广东地区副猪嗜血杆菌流行株的分离鉴定、血清型分析及灭活疫苗研制

广东地区副猪嗜血杆菌流行株的分离鉴定、血清型分析及灭活疫苗研制一、引言1.1研究背景随着规模化、集约化养猪业的迅速发展，猪病的种类不断增多，危害日益严重，其中副猪嗜血杆菌病对养猪业的影响不容小觑。副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis，HPS）是一种革兰氏阴性小杆菌，隶属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等，又称猪格拉泽氏病（Glasser'sdisease）。该菌只感染猪，具有很强的宿主特异性，可影响2周龄到4月龄的青年猪，尤其对断奶前后和保育期的仔猪危害最为严重，发病率一般在10%-30%，严重时死亡率可达50%以上。副猪嗜血杆菌病不仅会导致猪只的直接死亡，还会严重影响猪只的生长性能。感染后的猪只常出现发热、咳嗽、呼吸困难、关节肿胀、跛行等症状，导致食欲不振、精神萎靡，生长速度减缓，饲料转化率降低，使得养殖户需要投入更多的饲料和时间来达到预期的出栏体重，极大地降低了养殖的经济效益。此外，治疗疾病所需的药物费用、兽医服务费用以及因疫情防控而增加的消毒、隔离等措施的成本也给养殖场带来了沉重的经济负担。疫情的发生还可能导致养殖场的声誉受损，影响猪肉产品的销售，进一步加剧经济损失。在疫病防控方面，副猪嗜血杆菌病也面临诸多挑战。该病菌的传播途径多样，主要通过空气、猪只的接触以及污染排泄物进行传播，包括飞沫传播、接触传播以及通过污染的饲料、饮水和器具传播等，使得疫情的防控难度加大。而且，副猪嗜血杆菌容易产生耐药性，使得治疗效果不佳，这就要求养殖户在用药时需要更加谨慎和科学。同时，副猪嗜血杆菌具有多种血清型，目前暂时分为15个血清型，还有一些菌株尚未确定血清型，且不同血清型之间的交叉保护力较弱，这使得防控工作变得更为复杂。广东作为我国的养猪大省，养猪业在农业经济中占据重要地位。然而，近年来广东地区养猪业频繁受到副猪嗜血杆菌病的困扰，疫情时有发生，给当地的养猪业造成了巨大的经济损失。由于广东地区气候温暖湿润，适合细菌的生存和繁殖，且养猪场数量众多，养殖密度较大，猪只之间的接触频繁，增加了副猪嗜血杆菌的传播风险。同时，广东地区的养猪业存在养殖水平参差不齐、生物安全措施落实不到位等问题，使得副猪嗜血杆菌病的防控形势更加严峻。因此，对广东地区副猪嗜血杆菌流行株进行分离鉴定、确定优势血清型并研制有效的灭活苗具有重要的现实意义，对于保障广东地区养猪业的健康稳定发展，提高养殖户的经济效益，具有迫切的需求和重要的价值。1.2国内外研究现状在副猪嗜血杆菌的分离鉴定方面，国内外已经建立了多种方法。传统的方法主要依赖于细菌的形态学观察、培养特性以及生化特性鉴定。副猪嗜血杆菌是一种革兰氏阴性小杆菌，无鞭毛，不运动，在含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的培养基上生长良好，在巧克力培养基上呈半透明露珠样菌落，接种于金黄色葡萄球菌的平板上会呈现出明显的“卫星现象”。通过这些特征可以初步对其进行分离和鉴定。然而，传统方法存在一定的局限性，操作繁琐、耗时长，且准确性受操作人员经验影响较大，对于一些生长特性不典型的菌株，容易出现误诊。随着分子生物学技术的快速发展，PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术（LAMP）等分子生物学方法逐渐应用于副猪嗜血杆菌的分离鉴定。这些方法具有快速、灵敏、特异性强等优点。例如，PCR技术可以通过扩增副猪嗜血杆菌的特定基因片段，如16SrRNA基因、保守的毒力基因等，实现对病原菌的快速准确鉴定。实时荧光定量PCR不仅能够定性检测，还可以对病原菌进行定量分析，有助于了解感染的程度和动态变化。LAMP技术则具有操作简便、反应迅速、不需要特殊仪器设备等优势，适合在基层实验室和现场检测中应用。在血清型研究方面，目前国际上公认的副猪嗜血杆菌血清型有15种，此外还有一些无法定型的菌株。不同地区的优势血清型存在差异。在欧洲，血清型4、5较为常见；在北美，血清型1、5、13流行较为广泛。在国内，多个省份的研究表明，血清型4、5、12、13、15是主要的流行血清型，但各地区的优势血清型分布也不尽相同。了解不同地区的优势血清型对于疫苗的研发和疫病防控具有重要指导意义，因为疫苗的免疫效果与血清型的匹配度密切相关，选择当地流行的优势血清型制备疫苗，能够提高疫苗的保护效力。疫苗研制是防控副猪嗜血杆菌病的重要手段之一。目前，国内外已经研制出多种类型的副猪嗜血杆菌疫苗，包括灭活疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗等。灭活疫苗是应用最为广泛的一类疫苗，其制备工艺相对成熟，安全性高。通过将分离得到的副猪嗜血杆菌菌株进行培养、灭活后，添加适当的佐剂制成疫苗。亚单位疫苗则是利用副猪嗜血杆菌的某些具有免疫原性的蛋白或多糖成分制备而成，具有纯度高、副作用小等优点。基因工程疫苗是通过基因工程技术，对副猪嗜血杆菌的基因进行改造和表达，制备出具有良好免疫原性的疫苗。例如，将副猪嗜血杆菌的毒力基因进行敲除，构建减毒活疫苗；或者将免疫原性强的基因克隆到表达载体中，在体外表达后制备基因工程亚单位疫苗。尽管国内外在副猪嗜血杆菌的研究方面取得了一定的进展，但针对广东地区的研究仍存在一些不足。目前对广东地区副猪嗜血杆菌流行株的系统研究相对较少，已有的研究多为局部地区的小规模调查，对于全省范围内的流行株分布、优势血清型变化规律缺乏全面深入的了解。这使得在制定疫病防控策略时缺乏足够的科学依据，难以做到精准防控。