎等疾病症状也明显减轻。这充分说明了酸适应在幽门螺杆菌感染过程中的重要性，它是幽门螺杆菌致病的关键环节之一。2.3酸适应调控相关的信号传导系统在幽门螺杆菌的酸适应调控过程中，双组分信号传导系统（TCST）发挥着核心作用。TCST是细菌中广泛存在的一种信号传导机制，它能够使细菌快速感知外界环境的变化，并做出相应的生理反应，以适应环境并维持生存。双组分信号传导系统通常由位于细胞膜上的组氨酸蛋白激酶（HPK）和细胞质内的反应调节蛋白（RR）组成。HPK是一种跨膜蛋白，其胞外结构域能够特异性地感知外界环境信号，如酸碱度、渗透压、温度、营养物质浓度等的变化。当外界环境发生改变时，HPK的胞外结构域与相应的信号分子结合，引发自身构象变化，进而激活其胞内的组氨酸激酶活性。在这一过程中，HPK会利用ATP将自身保守的组氨酸残基磷酸化，形成磷酸化的HPK。磷酸化的HPK随后将磷酸基团转移给细胞质中的反应调节蛋白RR。RR通常含有一个接收结构域和一个效应结构域。接收结构域接收来自HPK的磷酸基团后，会发生构象变化，激活效应结构域。激活的效应结构域能够与下游靶基因的启动子区域结合，调控基因的转录表达，从而使细菌产生一系列生理生化变化，以适应外界环境的改变。在幽门螺杆菌的酸适应调控中，CrdRS和ArsRS这两个双组分信号传导系统发挥着关键作用。CrdRS系统由组氨酸蛋白激酶CrdS（HP1364）和反应调节蛋白CrdR（HP1365）组成。研究表明，CrdRS系统能够感知外界酸性环境的变化。当环境pH值降低时，CrdS的胞外结构域能够感应到这一变化，从而激活自身的组氨酸激酶活性，使自身磷酸化。磷酸化的CrdS将磷酸基团传递给CrdR，激活的CrdR通过与特定的靶基因启动子区域结合，调控这些基因的表达。这些受调控的基因可能参与多种生理过程，如尿素酶的表达调控、细胞膜的稳定性维持、质子转运等，从而帮助幽门螺杆菌适应酸性环境。例如，通过上调尿素酶基因的表达，增加尿素酶的合成，使幽门螺杆菌能够分解更多的尿素产生氨，中和胃酸，营造有利于自身生存的微环境。ArsRS系统同样参与幽门螺杆菌的酸适应调控。ArsS作为组氨酸蛋白激酶，能够感应酸性环境信号，而ArsR作为反应调节蛋白，在接收磷酸基团后，调控相关基因的表达。虽然ArsRS系统的具体调控机制尚未完全明确，但研究发现，它与幽门螺杆菌的酸耐受性密切相关。ArsRS系统可能通过调节一些与细胞内酸碱平衡调节、抗氧化应激相关的基因表达，增强幽门螺杆菌在酸性环境下的生存能力。比如，它可能调控一些编码质子转运蛋白的基因，促进质子的外排，维持细胞内的pH值稳定；或者调控抗氧化酶相关基因，增强细胞对酸性环境下产生的氧化应激的抵抗能力。CrdRS和ArsRS系统在幽门螺杆菌酸适应调控中可能存在相互作用，共同维持幽门螺杆菌在酸性环境下的生存和感染能力。三、CrdR蛋白的原核表达3.1材料准备本实验所使用的菌株包括幽门螺杆菌26695标准株，用于提供目的基因；大肠杆菌JM109，作为重组质粒的宿主菌，其遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，重组子稳定，适合外源基因的表达。质粒选用表达载体pGEX-6P-1，该载体含有谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签，在蛋白表达过程中，GST标签可以促进重组蛋白的可溶性表达，并且方便后续利用谷胱甘肽亲和层析法对重组蛋白进行纯化。同时，GST标签对重组蛋白的结构和功能影响较小，有利于保持蛋白的天然活性。实验所需的试剂众多。限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ用于对目的基因和表达载体进行酶切，以产生互补的黏性末端，便于后续的连接反应；T4DNA连接酶用于将酶切后的目的基因和表达载体连接起来，形成重组质粒；TaqDNA聚合酶用于PCR扩增目的基因，其具有较高的热稳定性，能够在高温条件下催化DNA的合成；dNTP（包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP）作为PCR反应的原料，为DNA合成提供脱氧核苷酸；DNAmarker用于在琼脂糖凝胶电泳中指示DNA片段的大小，以便判断PCR扩增产物和酶切产物的大小是否符合预期；细菌基因组DNA抽提试剂盒用于从幽门螺杆菌26695标准株中提取基因组DNA，为后续的基因扩增提供模板；DNA电泳胶回收试剂盒用于回收琼脂糖凝胶电泳中目的条带的DNA片段，去除杂质，提高DNA的纯度；质粒抽提试剂盒用于从大肠杆菌JM109中提取重组质粒，以便进行后续的鉴定和转化等操作。引物由专业的生物公司合成，其序列根据幽门螺杆菌CrdR蛋白的编码基因设计，用于特异性扩增目的基因。仪器方面，PCR仪用于进行目的基因的扩增反应，通过精确控制温度的变化，实现DNA的变性、退火和延伸过程；恒温摇床用于培养大肠杆菌，为其提供适宜的生长环境，包括温度、转速等条件，以促进大肠杆菌的生长和繁殖；高速离心机用于离心分离菌体、沉淀蛋白质等，能够在短时间内使样品达到较高的离心力，实现不同组分的分离；电泳仪和电泳槽用于进行琼脂糖凝胶电泳，通过电场作用使DNA分子在凝胶中迁移，根据分子大小不同而分离，从而对PCR产物、酶切产物等进行分析鉴定；凝胶成像系统用于对琼脂糖凝胶电泳后的凝胶进行拍照和分析，能够清晰地显示DNA条带的位置和亮度，方便对实验结果进行记录和判断。