植物组织培养实验操作手册

植物组织培养实验操作手册植物组织培养依托植物细胞全能性，通过无菌操作将离体器官、组织或细胞培养为完整植株，是遗传转化、种质保存及种苗快繁的核心技术。本手册围绕实验准备、核心流程、问题解决展开，为科研与生产提供实用参考。一、实验准备阶段（一）仪器与设备准备无菌操作类：超净工作台（提前30分钟开紫外灭菌，使用前通风15分钟）、高压蒸汽灭菌锅（检查水位与密封圈，确保压力稳定）、恒温培养箱（校准温度，调控光照时长/强度）。辅助类：电子天平（精度0.001g）、pH计（校准后测培养基酸碱度）、磁力搅拌器（溶解培养基）、解剖镜（观察外植体）、培养瓶/组培盒（提前灭菌备用）。（二）试剂与培养基制备1.基础试剂消毒剂：75%乙醇（外植体表面消毒）、2%次氯酸钠（加1-2滴吐温-80增强渗透性，现配）、无菌水（高压/过滤灭菌）。培养基成分：MS培养基干粉（或自行配制母液）、蔗糖（碳源）、琼脂（固化剂）、植物激素（如6-BA、NAA，需过滤灭菌）。2.MS培养基母液配制（以1L为例）大量元素：NH₄NO₃16.5g、KNO₃19g、CaCl₂·2H₂O4.4g、MgSO₄·7H₂O3.7g、KH₂PO₄1.7g，溶解定容，4℃保存。微量元素：MnSO₄·4H₂O22.3mg、ZnSO₄·7H₂O8.6mg等，溶解定容，4℃保存。铁盐：FeSO₄·7H₂O2.78g、Na₂-EDTA·2H₂O3.73g，混合加热溶解，定容后4℃避光保存。有机成分：肌醇10g、烟酸0.05g等，溶解定容，4℃保存。3.培养基配制流程1.取400mL蒸馏水（配500mL培养基），加热至60-70℃，加7-10g/L琼脂，搅拌至融化。2.依次加入MS母液（大量元素10mL、微量元素1mL等）、30g/L蔗糖，搅拌溶解。3.加激素（如增殖培养基加2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA），调pH至5.8。4.分装至培养瓶（每瓶30-40mL），封口膜封瓶，标记配方与日期。4.培养基灭菌高压灭菌：121℃，15-20分钟（含激素培养基不超过20分钟）。过滤灭菌：不耐高温激素（如GA₃），培养基灭菌后冷却至50-55℃，超净台内用0.22μm滤膜过滤后加入。二、外植体处理与接种（一）外植体选择与预处理选取健壮、无病虫害植株，剪取茎段、叶片等（如烟草用茎段，菊花用叶片）。流水冲洗30分钟，吸干水分备用。（二）无菌消毒流程1.酒精处理：外植体入75%乙醇浸泡30-60秒（嫩材料短，老材料长），无菌水冲1次。2.次氯酸钠处理：转入2%次氯酸钠（加吐温-80）浸泡5-15分钟，期间晃动。3.无菌水冲洗：用无菌水冲3-5次，吸干水分，避免残留消毒剂损伤材料。（三）接种操作工作台消毒：超净台内用75%乙醇擦台面、工具，紫外线灭菌10分钟。人员操作：戴无菌手套，乙醇消毒双手，避免交谈/大幅度动作。外植体切割与接种：无菌滤纸上，手术刀切外植体（茎段留1-2芽，叶片切0.5cm²块），迅速接种至培养基（切口接触/插入培养基）。接种密度：每瓶5-10个外植体，避免拥挤。三、培养与继代管理（一）培养条件控制温度：多数植物23-27℃（烟草25℃，兰花22℃），昼夜温差2-3℃。光照：2000-3000lux，12-16小时/天（暗培养用黑布遮光）。湿度：培养箱内70%-80%，避免培养基失水/污染。（二）继代培养组培苗长至3-5cm或丛生芽布满瓶底时，超净台内分苗（去除褐化/污染材料），接种至新鲜增殖培养基（激素配比可调整，如增殖过旺降细胞分裂素浓度）。（三）生根培养苗高2-3cm、茎秆健壮时，转入生根培养基（如1/2MS+0.5mg/LNAA，蔗糖20g/L）。1-2周生根，3-4周根系发达后炼苗。四、炼苗与移栽（一）炼苗处理移栽前3-5天，打开培养瓶封口膜，温室（20-25℃，60%-70%湿度）炼苗，适应外界环境。（二）移栽基质准备基质配方：蛭石:草炭:珍珠岩=1:1:1（多肉用蛭石:珍珠岩=2:1），基质高压灭菌/暴晒消毒。（三）移栽操作取出组培苗，洗净根部培养基（避免伤根），移栽至基质，浇透定根水（加50%MS营养液）。遮阴（70%遮光率）3-5天，保持基质湿润，后逐渐增光，1-2周后正常管理。五、常见问题与解决策略（一）污染问题真菌污染：培养基现白色/绿色菌丝，因外植体带菌/环境灭菌差。解决：延长次氯酸钠处理时间，定期换超净台滤膜，封瓶紧密。细菌污染：培养基现黏液状菌落，因操作不规范/材料带菌。解决：操作前严格消毒，换外植体来源，培养基加头孢霉素（50-100mg/L）。（二）褐化问题外植体切口变褐、培养基加深，因酚类氧化。解决：消毒后泡0.1%维生素C，培养基加PVP（1-2g/L），缩短接种时间。（三）玻璃化问题组培苗茎秆透明、叶肉薄，因湿度大/激素失衡。解决：降细胞分裂素浓度，增琼脂至10g/L，改善通风，降培养湿度。六、实验记录与优化（一）详细记录记录外植体来源、消毒时间、培养基配方、生长状态（污染率、增殖系数等