在疫苗研制方面，虽然国内外已经有多种疫苗上市，但由于副猪嗜血杆菌血清型复杂，不同血清型之间的交叉保护力较弱，现有的疫苗可能无法完全覆盖广东地区的流行血清型，导致疫苗的免疫效果不理想。因此，开展广东地区副猪嗜血杆菌流行株的分离鉴定、优势血清型定型及灭活苗的研制具有重要的现实意义，对于完善广东地区副猪嗜血杆菌病的防控体系，提高养猪业的经济效益具有重要的推动作用。1.3研究目的与意义本研究旨在对广东地区副猪嗜血杆菌流行株进行系统的分离鉴定，明确其优势血清型，并研制出针对广东地区流行株的高效灭活苗，为广东地区副猪嗜血杆菌病的防控提供科学依据和有效的技术手段。通过对广东地区不同养殖场的病猪或疑似感染猪进行采样，运用传统的细菌分离培养方法以及先进的分子生物学技术，如PCR、16SrRNA基因测序等，对副猪嗜血杆菌流行株进行分离鉴定，能够准确掌握该地区副猪嗜血杆菌的分布情况和菌株特性。在此基础上，利用血清学试验、分子分型技术等方法确定广东地区的优势血清型，为疫苗的研制提供关键的参考信息。根据分离鉴定得到的优势血清型菌株，经过培养、灭活、佐剂筛选等一系列工艺，研制出灭活苗，并对其安全性、免疫原性和免疫保护效果进行评估，为疫苗的临床应用提供数据支持。本研究具有重要的理论和实践意义。从理论方面来看，深入研究广东地区副猪嗜血杆菌流行株的生物学特性、血清型分布规律等，有助于丰富对副猪嗜血杆菌的认识，完善其流行病学资料，为进一步研究副猪嗜血杆菌的致病机制、免疫机制等提供基础数据。从实践意义而言，准确鉴定广东地区的副猪嗜血杆菌流行株和优势血清型，能够为疫病的诊断和监测提供精准的技术支持，使养殖户和兽医人员能够及时、准确地判断疫情，采取有效的防控措施。研制出的针对广东地区流行株的灭活苗，能够提高疫苗的针对性和有效性，增强猪群对副猪嗜血杆菌病的抵抗力，降低发病率和死亡率，减少因疫病造成的经济损失。同时，有效的疫苗防控还能够减少抗生素的使用，降低药物残留和耐药菌的产生，有利于保障猪肉产品的质量安全和生态环境的健康。对于促进广东地区养猪业的健康、可持续发展，提高养殖户的经济效益，维护社会的稳定和食品安全，都具有重要的推动作用。二、副猪嗜血杆菌广东流行株的分离2.1样品采集本研究从广东不同地区的猪场中采集病猪组织样本，旨在获取具有代表性的副猪嗜血杆菌流行株。采样地点涵盖了广州、深圳、佛山、惠州、河源等多个养猪业较为集中的地区。这些地区的养猪场规模大小不一，既有存栏量达数千头的大型规模化猪场，也有存栏量在几百头的小型养殖场，以确保能够全面反映广东地区不同养殖模式下副猪嗜血杆菌的感染情况。猪群来源主要为出现疑似副猪嗜血杆菌病临床症状的猪只，这些症状包括发热、咳嗽、呼吸困难、关节肿胀、跛行、精神萎靡、食欲不振等。同时，也采集了部分病死猪的组织样本，以增加分离到病原菌的概率。在选择采样猪只时，优先选取发病早期、症状典型的猪只，以保证分离到的菌株具有较强的代表性和致病性。采集的样本类型主要包括肺脏、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、关节液、心包液和胸腔积液等。这些组织和体液是副猪嗜血杆菌感染后常见的病变部位，能够为病原菌的分离提供丰富的来源。例如，肺脏是副猪嗜血杆菌感染后引起纤维素性胸膜肺炎的主要靶器官，在病变的肺脏组织中往往能够检测到大量的病原菌；关节液和心包液则是副猪嗜血杆菌引起关节炎和心包炎时的重要样本，其中的病原菌含量较高，有助于提高分离的成功率。在采样过程中，严格遵循无菌操作原则，以避免样本受到其他细菌或微生物的污染。采样人员穿戴无菌防护服、手套和口罩，使用经过严格消毒的采样工具，如无菌手术刀、镊子、注射器等。对于每一头采样猪只，分别采集多个组织样本，并将其放入无菌的采样袋或离心管中。在采样袋或离心管上清晰标记采样地点、猪只编号、采样时间、样本类型等信息，以便后续的样本处理和分析。采集后的样本立即放入装有冰袋的保温箱中，保持低温状态，尽快送往实验室进行处理，以确保病原菌的活性和样本的质量。2.2分离方法本研究采用巧克力琼脂培养基和胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基（添加5%新生牛血清和10μg/mL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD））对采集的样本进行副猪嗜血杆菌的分离培养。巧克力琼脂培养基能够提供丰富的营养成分，满足副猪嗜血杆菌对营养的苛刻需求；而添加了新生牛血清和NAD的TSA培养基则为副猪嗜血杆菌的生长创造了适宜的环境，NAD是副猪嗜血杆菌生长所必需的辅酶，能够促进其代谢活动，新生牛血清则提供了多种生长因子和营养物质。将采集的肺脏、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、关节液、心包液和胸腔积液等样本，在无菌条件下用无菌手术刀或镊子取适量组织块，直接划线接种于上述两种培养基平板上。对于液体样本，如关节液、心包液和胸腔积液等，使用无菌吸管吸取适量液体，均匀涂布于培养基平板表面。接种后的培养基平板置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中进行培养。CO₂能够维持培养基的酸碱度稳定，为细菌的生长提供适宜的环境。在培养过程中，每隔12小时观察一次平板上的菌落生长情况，记录菌落的形态、大小、颜色、透明度和边缘特征等。副猪嗜血杆菌在巧克力琼脂培养基上通常在24-48小时后长出圆形、湿润、光滑、边缘整齐、半透明、露珠状的小菌落；在添加了新生牛血清和NAD的TSA培养基上，菌落生长相对较慢，一般在48-72小时后出现类似的菌落形态。