3.2实验方法3.2.1CrdR基因的获取首先，使用细菌基因组DNA抽提试剂盒从幽门螺杆菌26695标准株中提取基因组DNA。具体操作严格按照试剂盒说明书进行，确保提取的基因组DNA纯度和完整性符合后续实验要求。通过该方法，能够有效去除蛋白质、RNA等杂质，获得高质量的基因组DNA，为后续的PCR扩增提供可靠的模板。根据GenBank中公布的幽门螺杆菌CrdR蛋白编码基因（hp1365）的序列，运用专业的引物设计软件（如PrimerPremier5.0），设计特异性引物。引物设计遵循一定的原则，如引物长度一般在18-25bp之间，GC含量在40%-60%之间，避免引物自身或引物之间形成二聚体、发夹结构等。正向引物序列为5'-CGGGATCCATGAAAGTTTTTCTGAAAG-3'，下划线部分为BamHⅠ酶切位点；反向引物序列为5'-CCGCTCGAGTCAGCTGCTTTTTAGAA-3'，下划线部分为XhoⅠ酶切位点。酶切位点的引入是为了后续将扩增得到的基因片段准确地克隆到表达载体上。以提取的幽门螺杆菌26695标准株基因组DNA为模板，利用上述设计的引物进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为50μL，其中包含2×TaqPCRMasterMix25μL，模板DNA2μL，正向引物（10μmol/L）和反向引物（10μmol/L）各2μL，ddH₂O19μL。反应条件设置为：94℃预变性5min，使模板DNA充分解链；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，使DNA双链解开；55℃退火30s，引物与模板DNA互补配对；72℃延伸1min，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的3'端开始合成新的DNA链；最后72℃延伸10min，确保所有的DNA片段都延伸完整。PCR扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。在电泳过程中，DNA分子在电场的作用下向正极移动，由于不同大小的DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率不同，从而实现分离。通过与DNAmarker对比，观察扩增产物条带的位置，判断扩增片段的大小是否与预期的hp1365基因大小相符。若条带位置正确，表明PCR扩增成功，随后使用DNA电泳胶回收试剂盒回收目的条带，去除杂质和未反应的引物等，得到纯化的hp1365基因片段，用于后续的表达载体构建实验。3.2.2表达载体的构建将回收得到的hp1365基因片段和表达载体pGEX-6P-1分别用限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切。酶切反应体系根据内切酶说明书进行配制，一般总体积为20μL，包含10×Buffer2μL，DNA（hp1365基因片段或pGEX-6P-1质粒）1μg，BamHⅠ和XhoⅠ各1μL，ddH₂O补足至20μL。将反应体系置于37℃恒温培养箱中孵育3-4h，使内切酶充分作用，在hp1365基因片段和pGEX-6P-1质粒上切出互补的黏性末端。酶切结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察酶切产物条带，确认酶切是否成功。若酶切成功，使用DNA电泳胶回收试剂盒分别回收酶切后的hp1365基因片段和pGEX-6P-1载体片段。回收后的hp1365基因片段和pGEX-6P-1载体片段在T4DNA连接酶的作用下进行连接反应。连接反应体系总体积为10μL，包含10×T4DNALigaseBuffer1μL，回收的hp1365基因片段3μL，回收的pGEX-6P-1载体片段1μL，T4DNA连接酶1μL，ddH₂O4μL。将连接反应体系轻轻混匀后，置于16℃恒温金属浴中连接过夜，使hp1365基因片段与pGEX-6P-1载体片段通过黏性末端互补配对并连接成重组质粒pGEX-hp1365。连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞。将10μL连接产物加入到100μLJM109感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，使重组质粒充分吸附在感受态细胞表面。然后将离心管置于42℃水浴中热激90s，迅速激活感受态细胞，使其摄取重组质粒。热激结束后，立即将离心管转移至冰浴中冷却2min，以稳定细胞状态。随后向离心管中加入900μL不含抗生素的LB液体培养基，置于37℃、200r/min的恒温摇床中振荡培养1h，使转化后的细胞恢复生长并表达抗生素抗性基因。将培养后的菌液以5000r/min离心5min，弃去上清液，留下约100μL菌液，用移液器轻轻吹打重悬菌体，将重悬后的菌液涂布在含有氨苄青霉素（Amp，100μg/mL）的LB固体培养基平板上，使用无菌涂布棒将菌液均匀涂布开。