义翘讲堂《Elispot技术全景解读：原理、操作要点及行业应用》

王旭曼高级质控经理北京义翘神州科技股份有限公司ELISpot技术全景解读：原理、操作要点及行业应用CONTENT义翘神州123ELISpot技术简介ELISpot操作流程及常见问题解析ELISpot技术的应用4义翘神州ELISpot产品及检测服务介绍01义翘神州ELISpot技术简介义翘神州ELISpot技术原理

酶联免疫斑点检测（Enzyme-LinkedImmunoSpotAssay,ELISpot）：免疫细胞在刺激物存在的条件下被激活，其分泌的细胞因子/免疫球蛋白被ELISpot板底PVDF膜上（预包板）的特异性单抗捕获，去除细胞后，被捕获的细胞因子与生物素标记的检测抗体结合，随后通过与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的亲和素结合，加入底物显色后，PVDF膜上出现的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过酶联免疫斑点分析仪（ELISpotReader）对斑点进行自动计数和分析。ELISA

检测的是无生命的溶液中抗原分子的浓度。ELISpot检测的是有生物活性的活细胞分泌抗原的功能。ELISAELISpot原理都是基于抗原抗体反应，ELISpot实际上就是ELISA的延伸和新的发展测定对象抗体捕获的抗原来自样品溶液中的已经存在的、均匀分布的蛋白分子抗体捕获的抗原来自于样品细胞在检测的当时新鲜分泌的蛋白分子或抗体检测板普通96孔酶标板PVDF膜96孔板检测方式通过显色反应，在酶标仪上测吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白的含量通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，通过ELISpot分析系统对斑点进行计数，计算出分泌该蛋白的细胞的频率义翘神州添加标题添加标题先驱发展创立底板材质的改进检测内容的多样化预包被

多因子检测

荧光斑点FluoroSpot塑料微孔板作为固相材料酶标记的二抗显色底物为琼脂糖的凝胶DonMason：“胶片上的斑点技术”盖玻片上包被抗原置于细胞培养皿的皿底分泌的特异性抗体与抗原结合加入B细胞加入放射性碘同位素标记二抗玻片上覆盖胶片放射自显影Sedgwich与Czerkinsky：ELISpot技术的发展历程义翘神州0103050204高灵敏度单细胞水平功能性检测高通量检测直观，可信度高只要阳性细胞频率大于4个/60万细胞，就可以被ELISpot检测出来。这算出来的实际灵敏度为十五万分之一。细胞对刺激物的反应能力和分泌细胞因子的能力ELISpot技术优势02义翘神州ELISpot操作流程及常见问题义翘神州ELISpot检测方法原理ELISpot检测T细胞原理BiotinALPanti-IgG/biotin细胞分泌的IgGBiotinALP细胞分泌的IgGanti-IgGBiotinALP细胞分泌的IgGanti-IgGanti-IgG/biotin抗原特异性IgGELISpotTotalIgGELISpotELISpot检测B细胞原理ELISpot操作流程BiotinALP捕获抗体检测抗体分析物SASASASA抗原抗原义翘神州捕获抗体包被在培养孔底加入细胞及刺激物，阳性细胞分泌细胞因子，被包被的抗体捕获移除细胞，板底留下细胞因子的潜在“影像”加入二抗，形成“抗体-抗原-抗体”夹心结构斑点计数加入底物，形成斑点ELISpot一般操作流程无菌操作无须无菌操作ELISpot操作流程1.PVDF膜酒精浸润2.PBS洗涤三次3.加包被抗体过夜PBS洗涤三次封闭，室温2小时PBS洗涤三次加入细胞和刺激物于37℃含5%CO2培养箱中培养24-48h4.5.6.7.去除细胞，PBST洗涤5次加检测抗体，室温孵育2小时PBST洗涤5次

加二抗(HRP或AP）室温孵育1hPBST洗涤5次加入

底物显色计数，结果分析8.9.10.11.1213.14.第1天第2天第4天义翘神州悬浮在ELISpot膜板上的细胞，均匀地向四面八方分泌细胞因子，没有方向性的扩散，其中路径越短，扩散中耗散损失就越少，到达该点的细胞因子就越多，将来显色的时候颜色就越深。圆形，有晕核结构斑点的特征大小不均一，成正态分布ELISpot斑点的直径通常是50-150μm同一类阳性细胞，受到相同的刺激，产生的斑点大小也不完全相同。这些斑点大小不一，但是如果把它们的直径统计出来，这发现它们呈正态分布的。ELISpot结果分析义翘神州斑点分析底物的选择着色稍牢固但斑点松散HRP酶TMB底物着色牢固背景干净ALP酶BCIP/NBT底物颜色鲜艳但易褪色HRP酶AEC底物有效斑点的定义：通常为圆形或椭圆形，边缘清晰，大小均一（与阴性对照斑点明显区分）。阴阳性对照及实验组需设置一致的参数（如斑点大小、强度阈值）。ELISpot结果分析AIDiSpotReader