若平板上出现符合副猪嗜血杆菌菌落特征的可疑菌落，用无菌接种环挑取单个菌落，再次划线接种于新鲜的巧克力琼脂培养基和TSA培养基平板上进行纯化培养，重复2-3次，直至获得纯培养的副猪嗜血杆菌菌株。2.3分离结果经过对来自广东不同地区猪场的病猪组织样本进行分离培养，成功分离得到了多株副猪嗜血杆菌。共采集了[X]个猪场的[X]份病猪组织样本，其中包括肺脏[X]份、心脏[X]份、肝脏[X]份、脾脏[X]份、肾脏[X]份、关节液[X]份、心包液[X]份和胸腔积液[X]份。从这些样本中，成功分离出副猪嗜血杆菌菌株[X]株，分离率为[X]%。不同猪场的分离情况存在差异，部分猪场的分离率较高，而部分猪场的分离率较低。在分离得到的菌株中，[猪场名称1]的分离菌株数量最多，达到了[X]株，占总分离菌株数的[X]%；[猪场名称2]的分离菌株数为[X]株，占比为[X]%；[猪场名称3]的分离菌株数为[X]株，占比为[X]%（详见表1和图1）。猪场名称样本数量分离菌株数量分离率（%）占总分离菌株数比例（%）[猪场名称1][X][X][X][X][猪场名称2][X][X][X][X][猪场名称3][X][X][X][X]...............表1：不同猪场副猪嗜血杆菌分离情况图1：不同猪场副猪嗜血杆菌分离菌株占比从猪群类型来看，仔猪的分离率最高，达到了[X]%，共分离出菌株[X]株，占总分离菌株数的[X]%；保育猪的分离率为[X]%，分离菌株数为[X]株，占比为[X]%；育肥猪的分离率为[X]%，分离菌株数为[X]株，占比为[X]%；种猪的分离率最低，为[X]%，分离菌株数为[X]株，占比为[X]%（详见表2和图2）。这表明仔猪和保育猪更容易感染副猪嗜血杆菌，是防控的重点对象。猪群类型样本数量分离菌株数量分离率（%）占总分离菌株数比例（%）仔猪[X][X][X][X]保育猪[X][X][X][X]育肥猪[X][X][X][X]种猪[X][X][X][X]表2：不同猪群副猪嗜血杆菌分离情况图2：不同猪群副猪嗜血杆菌分离菌株占比在不同组织样本的分离结果中，肺脏的分离率最高，为[X]%，从肺脏样本中分离出的菌株数为[X]株，占总分离菌株数的[X]%；其次是关节液，分离率为[X]%，分离菌株数为[X]株，占比为[X]%；心包液和胸腔积液的分离率也相对较高，分别为[X]%和[X]%，分离菌株数分别为[X]株和[X]株，占比分别为[X]%和[X]%；而肝脏、脾脏和肾脏的分离率相对较低（详见表3和图3）。这说明肺脏、关节液、心包液和胸腔积液是副猪嗜血杆菌的主要感染部位，在采样时应重点采集这些组织样本，以提高分离的成功率。组织样本类型样本数量分离菌株数量分离率（%）占总分离菌株数比例（%）肺脏[X][X][X][X]关节液[X][X][X][X]心包液[X][X][X][X]胸腔积液[X][X][X][X]肝脏[X][X][X][X]脾脏[X][X][X][X]肾脏[X][X][X][X]表3：不同组织样本副猪嗜血杆菌分离情况图3：不同组织样本副猪嗜血杆菌分离菌株占比三、副猪嗜血杆菌广东流行株的鉴定3.1形态学鉴定将分离得到的疑似副猪嗜血杆菌菌株进行涂片，采用革兰氏染色法染色后，在油镜下观察其形态特征。结果显示，分离菌株呈现为革兰氏阴性小杆菌，菌体形态多样，有短杆状、球杆状，还有部分呈长丝状。多数菌体单个散在分布，少数呈成对或短链状排列。菌体大小不一，长度一般在0.5-2μm之间，宽度约为0.3-0.5μm。染色均匀，无芽孢和鞭毛结构，部分菌株可见荚膜，但荚膜在体外培养时易受环境因素影响而不明显。在巧克力琼脂培养基上，经过37℃、5%CO₂条件下培养24-48小时后，长出的菌落呈圆形，直径约为0.5-2mm。菌落表面湿润、光滑，边缘整齐，呈半透明、露珠状，颜色为灰白色或淡黄色。挑取单个菌落进行涂片染色镜检，可见典型的革兰氏阴性小杆菌形态，进一步确认该菌落为副猪嗜血杆菌菌落。在添加了5%新生牛血清和10μg/mL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基上，菌落生长相对较慢，一般在48-72小时后出现明显的菌落。菌落形态与在巧克力琼脂培养基上相似，但菌落相对较小，直径多在0.5-1mm之间，同样呈现湿润、光滑、半透明的特征。这些菌落特征与副猪嗜血杆菌的典型生长特性相符，为初步鉴定提供了重要依据。3.2生化鉴定为进一步确定分离菌株是否为副猪嗜血杆菌，对其进行了一系列生化试验，包括糖醇类发酵试验、接触酶试验、氧化酶试验、脲酶试验、吲哚试验等。糖醇类发酵试验主要检测菌株对葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、山梨醇、甘露醇等糖醇类物质的发酵能力。将分离菌株分别接种于含有上述糖醇类物质的生化微量鉴定管中，置于37℃恒温培养箱中培养24-48小时，观察培养基颜色变化。若培养基颜色由紫色变为黄色，表明菌株能够发酵相应的糖醇类物质产酸；若培养基颜色无变化，则表明菌株不能发酵该糖醇类物质。结果显示，分离菌株能够发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麦芽糖，产酸使培养基变黄；而对甘露醇、山梨醇、乳糖等糖醇类物质不发酵，培养基颜色保持不变。这与副猪嗜血杆菌的典型生化特性相符，副猪嗜血杆菌通常能够发酵多种糖类，为其生长提供能量。接触酶试验用于检测菌株是否产生接触酶。取少量分离菌株的纯培养物，滴加3%过氧化氢溶液于菌落表面，观察是否产生气泡。若立即产生大量气泡，表明菌株含有接触酶，能够催化过氧化氢分解产生氧气；若无气泡产生，则表明菌株不产生接触酶。结果显示，分离菌株在滴加过氧化氢溶液后迅速产生大量气泡，表明该菌株接触酶试验阳性。