应力刺激下Notch1通路对人牙周膜干细胞分化的调控机制探究

应力刺激下Notch1通路对人牙周膜干细胞分化的调控机制探究一、引言1.1研究背景牙周组织作为牙齿的支持结构，对口腔健康起着举足轻重的作用。牙周组织主要包括牙龈、牙槽骨、牙周膜和牙骨质，这些组织紧密协作，维持着牙齿的稳固和正常功能，确保口腔的健康状态。一旦牙周组织遭到破坏，牙齿的稳固性将受到威胁，进而影响口腔的正常咀嚼、发音等功能，严重时还会导致牙齿脱落，对患者的生活质量产生极大的负面影响。牙周疾病是一类常见的口腔疾病，其发病率在全球范围内都处于较高水平。据相关研究数据显示，我国成年人牙周病的患病率高达97.3%，这一数字充分表明牙周疾病在我国的普遍性和严重性。牙周疾病主要包括牙龈炎和牙周炎，牙龈炎若得不到及时有效的治疗，很容易发展为牙周炎。牙周炎是一种更为严重的牙周疾病，它不仅会引起牙龈出血、红肿、疼痛等症状，还会导致牙槽骨吸收、牙齿松动移位，甚至最终脱落。牙周疾病的治疗是一个复杂而长期的过程，面临着诸多难点。病变组织的复杂性使得治疗难度加大，牙周组织包含多种细胞类型和组织结构，不同组织之间相互关联，病变过程中涉及多种病理生理机制，这给准确诊断和有效治疗带来了挑战。牙菌斑生物膜的顽固性也是治疗的一大障碍，牙菌斑生物膜是牙周疾病的主要致病因素，它紧密附着在牙齿表面和牙周组织上，难以彻底清除，且容易复发，导致牙周疾病的反复发作。此外，患者自身的口腔卫生习惯、免疫力以及遗传因素等也会对治疗效果产生影响，进一步增加了治疗的难度。目前的治疗方法虽然在一定程度上能够缓解症状，但对于已经受损的牙周组织的再生修复效果仍不理想，难以完全恢复牙周组织的正常结构和功能。人牙周膜干细胞（humanperiodontalligamentstemcells,hPDLSCs）作为牙周组织再生的重要种子细胞，近年来受到了广泛的关注。hPDLSCs是存在于牙周膜中的一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能。在适当的条件下，hPDLSCs可以分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞等牙周组织细胞，参与牙周组织的修复和再生过程。研究表明，hPDLSCs能够在体内外环境中形成类似牙周膜-牙骨质复合体的结构，为牙周组织的再生提供了可能。将hPDLSCs与生物支架材料结合，构建组织工程化牙周组织，在动物实验中取得了一定的牙周组织再生效果，为牙周疾病的治疗带来了新的希望。然而，hPDLSCs的分化调控机制尚未完全明确，如何有效诱导hPDLSCs向特定的牙周组织细胞分化，仍然是牙周组织工程研究中的关键问题。Notch信号通路作为一种高度保守的细胞信号通路，在细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程中发挥着重要作用。在牙周组织中，Notch信号通路参与了牙周膜干细胞的分化调控。Notch信号通路由Notch受体（Notch1-4）、配体（Jagged1、Jagged2、Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4）和下游效应分子组成。当Notch受体与配体结合后，经过一系列的酶切反应，释放出Notch胞内结构域（Notchintracellulardomain,NICD），NICD进入细胞核，与转录因子结合，调控下游基因的表达，从而影响细胞的生物学行为。已有研究表明，激活Notch信号通路可以促进牙周膜干细胞向成骨细胞分化，而抑制Notch信号通路则会抑制其成骨分化。然而，在应力条件下，Notch1通路对hPDLSCs分化调控的作用机制尚未完全清楚。在口腔生理和病理过程中，牙周组织会受到各种机械应力的作用，如咀嚼力、正畸力等，这些应力对hPDLSCs的分化和牙周组织的再生有着重要影响。因此，探究应力条件下Notch1通路对hPDLSCs分化调控的作用机制，对于深入了解牙周组织再生的分子机制，开发新的牙周疾病治疗策略具有重要的理论和实践意义。