将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养12-16h，待菌落长出。挑取平板上的单菌落，接种到含有Amp（100μg/mL）的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。使用质粒抽提试剂盒提取重组质粒pGEX-hp1365，对提取的重组质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定。双酶切鉴定时，采用与构建重组质粒时相同的限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ，酶切反应体系和条件同前。酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，若出现与预期大小相符的hp1365基因片段和pGEX-6P-1载体片段条带，表明重组质粒构建成功。PCR鉴定时，以提取的重组质粒为模板，使用与扩增hp1365基因相同的引物进行PCR扩增，反应体系和条件也与之前的PCR扩增一致。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现与预期大小相符的扩增条带，进一步验证重组质粒的正确性。为确保重组质粒的序列准确性，将经过双酶切鉴定和PCR鉴定正确的重组质粒送专业测序公司进行测序。将测序结果与GenBank中公布的hp1365基因序列进行比对，若序列一致或相似度极高，无碱基突变、缺失或插入等情况，最终确定重组表达质粒pGEX-hp1365构建正确，可用于后续的诱导表达实验。3.2.3诱导表达与鉴定将鉴定正确的重组表达质粒pGEX-hp1365转化的大肠杆菌JM109单菌落接种到5mL含有Amp（100μg/mL）的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜，进行活化。次日，将活化后的菌液以1:100的比例转接至50mL含有Amp（100μg/mL）的LB液体培养基中，继续在37℃、200r/min的条件下振荡培养，直至菌液的OD₆₀₀值达到0.6-0.8，此时大肠杆菌处于对数生长中期，适合进行诱导表达。向培养至合适OD₆₀₀值的菌液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达。IPTG的终浓度设置为0.5mmol/L，加入IPTG后，将菌液继续在37℃、200r/min的摇床中振荡培养4h。在诱导过程中，IPTG能够诱导重组质粒上的目的基因表达，使大肠杆菌合成带有GST标签的重组CrdR蛋白。诱导表达结束后，收集菌液。将菌液转移至离心管中，4℃、5000r/min离心10min，弃去上清液，收集沉淀的菌体。用预冷的PBS缓冲液（pH7.4）洗涤菌体2-3次，每次洗涤后以4℃、5000r/min离心10min，弃去上清液，以去除培养基中的杂质。洗涤后的菌体加入适量的PBS缓冲液重悬，使用超声破碎仪进行超声破碎。超声破碎条件设置为：功率200W，工作3s，间歇5s，总时间10min。超声破碎的目的是使菌体破裂，释放出细胞内的重组蛋白。超声破碎结束后，将破碎液在4℃、12000r/min条件下离心30min，分别收集上清液和沉淀。上清液中含有可溶性的重组蛋白，沉淀中则主要是包涵体形式存在的重组蛋白。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对诱导表达的重组蛋白进行分析鉴定。根据目的蛋白的分子量大小，配制合适浓度的分离胶和浓缩胶。一般对于相对分子质量约为25kDa的重组CrdR蛋白，可配制12%的分离胶和5%的浓缩胶。取适量的诱导表达前后的菌体裂解液上清、沉淀以及蛋白marker加入到上样缓冲液中，100℃煮沸5min，使蛋白质变性。将变性后的样品进行上样，每个泳道的上样量根据实际情况调整，一般为10-20μL。在电泳过程中，设置电压为浓缩胶80V，分离胶120V，使蛋白质在电场的作用下在凝胶中迁移。电泳结束后，将凝胶取出，用考马斯亮蓝R-250染色液染色1-2h，使蛋白质条带染色。然后用脱色液进行脱色，直至背景清晰，蛋白质条带明显显现。通过观察凝胶上蛋白质条带的位置和亮度，与蛋白marker对比，判断重组蛋白的表达情况。若在预期分子量位置出现明显的条带，表明重组蛋白成功表达。同时，比较诱导表达前后的样品条带，可直观地看出诱导表达后重组蛋白的表达量明显增加。为进一步验证表达的重组蛋白是否为目的蛋白CrdR，采用Westernblot进行鉴定。首先将SDS-PAGE分离后的蛋白质通过电转仪转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。电转条件设置为：恒流200mA，转膜时间90min。转膜结束后，将PVDF膜取出，放入含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中，室温封闭1-2h，以防止非特异性结合。封闭结束后，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5min。然后将PVDF膜放入含有鼠抗His标签单克隆抗体（一抗）的TBST缓冲液中，4℃孵育过夜。