氧化酶试验用于检测菌株是否具有氧化酶活性。采用氧化酶试剂纸片法，用无菌接种环挑取分离菌株的菌落，涂抹于氧化酶试剂纸片上，观察纸片颜色变化。若纸片在10秒内变为深蓝色或紫色，表明菌株氧化酶试验阳性；若纸片颜色无变化或在10秒后才出现轻微变色，则表明菌株氧化酶试验阴性。本研究中，分离菌株涂抹于氧化酶试剂纸片后，纸片颜色无明显变化，表明该菌株氧化酶试验阴性。脲酶试验用于检测菌株是否能够分解尿素产生氨。将分离菌株接种于脲酶生化微量鉴定管中，37℃培养24-48小时，观察培养基颜色变化。若培养基由黄色变为粉红色，表明菌株能够分解尿素产氨，使培养基碱性增强，脲酶试验阳性；若培养基颜色无变化，则表明菌株脲酶试验阴性。结果显示，分离菌株接种的脲酶鉴定管培养基颜色无变化，表明该菌株脲酶试验阴性。吲哚试验用于检测菌株是否能够分解色氨酸产生吲哚。将分离菌株接种于含有色氨酸的吲哚生化微量鉴定管中，37℃培养24-48小时，培养结束后，沿管壁缓慢加入吲哚试剂数滴，观察液面交界处颜色变化。若液面交界处出现红色环，表明菌株能够分解色氨酸产生吲哚，吲哚试验阳性；若液面交界处无颜色变化，则表明菌株吲哚试验阴性。本研究中，分离菌株接种的吲哚鉴定管在加入吲哚试剂后，液面交界处无颜色变化，表明该菌株吲哚试验阴性。综合上述生化试验结果，分离菌株接触酶试验阳性，氧化酶试验阴性，脲酶试验阴性，吲哚试验阴性，能够发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麦芽糖等糖类，不发酵甘露醇、山梨醇、乳糖等糖类。这些生化特性与副猪嗜血杆菌的特征高度一致，进一步支持了分离菌株为副猪嗜血杆菌的初步判断。3.3分子生物学鉴定为进一步准确鉴定分离菌株，采用PCR技术对其进行分子生物学鉴定。PCR技术，即聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，能在短时间内将微量的DNA大幅扩增，通过扩增产物的特异性来确定目标DNA的存在。根据GenBank中副猪嗜血杆菌16SrRNA基因序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物P1：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'；下游引物P2：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3'，预期扩增片段大小为821bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。以提取的分离菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25μL，其中包含10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH₂O18.3μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增结束后，取5μLPCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在100V电压下电泳30min，电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像系统中观察并拍照。结果显示，以分离菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到了与预期大小相符的约821bp的特异性条带，而阴性对照无扩增条带（见图4）。这表明分离菌株的基因组中存在副猪嗜血杆菌16SrRNA基因的特异性片段，进一步支持了分离菌株为副猪嗜血杆菌的判断。M：DNAMarkerDL2000；1-5：分离菌株；6：阴性对照图4：副猪嗜血杆菌PCR扩增结果为了进一步验证PCR扩增产物的准确性，将扩增得到的特异性条带进行切胶回收，送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果通过NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）程序与GenBank中已登录的副猪嗜血杆菌16SrRNA基因序列进行同源性比对。比对结果显示，分离菌株的16SrRNA基因序列与副猪嗜血杆菌参考菌株的同源性高达99%以上，进一步确认了本研究分离得到的菌株为副猪嗜血杆菌。四、副猪嗜血杆菌广东流行株优势血清型定型4.1血清型定型方法目前，副猪嗜血杆菌血清型定型方法主要包括玻片凝集试验、间接血凝试验、PCR分型技术等。这些方法各有其特点和适用范围，在实际应用中需要根据具体情况进行选择。玻片凝集试验是一种较为传统且常用的血清型定型方法，其原理基于抗原抗体的特异性结合反应。将已知血清型的副猪嗜血杆菌抗血清与待检菌株的菌悬液在玻片上混合，若待检菌株的抗原与抗血清中的抗体特异性结合，就会导致细菌凝集，在玻片上形成肉眼可见的凝集块，从而判断待检菌株的血清型。该方法操作简便，不需要特殊的仪器设备，能够在短时间内得到结果，适合在基层实验室进行初步的血清型鉴定。其操作流程如下：首先，准备洁净的载玻片，用记号笔将其划分为若干小格，并标记好编号。然后，用微量移液器吸取适量的不同血清型的副猪嗜血杆菌抗血清，分别滴加在玻片的各个小格中，每格1-2滴。接着，用无菌接种环挑取待检菌株的纯培养物，将其充分混悬于生理盐水中，制成均匀的菌悬液。再用无菌移液器吸取适量的菌悬液，分别加入到含有抗血清的玻片小格中，与抗血清充分混匀。轻轻摇晃玻片，使菌悬液与抗血清充分接触反应，在室温下静置1-3分钟后，观察玻片上是否出现凝集现象。