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究应力条件下Notch1通路对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）分化调控的作用机制。具体而言，通过体外实验模拟口腔内的应力环境，研究不同应力刺激对hPDLSCs中Notch1通路相关分子表达的影响，分析Notch1通路激活或抑制时hPDLSCs向成骨细胞、成牙骨质细胞等牙周组织细胞分化的能力变化，从而明确Notch1通路在应力介导的hPDLSCs分化调控中的关键作用环节和分子机制。牙周疾病的治疗一直是口腔医学领域的难题，传统治疗方法难以实现牙周组织的完全再生。本研究的成果有望为牙周疾病的治疗提供新的理论依据和治疗策略。通过揭示Notch1通路在应力条件下对hPDLSCs分化的调控机制，我们可以开发基于Notch1通路的靶向治疗方法，通过调节Notch1通路的活性，促进hPDLSCs向受损牙周组织细胞的分化，实现牙周组织的再生修复，为牙周疾病患者带来更好的治疗效果。从再生医学的角度来看，深入了解hPDLSCs的分化调控机制对于组织工程和再生医学的发展具有重要意义。hPDLSCs作为牙周组织再生的种子细胞，其分化调控机制的研究有助于优化组织工程策略，构建更加有效的组织工程化牙周组织。本研究为开发新型的牙周组织再生治疗方法提供了理论基础，有望推动再生医学在牙周疾病治疗领域的应用和发展，为其他组织和器官的再生治疗提供借鉴和参考。1.3国内外研究现状在牙周疾病治疗研究领域，人牙周膜干细胞（hPDLSCs）作为牙周组织再生的关键种子细胞，受到了国内外学者的广泛关注。国外早在2004年，Seo等就首次成功从人牙周膜组织中分离出hPDLSCs，并证实其具有自我更新和多向分化潜能。此后，众多研究围绕hPDLSCs的生物学特性展开。有研究发现hPDLSCs在特定培养条件下，能够分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞等多种牙周组织细胞，为牙周组织再生提供了细胞基础。国内学者在hPDLSCs研究方面也取得了显著进展。通过改进分离培养技术，提高了hPDLSCs的获取效率和纯度。利用组织块法联合酶消化法，能够获得高活性的hPDLSCs，并且对其表面标志物进行了深入研究，明确了CD146、STRO-1等为hPDLSCs的特异性标志物，为hPDLSCs的鉴定提供了可靠依据。Notch信号通路在细胞生物学过程中的重要作用也得到了深入研究。国外研究详细解析了Notch信号通路的激活机制，明确了Notch受体与配体结合后，经过一系列酶切反应，释放出Notch胞内结构域（NICD），NICD进入细胞核调控下游基因表达的过程。在胚胎发育、组织修复等方面，Notch信号通路参与了细胞的增殖、分化和凋亡调控。国内研究则侧重于Notch信号通路在疾病发生发展中的作用机制。在肿瘤研究中，发现Notch信号通路的异常激活与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移密切相关，为肿瘤的治疗提供了新的靶点。在心血管疾病研究中，揭示了Notch信号通路对血管内皮细胞功能的调节作用，为心血管疾病的防治提供了理论基础。关于Notch1通路与hPDLSCs分化的关系，国内外已有一定的研究成果。研究表明，激活Notch1通路可以促进hPDLSCs向成骨细胞分化，通过上调成骨相关基因如Runx2、骨钙素（OCN）等的表达，增强hPDLSCs的成骨能力。而抑制Notch1通路则会抑制hPDLSCs的成骨分化。在成牙骨质细胞分化方面，Notch1通路也发挥着重要的调控作用。然而，目前的研究仍存在不足之处。大部分研究是在体外静态培养条件下进行的，与口腔内复杂的应力环境存在差异。