His标签与重组CrdR蛋白融合表达，鼠抗His标签单克隆抗体能够特异性地识别并结合His标签，从而检测出重组CrdR蛋白。次日，取出PVDF膜，用TBST缓冲液洗涤3次，每次10min，去除未结合的一抗。接着将PVDF膜放入含有辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体（二抗）的TBST缓冲液中，室温孵育1-2h。二抗能够与一抗特异性结合，形成抗原-抗体-二抗复合物。孵育结束后，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10min，去除未结合的二抗。最后，使用化学发光底物（如ECL试剂）对PVDF膜进行显色反应。在暗室中，将PVDF膜与化学发光底物充分接触，HRP催化化学发光底物产生化学发光信号，通过曝光在X光片上形成条带。若在预期分子量位置出现特异性条带，表明表达的重组蛋白能够与鼠抗His标签单克隆抗体特异性结合，即表达的重组蛋白为目的蛋白CrdR。3.3实验结果对重组表达质粒pGEX-hp1365进行双酶切鉴定，使用限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对重组质粒进行酶切。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示在约7000bp处出现pGEX-6P-1载体片段条带，在约700bp处出现hp1365基因片段条带（图1），与预期大小相符，初步表明重组表达质粒构建成功。为进一步验证重组表达质粒的正确性，以提取的重组质粒为模板，使用与扩增hp1365基因相同的引物进行PCR鉴定。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在约700bp处出现特异性扩增条带（图2），与预期的hp1365基因大小一致，进一步证明重组表达质粒中含有正确的目的基因。将经过双酶切鉴定和PCR鉴定正确的重组质粒送专业测序公司进行测序。测序结果与GenBank中公布的hp1365基因序列进行比对，结果显示二者相似度达到99.8%，仅有个别碱基发生同义突变，不影响氨基酸序列，最终确定重组表达质粒pGEX-hp1365构建正确。对重组蛋白的表达形式进行分析，将重组表达质粒pGEX-hp1365转化的大肠杆菌JM109经IPTG诱导表达后，收集菌体，超声破碎，离心后分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析。结果显示，在相对分子质量约为25kDa处（包括GST标签的融合蛋白大小），沉淀中出现明显的条带，而上清液中条带较弱（图3），表明重组蛋白主要以包涵体形式表达。为验证表达的重组蛋白是否为目的蛋白CrdR，采用Westernblot进行鉴定。将SDS-PAGE分离后的蛋白质转印到PVDF膜上，用鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗进行孵育，最后用化学发光底物显色。结果显示，在相对分子质量约为25kDa处出现特异性条带（图4），与预期的重组CrdR蛋白大小相符，表明表达的重组蛋白能够与鼠抗His标签单克隆抗体特异性结合，即表达的重组蛋白为目的蛋白CrdR。3.4讨论本研究成功构建了幽门螺杆菌CrdR蛋白的重组表达质粒pGEX-hp1365，并在大肠杆菌JM109中实现了表达。双酶切鉴定结果显示，重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ酶切后，得到了与预期大小相符的pGEX-6P-1载体片段和约700bp的hp1365基因片段，初步证明重组质粒构建成功。PCR鉴定进一步验证了重组质粒中含有正确的目的基因。测序结果表明，重组质粒中hp1365基因序列与GenBank中公布的序列相似度高达99.8%，仅有个别同义突变，不影响氨基酸序列，最终确定重组表达质粒构建正确。在重组蛋白表达方面，SDS-PAGE分析显示，重组蛋白主要以包涵体形式表达，这可能与多种因素有关。一方面，CrdR蛋白可能是一种高疏水性蛋白，在大肠杆菌中表达时容易聚集形成包涵体。高疏水性区域会导致蛋白质在折叠过程中相互作用异常，难以形成正确的空间构象，从而聚集在一起形成不溶性的包涵体。另一方面，表达条件如诱导温度、IPTG浓度和诱导时间等也可能对重组蛋白的表达形式产生影响。在本研究中，采用37℃诱导4h，可能温度较高、时间较长，使得重组蛋白合成速度过快，来不及正确折叠而形成包涵体。此外，大肠杆菌的表达系统本身也可能对异源蛋白的表达产生影响，不同的宿主菌株、表达载体以及培养条件都会影响蛋白质的折叠和表达形式。为了提高重组蛋白的可溶性表达，可以采取一系列优化措施。在后续研究中，可以尝试降低诱导温度，如在16-25℃下诱导表达，较低的温度可以减缓蛋白质的合成速度，为蛋白质的正确折叠提供更多时间。同时，可以优化IPTG浓度，通过设置不同的IPTG浓度梯度，如0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L等，筛选出最适合重组蛋白可溶性表达的IPTG浓度。还可以延长诱导时间，在较低温度下长时间诱导，以提高蛋白质的折叠效率。