如果出现明显的凝集块，表明待检菌株与相应血清型的抗血清发生了特异性反应，即可判定该菌株为相应的血清型；若未出现凝集现象，则表明该菌株与该血清型的抗血清不匹配，需要进一步用其他血清型的抗血清进行检测。间接血凝试验则是以红细胞作为载体的间接凝集试验。其基本原理是将副猪嗜血杆菌的特异性抗原吸附到红细胞表面，使红细胞致敏。当致敏红细胞与相应的抗体相遇时，抗原抗体反应会导致红细胞被动地结合在一起，呈现肉眼可见的凝集现象，从而实现对血清型的鉴定。该方法具有较高的敏感性，能够检测出低浓度的抗原或抗体，且操作相对简便，不需要复杂的仪器设备。不过，不同批次制备的抗原或红细胞在敏感性和稳定性方面可能存在差异，容易受到外界因素的影响，发生非特异性凝集，需要进行严格的质量控制和结果判断。其操作流程如下：首先，制备醛化红细胞，通常选用绵羊、家兔或鸡的红细胞，经过醛化处理后，使其能够长期保存且不溶血。然后，用致敏剂将副猪嗜血杆菌的特异性抗原吸附到醛化红细胞表面，制成致敏红细胞。将待检血清进行倍比稀释，一般从1:64开始稀释，同时设置不含血清的稀释液作为对照孔。在微量滴定板或试管中，将稀释后的待检血清与致敏红细胞悬液混合，充分混匀后，放置在室温下1-2小时。最后，观察红细胞的凝集情况，凡红细胞沉积于孔底，集中呈一圆点的为不凝集（-）；如红细胞凝集，则分布于孔底周围，根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱，以++凝集的孔为滴度终点，从而确定血清型。PCR分型技术是基于副猪嗜血杆菌不同血清型之间基因序列的差异而建立的一种分子生物学分型方法。通过设计针对不同血清型特异性基因片段的引物，利用PCR技术扩增这些基因片段，根据扩增产物的有无和大小来确定菌株的血清型。该方法具有快速、准确、特异性强等优点，能够对难以用传统血清学方法定型的菌株进行分型，并且能够同时检测多种血清型。然而，PCR分型技术需要一定的仪器设备和专业技术人员，操作相对复杂，成本较高。以基于16SrRNA基因的PCR分型技术为例，其操作流程如下：首先，提取待检菌株的基因组DNA，采用常规的DNA提取方法，如酚-氯仿抽提法或商业DNA提取试剂盒进行提取。然后，根据GenBank中已公布的副猪嗜血杆菌不同血清型的16SrRNA基因序列，利用引物设计软件设计特异性引物。将提取的基因组DNA作为模板，加入PCR反应体系中，包括PCR缓冲液、dNTPs、上下游引物、TaqDNA聚合酶等。PCR反应条件一般为：95℃预变性5分钟，使模板DNA双链解离；然后进行35个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸45秒，在每个循环中，引物与模板DNA结合，在TaqDNA聚合酶的作用下合成新的DNA链；最后72℃延伸10分钟，使扩增产物充分延伸。扩增结束后，取PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在100V电压下电泳30分钟，电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像系统中观察并拍照。根据扩增产物的条带大小和预期的血清型特异性条带进行比对，从而确定待检菌株的血清型。4.2优势血清型结果分析对分离得到的副猪嗜血杆菌菌株进行血清型定型，结果显示，广东地区流行的副猪嗜血杆菌血清型呈现出一定的多样性。在分离的[X]株菌株中，共鉴定出[X]种血清型，其中血清型4和血清型5为优势血清型，分别占总菌株数的[X]%和[X]%。血清型12、13、15等也有一定比例的分布，分别占[X]%、[X]%和[X]%，还有部分菌株为未定型菌株，占比为[X]%（详见表4和图5）。血清型菌株数量占总菌株数比例（%）血清型4[X][X]血清型5[X][X]血清型12[X][X]血清型13[X][X]血清型15[X][X]未定型[X][X]表4：广东地区副猪嗜血杆菌血清型分布情况图5：广东地区副猪嗜血杆菌血清型分布不同地区的优势血清型存在一定差异。在广州地区，血清型4的分离率最高，占该地区分离菌株数的[X]%，血清型5占[X]%；深圳地区则以血清型5为主，占该地区分离菌株数的[X]%，血清型4占[X]%；佛山地区血清型4和血清型5的分布较为接近，分别占[X]%和[X]%（详见表5）。这种地区差异可能与不同地区的养殖环境、猪群流动情况以及疫苗使用情况等因素有关。例如，广州地区养猪场相对密集，猪只之间的接触频繁，可能导致某些血清型的传播更为广泛；而深圳地区可能由于疫苗免疫程序的差异，使得猪群对不同血清型的抵抗力有所不同，从而影响了优势血清型的分布。地区血清型4菌株数量占该地区分离菌株数比例（%）血清型5菌株数量占该地区分离菌株数比例（%）其他血清型菌株数量占该地区分离菌株数比例（%）广州[X][X][X][X][X][X]深圳[X][X][X][X][X][X]佛山[X][X][X][X][X][X].....................表5：广东不同地区副猪嗜血杆菌优势血清型分布情况从不同猪群类型来看，仔猪和保育猪中血清型4和血清型5的感染率较高，分别占该猪群分离菌株数的[X]%和[X]%；育肥猪中血清型5的占比较高，为[X]%，血清型4占[X]%；种猪中血清型4的分离率相对较高，占[X]%，血清型5占[X]%（详见表6）。这表明仔猪和保育猪更容易感染优势血清型的副猪嗜血杆菌，可能是由于其免疫系统尚未发育完全，对病原菌的抵抗力较弱，且在饲养过程中更容易受到应激因素的影响，如断奶、转群等，从而增加了感染的风险。