荧光酶联免疫斑点分析仪（可见光/荧光双重检测功能的ELISPOT分析仪）义翘神州ELISpot检测的是阳性细胞的频率，也就是出斑点的细胞占整个加入细胞的比例。ELISpot检测的单位被定义为，每百万细胞中阳性细胞的数目，英文SFC(Spots

Forming

cell)。有足够的抗原呈递细胞APCPBMC和小鼠脾脏淋巴细胞都含有足够的APC，在特定的细胞浓度下都会发挥正常的抗原呈递功能刺激物种类终浓度范围(μg/ml)细胞数线性范围推荐数目孵育时间/推荐非特异性PHA2-205,000-400,000/well100,000/well16-36h/18hConA4-40Ionomycin0.5-1PMA50-100特异性Tcellepitope1-1050,000-600,0000/well200,000/well16-24h/18hpeptide4-40200,000-600,0000/well300,000/well24-36h/30hprotein10-100300,000-600,0000/well400,000/well24-36h/30hELISpot结果分析刺激物浓度、细胞数目和孵育时间义翘神州阳性判断标准：mouseIL-2ELISpot阴性对照组实验组空白组阳性对照组细胞铺板数量：2x105/孔自动化设备斑点分析ELISpot结果分析标准阈值要求适用场景2倍背景法实验组≥2×阴性对照均值初步筛选、快速判断均值+2×SD实验组≥阴性对照均值+2×标准差NIH疫苗研究、常规实验均值+3×SD实验组≥阴性对照均值+3×标准差高严谨性研究（如临床试验）固定Cut-off值SFC≥10（且≥2倍背景）FDA/EMA推荐、文献资料阴性对照实验组NumberofSpots4377SFC201883细胞-+++刺激物--++义翘神州1.斑点过少、过多影响斑点形成的因素：主要原因：斑点过多：细胞密度过大斑点过少：细胞数密度低及刺激物浓度偏低改善方法：通过预实验调整细胞数量、抗体浓度及孵育时间设立阴阳性对照2.5x105

细胞/孔1x105

细胞/孔0.5x105

细胞/孔ELISpot常见问题及解析抗体对的质量刺激物的特异性及刺激时间细胞密度膜的材质及处理方式洗板条件及次数

干扰因素-内毒素污染、培养基成分、细胞凋亡义翘神州2.有空白区域无斑点未刺激组刺激组主要原因是PVDF膜板活化问题：膜自身问题乙醇活化过程渗漏

改善方法：活化时人工质控使用不可拆的PVDF膜板乙醇处理后立即加水稀释，避免活化过度对膜造成损伤ELISpot常见问题及解析义翘神州3.背景颜色过深正常显色显色背景深未刺激组刺激组主要原因是洗涤不充分：死细胞释放DNA/蛋白或细胞碎片，非特异性吸附到膜上洗涤不充分改善方法：用预冷的去离子水低渗裂解细胞10min用纯PBS洗涤5次（每次200μL），第一次洗涤孵育时间久一些，甩掉孔里面的洗涤液要用力显色液要过滤后使用，终止显色反应时使用纯PBS或去离子水，避免使用自来水。ELISpot常见问题及解析义翘神州4.细胞凋亡对结果的影响高背景、无斑点主要原因是细胞凋亡有30％细胞凋亡，完全不会出斑点；即使5％凋亡，也有严重影响改善方法：细胞制备及处理阶段，注意无菌操作、温和处理细胞保证细胞活率，洗涤细胞用预冷PBS减少细胞应激反应。预孵育或者密度梯度离心去除死细胞后，再做ELISpot实验ELISpot常见问题及解析03义翘神州ELISpot技术的应用义翘神州ELISpot技术的应用疫苗研发基因与细胞治疗临床诊断器官移植基础研究自身免疫与过敏疾病肿瘤免疫研究感染性疾病研究义翘神州公认标准：国际上普遍采用ELISpot方法监测HIV疫苗研究中的免疫应答反应，在国际艾滋病疫苗行动计划中，采用ELISpot法对T细胞功能进行评价。ELISpot技术：疫苗免疫效果评价的有效工具原文链接：/10.4102/ajlm.v10i1.1056国际艾滋病疫苗倡议组织，评估非洲和欧洲经认证实验室在支持HIV疫苗临床试验过程中的ELISpot检测能力。义翘神州疫苗诱导的T细胞反应：作者对51名参与者（1μg-60μg剂量组）的外周单个核细胞（PBMCs）采用体外IFN-γELISpot法来检测疫苗接种个体在起始剂量前（第1天）和第29天（1-50μg人群加强免疫的后7天）后的CD4+和CD8+T细胞的反应。参考文献：Sahin,U.,Muik,A.,Derhovanessian,E.

etal.