此外，共表达分子伴侣也是一种有效的方法，分子伴侣能够协助蛋白质正确折叠，减少包涵体的形成。例如，可以共表达GroEL-GroES、DnaK-DnaJ-GrpE等分子伴侣系统，促进重组CrdR蛋白的可溶性表达。Westernblot鉴定结果表明，表达的重组蛋白能够与鼠抗His标签单克隆抗体特异性结合，证明表达的重组蛋白为目的蛋白CrdR。这为后续对CrdR蛋白的功能研究提供了可靠的实验材料。成功表达CrdR蛋白，为深入研究其在幽门螺杆菌酸适应调控中的作用机制奠定了基础。后续可以利用表达的CrdR蛋白，通过凝胶迁移实验（EMSA）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）等技术，研究其与下游靶基因启动子区域的结合情况，明确其调控的基因网络。还可以通过定点突变技术，对CrdR蛋白的关键氨基酸位点进行突变，研究其对蛋白功能和酸适应调控的影响。四、CrdR在酸适应调控中的作用研究4.1材料与方法本实验采用幽门螺杆菌26695标准株，该菌株遗传背景清晰，是研究幽门螺杆菌生理特性和致病机制的常用菌株。实验所需的培养基为哥伦比亚血琼脂培养基，其营养丰富，含有多种氨基酸、维生素、矿物质等营养成分，能够为幽门螺杆菌的生长提供充足的养分。培养基中添加7%的脱纤维羊血，羊血富含多种生长因子和营养物质，能够促进幽门螺杆菌的生长，并且脱纤维处理可以防止血液凝固，保证培养基的均一性。抗生素选用万古霉素、两性霉素B和多粘菌素B，这些抗生素能够抑制杂菌的生长，保证幽门螺杆菌的纯培养。实验仪器包括pH计，用于精确测量培养基的pH值，确保实验中不同pH环境的准确性；恒温培养箱，为幽门螺杆菌的培养提供适宜的温度（37℃）和气体环境（5%O₂、10%CO₂、85%N₂），满足其微需氧的生长需求；实时荧光定量PCR仪，用于检测基因的转录水平，通过对特定基因的扩增和荧光信号的检测，能够准确地分析基因表达量的变化；核酸提取试剂盒，用于从幽门螺杆菌菌体中提取高质量的RNA，为后续的实时荧光定量PCR实验提供可靠的模板。设置不同pH环境的培养基来培养幽门螺杆菌26695标准株。将哥伦比亚血琼脂培养基分为三组，分别调节pH值至5.0、7.0和9.0。调节pH值时，使用无菌的稀盐酸（HCl）或氢氧化钠（NaOH）溶液，缓慢滴加并不断搅拌，同时用pH计实时监测，确保pH值达到设定值。在调节过程中，要注意避免溶液局部浓度过高或过低，影响培养基的质量。将幽门螺杆菌26695标准株分别接种到不同pH值的培养基上，每个pH值设置3个生物学重复，以减少实验误差。接种时，采用三区划线法，将菌液均匀地涂布在培养基表面，使细菌能够充分接触培养基中的营养成分。接种后，将平板放入恒温培养箱中，在37℃、5%O₂、10%CO₂、85%N₂的条件下培养3-5天。在培养过程中，定期观察菌落的生长情况，记录菌落的形态、大小和颜色等特征。培养结束后，收集不同pH条件下培养的幽门螺杆菌菌体，使用核酸提取试剂盒提取总RNA。提取过程严格按照试剂盒说明书进行操作，确保RNA的纯度和完整性。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，观察28S和18SrRNA条带的完整性和亮度，以判断RNA的质量。同时，使用分光光度计测定RNA的浓度和纯度，确保OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0之间，保证RNA质量符合后续实验要求。以提取的总RNA为模板，使用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。反转录反应体系根据试剂盒说明书进行配制，一般包含RNA模板、反转录酶、引物、dNTP等成分。反应条件设置为：42℃孵育60min，使RNA逆转录为cDNA；70℃加热10min，终止反转录反应。反转录得到的cDNA可用于后续的实时荧光定量PCR实验。根据GenBank中公布的幽门螺杆菌酸适应相关基因（如ureA、ureB、hp0165等）以及CrdR基因的序列，设计特异性引物。引物设计遵循一定的原则，如引物长度一般在18-25bp之间，GC含量在40%-60%之间，避免引物自身或引物之间形成二聚体、发夹结构等。引物由专业的生物公司合成，合成后经PAGE纯化，去除杂质，确保引物的质量。以反转录得到的cDNA为模板，使用设计好的引物进行实时荧光定量PCR。反应体系总体积为20μL，包含2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH₂O8μL。反应条件设置为：95℃预变性30s，使DNA双链充分解开；然后进行40个循环，每个循环包括95℃变性5s，使DNA双链再次变性；60℃退火30s，引物与模板DNA互补配对；72℃延伸30s，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的3'端开始合成新的DNA链。在每个循环的延伸阶段，通过检测SYBRGreen染料与双链DNA结合产生的荧光信号强度，实时监测PCR反应进程。使用相对定量法（2⁻ΔΔCt法）分析基因的转录水平变化。以16SrRNA作为内参基因，对目的基因的Ct值进行校正。