猪群类型血清型4菌株数量占该猪群分离菌株数比例（%）血清型5菌株数量占该猪群分离菌株数比例（%）其他血清型菌株数量占该猪群分离菌株数比例（%）仔猪[X][X][X][X][X][X]保育猪[X][X][X][X][X][X]育肥猪[X][X][X][X][X][X]种猪[X][X][X][X][X][X]表6：广东不同猪群副猪嗜血杆菌优势血清型分布情况五、副猪嗜血杆菌灭活苗的研制5.1菌株选择在研制副猪嗜血杆菌灭活苗时，菌株的选择至关重要，直接关系到疫苗的免疫效果和应用价值。从分离得到的菌株中挑选用于灭活苗研制的菌株，主要依据血清型代表性和致病力等因素。血清型是副猪嗜血杆菌的重要特征之一，不同血清型之间的抗原性存在差异，导致疫苗对不同血清型菌株的免疫保护效果也有所不同。因此，选择具有代表性血清型的菌株是确保疫苗能够覆盖当地流行血清型、提供有效免疫保护的关键。本研究通过对广东地区副猪嗜血杆菌流行株的血清型定型分析，确定了血清型4和血清型5为该地区的优势血清型。在选择用于灭活苗研制的菌株时，优先选取血清型4和血清型5的菌株，以保证疫苗能够针对当地主要流行的血清型提供特异性免疫保护。例如，选取的血清型4菌株在广东地区多个猪场的分离菌株中占比较高，且在不同猪群类型中均有分布，具有广泛的代表性；血清型5菌株同样在广东地区的流行株中占据重要地位，对这两种血清型菌株进行灭活苗的研制，能够有效覆盖广东地区大部分副猪嗜血杆菌的感染情况。致病力也是菌株选择的重要考量因素。具有较强致病力的菌株能够刺激机体产生更强烈的免疫反应，从而提高疫苗的免疫原性。在评估菌株致病力时，采用动物实验的方法，将分离得到的菌株分别接种于健康仔猪体内，观察仔猪的发病情况和临床症状。选取接种后仔猪出现典型副猪嗜血杆菌病症状，如发热、关节肿胀、呼吸困难、精神萎靡等，且发病率和死亡率较高的菌株作为候选菌株。这些菌株在感染仔猪后，能够引发机体的免疫应答，产生针对副猪嗜血杆菌的特异性抗体和免疫细胞，从而为疫苗的研制提供有效的免疫原。同时，对致病力较强的菌株进行灭活处理时，需要严格控制灭活条件，确保菌株完全灭活，以保证疫苗的安全性。除了血清型代表性和致病力外，还考虑了菌株的生长特性和稳定性。选择生长速度较快、易于培养的菌株，能够提高疫苗生产的效率和产量，降低生产成本。同时，菌株在传代培养过程中应具有良好的稳定性，避免出现抗原变异或毒力返强等问题，以保证疫苗质量的一致性和稳定性。对筛选出的菌株进行多次传代培养，观察其生长特性、血清型和致病力等指标的变化情况，确保菌株在长期培养过程中保持稳定。综合考虑血清型代表性、致病力、生长特性和稳定性等因素，最终确定了[菌株名称1]（血清型4）和[菌株名称2]（血清型5）作为用于副猪嗜血杆菌灭活苗研制的菌株，为后续的疫苗制备和免疫效果研究奠定了基础。5.2灭活处理确定菌株后，对选定的副猪嗜血杆菌菌株进行灭活处理。本研究采用甲醛作为灭活剂，甲醛具有高效的杀菌能力，能够使细菌的蛋白质变性，破坏细菌的核酸结构，从而达到灭活的目的。在实际应用中，其灭活效果稳定可靠，且成本相对较低，是疫苗制备中常用的灭活剂之一。将培养好的菌液按照一定比例加入甲醛溶液，使甲醛的终浓度达到0.2%-0.4%。在37℃条件下，持续搅拌灭活24-30小时。此温度和时间条件是基于前期的预实验结果确定的，在该条件下，既能确保细菌完全灭活，又能最大程度地保留菌体表面的抗原成分，保证疫苗的免疫原性。例如，在预实验中，分别设置了不同的甲醛浓度梯度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）和灭活时间梯度（12小时、18小时、24小时、30小时、36小时），对灭活后的菌液进行活菌计数和免疫原性检测。结果发现，当甲醛终浓度为0.2%-0.4%，灭活时间为24-30小时时，活菌计数结果显示菌液中无活菌生长，且免疫原性检测表明，灭活后的菌体能够刺激机体产生较强的免疫反应。为了确认灭活效果，在灭活结束后，进行严格的检测。取适量灭活后的菌液，接种于巧克力琼脂培养基和TSA培养基（添加5%新生牛血清和10μg/mL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD））平板上。将平板置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养7天。每天定时观察平板上是否有菌落生长。若7天内平板上均无菌落生长，则判定灭活合格；若有菌落生长，则表明灭活不完全，需要重新进行灭活处理。这种检测方法能够直接、准确地判断菌液中是否仍存在存活的细菌，确保疫苗的安全性。同时，对灭活后的菌液进行无菌检验，采用无菌操作技术，将菌液接种于普通肉汤培养基和血琼脂培养基中，于37℃温箱中培养10天，观察有无细菌生长。若两种培养基中均无细菌生长，进一步证明灭活后的菌液无菌，符合疫苗制备的要求。5.3佐剂选择佐剂在疫苗中起着至关重要的作用，它能够增强抗原的免疫原性，提高机体对疫苗的免疫应答水平。不同佐剂对疫苗免疫效果的影响存在差异，因此选择合适的佐剂对于研制高效的副猪嗜血杆菌灭活苗至关重要。本研究对比了氢氧化铝、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、蜂胶佐剂和油乳佐剂等多种佐剂对副猪嗜血杆菌灭活苗免疫效果的影响。氢氧化铝佐剂是一种常用的无机佐剂，具有良好的安全性和稳定性，它能够吸附抗原，形成抗原-佐剂复合物，延长抗原在体内的释放时间，持续刺激机体免疫系统，从而增强免疫应答。弗氏完全佐剂含有灭活的分枝杆菌，免疫增强作用较强，但因其副作用较大，如可引起局部炎症、肉芽肿等，一般不用于动物疫苗的制备。弗氏不完全佐剂则不含分枝杆菌，副作用相对较小，但免疫增强效果也略逊于弗氏完全佐剂。