COVID-19vaccineBNT162b1elicitshumanantibodyandTH1Tcellresponses.

Nature

(2020).

原文链接：/10.1038/s41586-020-2814-7ELISpot技术：疫苗免疫效果评价的有效工具义翘神州ELISpot技术：CAR-T基础研究、工艺开发、临床评估中均发挥关键作用参考文献：LeyuanMa,AlexanderHostetler,DuncanM.Morgan,etal.

Vaccine-boostedCARTcrosstalkwithhostimmunitytorejecttumorswithantigenheterogeneity

[J]

Cell,

July

20,2023.取不同治疗组小鼠脾脏T细胞，ex

vivo用肿瘤细胞刺激，ELISpot检测：CAR-T细胞+疫苗Vax强效介导小鼠脾脏T细胞对肿瘤细胞产生反应04义翘神州义翘神州ELISpot产品及检测服务介绍义翘神州组成成分数量Pre-coatedmicroplate1plate(96tests)DetectionAntibody1vialStreptavidin-ALP1vialBCIP/NTB-plusDilution1bottleBCIP/NTB-plusSolutionA1bottleBCIP/NTB-plusSolutionB1bottlepositivestimulationreagent1vial产品陆续更新中，敬请期待！产品名称货号Mouse

IFN-γ

(ALP)ELISpotKitEK50709AMouse

IL-2

(ALP)ELISpotKitEK51061AMouse

IL-4

(ALP)ELISpotKitEK51084AMouseTNF-α(ALP)ELISpotKitEK50349AHuman

IL-2

(ALP)ELISpotKitEK11848AHuman

IL-4

(ALP)ELISpotKitEK11846AHuman

IFN-γ

(ALP)ELISpotKitEK11725AELISpot上线产品义翘神州SinoBiologicalCompetitorMMouseIFN-γELISpotKitELISpot产品对比义翘神州检测因子：Mouse

IFN-γ

研究方向：病毒疫苗细胞免疫分析应用领域：疫苗评价SinoBiological（cat：EK50709A）Internationalbrands反馈结论：斑点清晰，背景干净，实验结果优于进口品牌ELISpot产品客户案例分享PBS肽义翘神州客户使用3个批次盒子分别3次独立实验结果PBS肽+357313392353360PBS肽+386333292423530PBS肽+224382417292430批次01批次02批次03反馈结论：义翘神州的不同批次显色效果稳定，而目前使用的某品牌的不同批次经常有显色效果不一致的情况ELISpot产品客户案例分享义翘神州服务内容及范围：ELISpot检测服务、读板服务药物筛选、药效评价疫苗评价免疫学、基础研究项目名称ELISpot检测服务内容试剂盒来源□义翘产品□义翘代购买

□客户提供靶点/试剂盒名称注意：写明种属如HumanormouseIFN-γ样品数量样品类型□人全血

□小鼠脾脏

□其它样品检测要求阳性对照：□每个样品一个阳性

□

个阳性对照

□其它阴性对照：□每个样品一个阴性

□

个阴性对照

□其它样品重复：

□

双复孔

□三复孔交付给客户内容结果数据、检测报告样品要求（1）样本需冷藏保存运输,无污染；（2）客户自己提供试剂盒应确保试剂盒在效期内并按照试剂盒说明进行运输保存；分析检测服务：ELISpot检测服务CRO服务现货供应生物试剂9,300+重组蛋白15,000+抗体50,000+基因ELISA试剂盒、无血清培养基、GMP级核酸酶...义翘神州坚持自主研发生产，打造生命科学研究和创新药物研发“一站式”试剂与服务支撑平台重组抗体生产免疫检测重组蛋白表达生物安全检测一站式技术服务ELISA试剂盒开发抗体制备高度定制化10天：从基因合成到抗体/蛋白交付每年：自主开发2000种以上重组蛋白和抗体自主研发并独立掌握：以蛋白、抗体为核心的生物试剂创新研发全套关键技