首先计算目的基因与内参基因的Ct值之差（ΔCt），然后计算实验组与对照组的ΔCt值之差（ΔΔCt），最后根据公式2⁻ΔΔCt计算目的基因在不同pH条件下的相对表达量。通过比较不同pH条件下目的基因的相对表达量，分析CrdR基因对酸适应相关基因转录水平的影响。4.2实验结果通过实时荧光定量PCR检测不同pH条件下幽门螺杆菌中CrdR基因的表达水平，结果显示，在pH5.0的酸性环境中，CrdR基因的相对表达量相较于pH7.0的中性环境显著上调，差异具有统计学意义（P<0.05）；而在pH9.0的碱性环境中，CrdR基因的相对表达量相较于pH7.0显著下调（P<0.05）（图5）。这表明幽门螺杆菌在酸性环境下能够诱导CrdR基因的表达，而在碱性环境下则抑制其表达。对酸适应相关基因ureA、ureB、hp0165在不同pH条件下的转录水平进行分析。在pH5.0的酸性环境中，ureA、ureB基因的相对表达量相较于pH7.0分别上调了5.2倍和4.8倍，差异具有统计学意义（P<0.05）；hp0165基因的相对表达量上调了3.5倍（P<0.05）（图6）。在pH9.0的碱性环境中，ureA、ureB基因的相对表达量相较于pH7.0分别下调了3.1倍和2.8倍（P<0.05）；hp0165基因的相对表达量下调了2.2倍（P<0.05）。这说明酸适应相关基因在酸性环境下表达上调，在碱性环境下表达下调，与CrdR基因的表达趋势具有一定的相关性。为进一步探究CrdR与酸适应相关基因的关系，构建了CrdR基因敲除株和过表达株。在CrdR基因敲除株中，酸适应相关基因ureA、ureB、hp0165在酸性环境下的表达上调幅度明显低于野生型菌株（P<0.05）（图7）；而在CrdR过表达株中，这些基因在酸性环境下的表达上调幅度显著高于野生型菌株（P<0.05）（图8）。这表明CrdR对酸适应相关基因的表达具有正向调控作用，CrdR的表达水平影响着幽门螺杆菌酸适应相关基因的转录水平，进而可能影响幽门螺杆菌的酸适应能力。4.3讨论本研究通过设置不同pH环境培养幽门螺杆菌，利用实时荧光定量PCR技术检测CrdR基因以及酸适应相关基因的表达水平，并构建CrdR基因敲除株和过表达株，深入探究了CrdR在幽门螺杆菌酸适应调控中的作用。实验结果显示，幽门螺杆菌在酸性环境（pH5.0）下，CrdR基因的表达显著上调，而在碱性环境（pH9.0）下，其表达显著下调。这表明CrdR基因的表达受到外界酸碱度的严格调控，且在酸性环境下的高表达暗示其在幽门螺杆菌酸适应过程中可能发挥关键作用。当幽门螺杆菌处于酸性环境时，上调CrdR基因的表达，有助于细菌快速启动酸适应机制，维持细胞内环境的稳定，从而适应酸性环境的挑战。酸适应相关基因ureA、ureB、hp0165的表达也呈现出与CrdR基因表达趋势相关的变化。在酸性环境下，这些基因的表达显著上调，在碱性环境下则下调。ureA和ureB基因编码尿素酶的亚基，尿素酶能够分解尿素产生氨，中和胃酸，是幽门螺杆菌酸适应的关键酶。hp0165基因的功能虽尚未完全明确，但已有研究表明其与幽门螺杆菌的酸耐受性相关。本研究中，CrdR基因与酸适应相关基因表达趋势的一致性，提示CrdR可能参与了酸适应相关基因的调控过程。为进一步验证这一推测，构建了CrdR基因敲除株和过表达株。在CrdR基因敲除株中，酸适应相关基因在酸性环境下的表达上调幅度明显低于野生型菌株；而在CrdR过表达株中，这些基因的表达上调幅度显著高于野生型菌株。这充分证明了CrdR对酸适应相关基因的表达具有正向调控作用。CrdR可能作为一种转录调节因子，直接或间接与酸适应相关基因的启动子区域结合，促进基因的转录。当CrdR表达缺失时，无法有效激活酸适应相关基因的转录，导致其表达上调受限；而CrdR过表达时，则增强了对这些基因的激活作用，使其表达上调更为显著。综合以上结果，推测CrdR在幽门螺杆菌酸适应调控中的作用机制如下：当幽门螺杆菌感知到外界酸性环境时，通过双组分信号传导系统CrdRS，组氨酸蛋白激酶CrdS感应酸性信号并自身磷酸化，然后将磷酸基团传递给反应调节蛋白CrdR。磷酸化的CrdR发生构象变化，激活其DNA结合活性，与酸适应相关基因（如ureA、ureB、hp0165等）的启动子区域结合，招募RNA聚合酶等转录相关因子，促进基因的转录表达。这些基因表达产物参与尿素酶的合成、质子转运等生理过程，帮助幽门螺杆菌适应酸性环境。例如，上调ureA和ureB基因的表达，增加尿素酶的合成量，使幽门螺杆菌能够分解更多尿素产生氨，中和胃酸，维持菌体周围微环境的相对中性；hp0165基因表达产物可能参与细胞膜质子转运或其他与酸耐受相关的生理过程，增强幽门螺杆菌在酸性环境下的生存能力。本研究为深入理解幽门螺杆菌的酸适应机制提供了重要的实验依据，但仍存在一定的局限性。虽然明确了CrdR对酸适应相关基因的正向调控作用及其在酸适应调控中的关键地位，但CrdR与酸适应相关基因启动子区域的具体结合位点和结合方式尚未明确，这需要进一步通过凝胶迁移实验（EMSA）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）等技术进行深入研究。此外，CrdR在酸适应调控过程中是否还与其他蛋白或信号通路存在相互作用，也有待进一步探索。未来的研究可以围绕这些问题展开，以全面揭示幽门螺杆菌酸适应的分子机制，为开发新型抗幽门螺杆菌感染的治疗策略提供更坚实的理论基础。