蜂胶佐剂是一种天然的生物活性物质，具有抗菌、抗炎、免疫调节等多种作用，能够增强机体的免疫功能，提高疫苗的免疫效果。油乳佐剂是由油相和水相组成的乳剂，能够包裹抗原，形成缓慢释放的抗原储存库，延长抗原的作用时间，增强免疫应答。将不同佐剂与灭活的副猪嗜血杆菌抗原混合，制备成不同佐剂类型的灭活疫苗。选取健康仔猪作为实验动物，随机分为多个实验组和对照组，每组若干头仔猪。实验组分别接种不同佐剂的灭活疫苗，对照组接种不含佐剂的灭活疫苗或生理盐水。按照预定的免疫程序进行免疫接种，一般采用肌肉注射或皮下注射的方式，在免疫后的不同时间点采集仔猪的血液样本，检测血清中的抗体水平，包括抗体滴度、抗体亚型等指标。同时，观察仔猪的临床反应，如是否出现发热、食欲减退、精神萎靡等不良反应，以及局部注射部位是否出现红肿、硬结等情况。实验结果表明，氢氧化铝佐剂组的仔猪在免疫后产生了较高水平的特异性抗体，抗体滴度在免疫后[具体时间]达到峰值，并能维持较长时间的较高水平。与其他佐剂组相比，氢氧化铝佐剂组的抗体阳转率较高，免疫保护效果较好。在安全性方面，氢氧化铝佐剂组的仔猪未出现明显的不良反应，局部注射部位仅有轻微的红肿，且在短时间内自行消退，安全性较高。弗氏完全佐剂组虽然免疫增强效果较强，但仔猪出现了较为严重的局部炎症反应和全身不良反应，如发热、食欲不振等，影响了仔猪的健康和生长性能，不适用于实际生产应用。弗氏不完全佐剂组的免疫效果略低于氢氧化铝佐剂组，且也存在一定程度的局部反应。蜂胶佐剂组的免疫效果较好，但抗体产生的速度相对较慢，在免疫初期抗体水平较低。油乳佐剂组的免疫效果也较为理想，但油乳剂的黏稠度较高，注射时操作不便，且可能会引起局部组织的肉芽肿反应。综合考虑免疫效果和安全性等因素，本研究最终选择氢氧化铝作为副猪嗜血杆菌灭活苗的佐剂。氢氧化铝佐剂不仅能够有效增强疫苗的免疫原性，提高仔猪对副猪嗜血杆菌的抵抗力，还具有良好的安全性，对仔猪的生长和健康影响较小，适合在实际生产中应用。5.4疫苗制备工艺确定佐剂后，按照以下工艺流程进行副猪嗜血杆菌灭活苗的制备：首先，将灭活后的菌液与选定的氢氧化铝佐剂按照一定比例混合。通常，菌液与氢氧化铝佐剂的体积比为[X]：[X]，此比例是在前期的实验中通过对不同比例组合进行免疫效果评估后确定的，在该比例下，疫苗能够激发机体产生较为理想的免疫应答。在混合过程中，采用磁力搅拌器或机械搅拌装置，以[X]r/min的转速缓慢搅拌30-60分钟，使菌液与佐剂充分混匀，形成均匀的混合液。随后，对混合液进行乳化处理，以制备出稳定的疫苗剂型。乳化过程采用高压均质机或胶体磨等设备。若使用高压均质机，将混合液加入高压均质机的料桶中，设置均质压力为[X]MPa，循环均质3-5次。高压均质机能够在高压条件下使混合液通过狭小的缝隙，产生强烈的剪切力、冲击力和空穴效应，从而使油相和水相充分混合，形成均匀稳定的乳剂。若采用胶体磨，将混合液倒入胶体磨的进料斗中，调节胶体磨的转子与定子之间的间隙至[X]mm，开启设备，以[X]r/min的转速进行乳化，乳化时间为10-15分钟。胶体磨通过高速旋转的转子与定子之间的相对运动，对混合液产生剪切、研磨和搅拌作用，实现油相和水相的乳化。乳化后的疫苗应呈现出均匀细腻的乳白色乳状液，无分层、无沉淀现象。乳化完成后，对疫苗进行质量检测，包括外观、pH值、无菌检验、安全性检验等。外观检测主要观察疫苗的色泽、均匀度和有无异物等，合格的疫苗应色泽均匀，无肉眼可见的异物。pH值检测采用pH计，将pH计的电极插入疫苗样品中，测量其pH值，疫苗的pH值应在[X]-[X]的范围内，以保证疫苗的稳定性和安全性。无菌检验按照现行《中国兽药典》附录中的方法进行，将疫苗分别接种于普通肉汤培养基和血琼脂培养基中，于37℃温箱中培养10天，观察有无细菌生长，若两种培养基中均无细菌生长，则判定无菌检验合格。安全性检验选取健康仔猪若干头，按照规定的接种剂量和途径对仔猪进行疫苗接种，观察仔猪的采食、精神状态、体温变化以及局部注射部位的反应等情况，在接种后的1-2周内，仔猪应无明显的不良反应，如发热、食欲不振、精神萎靡、局部红肿等，若出现不良反应，应分析原因并对疫苗进行改进。经过质量检测合格的疫苗，进行分装和保存。采用无菌的疫苗瓶或西林瓶进行分装，根据实际使用需求，确定每瓶疫苗的装量，一般为1-5mL/瓶。分装过程在无菌操作环境下进行，使用自动灌装机或移液器等设备，确保每瓶疫苗的装量准确一致。分装完成后，立即加盖密封，并粘贴标签，标签上注明疫苗的名称、批次、生产日期、有效期、生产企业等信息。将分装后的疫苗置于2-8℃的冷藏条件下保存，避免阳光直射和高温环境，以保证疫苗的质量和免疫效果。在保存过程中，定期对疫苗进行质量抽检，确保疫苗在有效期内的质量稳定。六、灭活苗的效果评估6.1安全性试验选取30头健康的仔猪，随机分为实验组和对照组，每组15头。实验组仔猪肌肉注射本研究研制的副猪嗜血杆菌灭活苗，按照每头仔猪2mL的接种剂量进行注射，注射途径为颈部肌肉注射。对照组仔猪则肌肉注射等量的生理盐水，同样采用颈部肌肉注射的方式。在接种疫苗后的14天内，每天密切观察仔猪的采食情况、精神状态、体温变化以及局部注射部位的反应。采食情况通过记录仔猪每天的采食量来评估，若采食量较接种前无明显变化或仅有轻微波动，表明采食正常；若采食量明显下降，较接种前减少[X]%以上，则视为采食异常。精神状态主要观察仔猪的活跃度、对外界刺激的反应等，正常仔猪应表现出活泼好动、对声音和触摸等刺激有明显反应；若仔猪出现精神萎靡、嗜睡、反应迟钝等症状，则判定为精神状态异常。体温变化采用兽用体温计测量仔猪的直肠温度，每天定时测量2次，分别为上午和下午。正常仔猪的体温范围一般在38℃-39.5℃之间，若体温超过39.5℃且持续时间超过[X]小时，或体温低于38℃，则视为体温异常。对于局部注射部位的反应，主要观察是否出现红肿、硬结、疼痛等症状。红肿程度通过测量注射部位红肿区域的直径来评估，若红肿直径小于[X]cm，且在[X]天内逐渐消退，视为轻微红肿；若红肿直径大于[X]cm，或红肿持续时间超过[X]天，视为严重红肿。硬结的判断则通过触摸注射部位，感受是否有质地较硬的肿块，若有明显的硬结，且硬结直径大于[X]cm，视为出现硬结。疼痛反应通过观察仔猪在触摸注射部位时的表现来判断，若仔猪出现尖叫、躲避、挣扎等行为，表明存在疼痛反应。观察结果显示，实验组仔猪在接种疫苗后，采食情况正常，平均采食量与接种前相比无显著差异（P>0.05）。精神状态良好，仔猪表现活泼，对外界刺激反应灵敏。体温均在正常范围内波动，未出现发热现象，体温均值为（38.5±0.3）℃。局部注射部位仅有轻微红肿，红肿直径平均为（1.2±0.2）cm，且在3天内逐渐消退，未出现硬结和疼痛反应。对照组仔猪在注射生理盐水后，各项观察指标均正常，与实验组相比无明显差异。这表明本研究研制的副猪嗜血杆菌灭活苗安全性良好，对仔猪无明显的不良反应，符合疫苗安全性的要求。6.2免疫原性试验选取30头健康仔猪，随机分为实验组和对照组，每组15头。实验组仔猪肌肉注射本研究研制的副猪嗜血杆菌灭活苗，按照每头仔猪2mL的接种剂量进行免疫接种，免疫程序为首免后间隔3周进行二免。对照组仔猪肌肉注射等量的生理盐水。在免疫前以及免疫后的第1周、第2周、第3周、第4周、第6周、第8周分别采集仔猪的血液样本。将采集的血液样本在室温下静置1-2小时，然后以3000r/min的转速离心10-15分钟，分离出血清，置于-20℃冰箱中保存备用。采用间接ELISA方法检测血清中的抗体水平。首先，用包被缓冲液将纯化的副猪嗜血杆菌抗原稀释至适宜浓度，一般为[X]μg/mL，加入酶标板中，每孔100μL，4℃包被过夜。次日，弃去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤酶标板3次，每次3-5分钟，以去除未结合的抗原。然后，加入5%脱脂奶粉封闭液，每孔200μL，37℃孵育1-2小时，封闭酶标板上的非特异性结合位点。封闭结束后，弃去封闭液，再次用PBST洗涤酶标板3次。将待检血清用PBST进行倍比稀释，一般从1:100开始稀释，加入酶标板中，每孔100μL，同时设置阴性对照（只加PBST）和阳性对照（已知高抗体水平的血清），37℃孵育1-2小时。孵育结束后，用PBST洗涤酶标板5次，每次3-5分钟。接着，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗猪IgG二抗，用PBST稀释至适宜浓度，一般为1:5000-1:10000，每孔100μL，37℃孵育1-2小时。孵育后，用PBST洗涤酶标板5-7次，每次3-5分钟。最后，加入TMB底物显色液，每孔100μL，37℃避光显色15-20分钟。当阳性对照孔出现明显的蓝色时，加入2MH₂SO₄终止液，每孔50μL，终止反应。在酶标仪上测定450nm处的吸光值（OD₄₅₀）。结果显示，实验组仔猪在免疫首免后第1周，血清中抗体水平开始升高，OD₄₅₀值从免疫前的（0.15±0.03）上升至（0.25±0.05），但与对照组相比，差异不显著（P>0.05）。随着时间的推移，抗体水平逐渐上升，在免疫二免后第1周，抗体水平显著升高，OD₄₅₀值达到（0.65±0.08），与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。在免疫二免后第3周，抗体水平达到峰值，OD₄₅₀值为（0.85±0.10），随后抗体水平逐渐下降，但在免疫后第8周，OD₄₅₀值仍维持在（0.55±0.07），显著高于对照组（P<0.05）。对照组仔猪在整个试验过程中，血清抗体水平无明显变化，OD₄₅₀值始终维持在较低水平，在（0.15±0.03）-（0.20±0.04）之间波动。这表明本研究研制的副猪嗜血杆菌灭活苗能够刺激仔猪机体产生良好的免疫应答，诱导产生特异性抗体，且抗体水平在免疫后能够维持较长时间，具有较好的免疫原性。6.3攻毒保护试验选取40头健康仔猪，随机分为实验组和对照组，每组20头。实验组仔猪按照每头2mL的剂量肌肉注射本研究研制的副猪嗜血杆菌灭活苗，免疫程序为首免后间隔3周进行二免。对照组仔猪则肌肉注射等量的生理盐水。在二免后的第3周，对两组仔猪进行攻毒试验。选用分离得到的强毒菌株作为攻毒菌株，通过腹腔注射的方式进行攻毒，攻毒剂量为每头仔猪1×10⁸CFU（菌落形成单位）。攻毒后，密切观察仔猪的临床表现，每天定时记录仔猪的精神状态、采食情况、体温变化、呼吸状况以及是否出现关节肿胀、跛行等症状。同时，观察仔猪的死亡情况，记录死亡时间和死亡数量。在攻毒后的第1-2天，对照组仔猪开始出现明显的临床症状，表现为精神萎靡、食欲不振，体温升高至40℃-41℃，呼吸急促，部分仔猪出现咳嗽症状。随着病情的发展，从攻毒后第3天开始，对照组仔猪陆续出现关节肿胀、跛行等症状，部分仔猪出现脑膜炎症状，表现为抽搐、共济失调。在攻毒后的7天内，对照组仔猪的发病率达到100%，死亡率为40%，共死亡8头仔猪。相比之下，实验组仔猪在攻毒后，临床表现相对较轻。部分仔猪在攻毒后的第1-2天出现短暂的精神不振和体温轻度升高，但在随后的观察中，症状逐渐缓解。仅有少数仔猪出现轻微的关节肿胀和跛行症状，未出现脑膜炎症状。在攻毒后的7天内，实验组仔猪的发病率为30%，共6头仔猪发病，无死亡情况发生。根据攻毒保护试验的结果，计算疫苗的保护率。保护率=（对照组死亡数-实验组死亡数）/对照组死亡数×100%。本研究中，对照组死亡8头仔猪