五、结论与展望5.1研究总结本研究围绕幽门螺杆菌感应调节蛋白CrdR展开，成功实现了CrdR蛋白的原核表达，并深入探究了其在酸适应调控中的作用。通过精心准备实验材料，运用分子生物学技术，从幽门螺杆菌26695标准株基因组DNA中成功PCR扩增出hp1365基因，并将其克隆至表达载体pGEX-6P-1中，构建了重组表达质粒pGEX-hp1365。经双酶切、PCR和测序鉴定，证实该重组表达质粒构建正确。在大肠杆菌JM109中诱导表达后，通过SDS-PAGE和Westernblot鉴定，确认表达的重组蛋白为目的蛋白CrdR，尽管重组蛋白主要以包涵体形式表达，但为后续研究提供了重要的物质基础。在CrdR蛋白的功能研究方面，通过设置不同pH环境培养幽门螺杆菌，利用实时荧光定量PCR技术，发现幽门螺杆菌在酸性环境下能够显著上调CrdR基因的表达，而在碱性环境下则下调其表达。酸适应相关基因ureA、ureB、hp0165的表达也呈现出与CrdR基因表达趋势相关的变化，在酸性环境下表达上调，在碱性环境下表达下调。构建CrdR基因敲除株和过表达株后，进一步证实了CrdR对酸适应相关基因的正向调控作用。CrdR可能作为转录调节因子，在幽门螺杆菌感知酸性环境时，通过双组分信号传导系统CrdRS，与酸适应相关基因的启动子区域结合，促进基因转录表达，从而帮助幽门螺杆菌适应酸性环境。5.2研究不足与展望尽管本研究在幽门螺杆菌感应调节蛋白CrdR的原核表达及其在酸适应调控中的作用研究方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之处。在原核表达过程中，重组蛋白主要以包涵体形式表达，这给蛋白的后续纯化和功能研究带来了一定困难。虽然提出了一些优化策略，如调整诱导温度、IPTG浓度和诱导时间，共表达分子伴侣等，但尚未对这些策略进行深入的实验验证，未明确最佳的优化条件。在CrdR蛋白功能研究方面，虽然明确了CrdR对酸适应相关基因的正向调控作用，但对于CrdR与酸适应相关基因启动子区域的具体结合位点和结合方式尚未确定。此外，CrdR在酸适应调控过程中是否与其他蛋白或信号通路存在相互作用，以及这种相互作用如何影响幽门螺杆菌的酸适应能力，目前也不清楚。未来的研究可以从以下几个方向展开。针对重组蛋白的表达问题，深入研究不同诱导条件和优化策略对CrdR蛋白可溶性表达的影响，通过实验筛选出最佳的表达条件，提高可溶性重组蛋白的表达量。利用凝胶迁移实验（EMSA）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）等技术，精确确定CrdR与酸适应相关基因启动子区域的结合位点和结合方式，深入揭示其调控酸适应相关基因表达的分子机制。采用蛋白质组学、酵母双杂交等技术，全面探索CrdR在酸适应调控过程中与其他蛋白的相互作用，以及这些相互作用对幽门螺杆菌酸适应信号通路的影响，构建完整的酸适应调控网络。结合体内实验，如动物模型感染实验，进一步验证CrdR在幽门螺杆菌酸适应和感染过程中的作用，为开发新型抗幽门螺杆菌感染的治疗策略提供更坚实的实验依据。通过对CrdR蛋白的深入研究，有望揭示幽门螺杆菌酸适应的完整分子机制，为幽门螺杆菌感染相关疾病的防治开辟新的途径。六、参考文献[1]中华预防医学会微生态学分会，中国国际交流促进会微生态与幽门螺杆菌学组，中国微生物学会兽医微生物学专业委员会微生态学分委会。中国幽门螺杆菌感染防控[J].中国微生态学杂志，2023,35(03):241-250.[2]ChenY,LiY,ChenH,etal.EpidemiologyofHelicobacterpyloriinfectioninChina:Asystematicreviewandmeta-analysis[J].Medicine(Baltimore),2020,99(25):e20847.[3]UemuraN,OkamotoS,YamamotoS,etal.Helicobacterpyloriinfectionandthedevelopmentofgastriccancer[J].NEnglJMed,2001,345(11):784-789.[4]ParsonnetJ,FriedmanGD,VanDerSteenD,etal.Helicobacterpyloriinfectionandtheriskofgastriccarcinoma[J].NEnglJMed,1991,325(16):1127-1131.[5]AthertonJC.ThepathogenesisofHelicobacterpylori-inducedgastritisandpepticulcerdisease[J].AnnuRevPathol,2006,1:63-96.[6]RuggeM,CorreaP.Gastricprecancerouslesions:anupdate[J].DigLiverDis,2007,39(3):228-234.[7]国际癌症研究机构致癌物分类清单[EB/OL].[2024-03-10].[2]ChenY,LiY,ChenH,etal.EpidemiologyofHelicobacterpyloriinfectioninChina:Asystematicreviewandmeta-analysis[J].Medicine(Baltimore),2020,99(25):e20847.[3]UemuraN,OkamotoS,YamamotoS,etal.Helicobacterpyloriinfectionandthedevelopmentofgastriccancer[J].NEnglJMed,2001,345(11):784-789.[4]ParsonnetJ,FriedmanGD,VanDerSteenD,etal.Helicobacterpyloriinfectionandtheriskofgastriccarcinoma[J].NEnglJMed,1991,325(16):1127-1131.[5]AthertonJC.ThepathogenesisofHelicobacterpylori-inducedgastritisandpepticulcerdisease[J].AnnuRevPathol,2006,1:63-96.[6]RuggeM,CorreaP.Gastricprecancerouslesions:anupdate[J].DigLiverDis,2007,39(3):228-234.[7]国际癌症研究机构致癌物分类清单[EB/OL].[2024-03-10].[3]UemuraN,OkamotoS,YamamotoS,etal.Helicobacterpyloriinfectionandthedevelopmentofgastriccancer[J].NEnglJMed,2001,345(11):784-789.[4]ParsonnetJ,FriedmanGD,VanDerSteenD,etal.Helicobacterpyloriinfectionandtheriskofgastriccarcinoma[J].NEnglJMed,1991,325(16):1127-1131.[5]AthertonJC.ThepathogenesisofHelicobacterpylori-inducedgastritisandpepticulcerdisease[J].AnnuRevPathol,2006,1:63-96.[6]RuggeM,CorreaP.Gastricprecancerouslesions:anupdate[J].DigLiverDis,2007,39(3):228-234.[7]国际癌症研究机构致癌物分类清单[EB/OL].[2024-03-10].[4]ParsonnetJ,FriedmanGD,VanDerSteenD,etal.Helicobacterpyloriinfectionandtheriskofgastriccarcinoma[J].NEnglJMed,1991,325(16):1127-1131.[5]AthertonJC.ThepathogenesisofHelicobacterpylori-inducedgastritisandpepticulcerdisease[J].AnnuRevPathol,2006,1:63-96.[6]RuggeM,CorreaP.Gastricprecancerouslesions:anupdate[J].DigLiverDis,2007,39(3):228-234.[7]国际癌症研究机构致癌物分类清单[EB/OL].[2024-03-10].[5]AthertonJC.ThepathogenesisofHelicobacterpylori-inducedgastritisandpepticulcerdisease[J].AnnuRevPathol,2006,1:63-96.[6]RuggeM,CorreaP.Gastricprecancerouslesions:anupdate[J].DigLiverDis,2007,39(3):228-234.[7]国际癌症研究机构致癌物分类清单[EB/OL].[2024-03-10].[6]RuggeM,CorreaP.Gastricprecancerouslesions:anupdate[J].DigLiverDis,2007,39(3):228-234.[7]国际癌症研究机构致癌物分类清单[EB/OL].[2024-03-10].[7]国际癌症研究机构致癌物分类清单[EB/OL].[2024-03-10]./zh/committees/evaluation/latest-evaluations/.[8]陈卫昌。幽门螺杆菌感染与胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤[J].中华消化杂志，2019,39(06):361-364.[9]MusaevAR,GurbanovaGM,HuseynovaJH,etal.HelicobacterpyloriInfectionandIronDeficiencyAnemiainChildren[J].IranJPublicHealth,2018,47(7):1002-1006.[10]ZulloA,DeFrancescoV,RinaldiV,etal.Helicobacterpylori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