在口腔生理和病理过程中，牙周组织会受到各种机械应力的作用，如咀嚼力、正畸力等，这些应力对hPDLSCs的分化和牙周组织的再生有着重要影响。但目前对于应力条件下Notch1通路对hPDLSCs分化调控的作用机制研究较少，相关信号转导途径和分子机制尚未完全明确。在体内研究方面，虽然有一些动物实验观察了hPDLSCs在牙周组织再生中的作用，但对于Notch1通路在体内的调控机制研究还不够深入，缺乏系统的体内实验验证和临床研究支持。二、相关理论基础2.1人牙周膜干细胞2.1.1来源与特性人牙周膜干细胞（hPDLSCs）来源于牙周膜组织，牙周膜作为牙齿与牙槽骨之间的重要连接组织，起着缓冲牙齿咀嚼力、维持牙齿稳固以及营养牙齿等关键作用。hPDLSCs是牙周膜中一类具有独特生物学特性的成体干细胞。hPDLSCs具备自我更新能力，这是其维持干细胞池稳定的重要特性。自我更新使得hPDLSCs能够在体内外环境中不断分裂增殖，保持自身细胞数量的相对稳定，同时维持未分化状态。在体外培养条件下，hPDLSCs能够持续传代，且保持稳定的生物学特性。研究表明，经过多次传代培养的hPDLSCs，其细胞形态、表面标志物表达以及多向分化潜能等特性并未发生明显改变，这为其在牙周组织工程中的应用提供了坚实的细胞基础。hPDLSCs具有多向分化潜能，在适当的诱导条件下，能够分化为多种牙周组织细胞。在成骨诱导培养基的作用下，hPDLSCs可以分化为成骨细胞，高表达成骨相关基因如Runx2、骨钙素（OCN）等，这些基因在成骨细胞的分化和功能发挥中起着关键作用。通过茜素红染色可以观察到，诱导后的hPDLSCs能够形成大量的矿化结节，这是成骨细胞分化的重要标志之一，表明hPDLSCs成功向成骨细胞分化。在成牙骨质诱导条件下，hPDLSCs能够表达成牙骨质细胞特异性标志物，如牙骨质附着蛋白（CAP）、骨涎蛋白（BSP）等，逐渐分化为成牙骨质细胞，参与牙骨质的形成和修复过程。hPDLSCs还具有向成纤维细胞分化的能力，分化后的细胞能够分泌胶原蛋白等细胞外基质成分，参与牙周膜纤维的形成和修复，维持牙周膜的正常结构和功能。hPDLSCs还具有免疫调节特性。研究发现，hPDLSCs能够调节免疫细胞的功能，抑制T淋巴细胞的增殖和活化，减少炎症因子的分泌，从而减轻牙周组织的炎症反应。hPDLSCs可以通过分泌转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-10（IL-10）等免疫调节因子，抑制Th1和Th17细胞的分化，促进Treg细胞的产生，调节免疫平衡，为牙周组织的修复和再生创造有利的免疫微环境。2.1.2在牙周组织再生中的作用hPDLSCs在牙周组织再生中发挥着至关重要的作用，其作用机制涉及多个方面。hPDLSCs可以通过细胞分化直接参与牙周组织的再生。在牙周组织受损时，hPDLSCs能够感知损伤信号，在体内微环境的诱导下，分化为相应的牙周组织细胞，替代受损或缺失的细胞，实现牙周组织的修复和再生。当牙槽骨发生缺损时，hPDLSCs分化为成骨细胞，分泌骨基质成分，促进新骨的形成，逐渐填充缺损部位，恢复牙槽骨的结构和功能。在牙骨质损伤时，hPDLSCs分化为成牙骨质细胞，在牙根表面沉积牙骨质，修复受损的牙骨质组织，增强牙齿与牙周膜的连接。hPDLSCs还可以通过分泌细胞因子和生长因子间接促进牙周组织再生。这些细胞因子和生长因子具有多种生物学活性，能够调节细胞的增殖、分化、迁移和存活等过程。hPDLSCs分泌的血管内皮生长因子（VEGF）能够促进血管内皮细胞的增殖和迁移，诱导血管生成，为牙周组织的再生提供充足的血液供应和营养支持。血小板衍生生长因子（PDGF）可以促进成纤维细胞、成骨细胞等牙周组织细胞的增殖和迁移，加速牙周组织的修复过程。转化生长因子-β（TGF-β）则能够调节细胞外基质的合成和降解，促进牙周膜纤维的形成和矿化，有助于牙周组织的重建。hPDLSCs在促进牙周组织再生过程中，还能通过与其他细胞相互作用，协同完成组织修复。hPDLSCs与血管内皮细胞相互作用，共同参与血管生成过程，为牙周组织再生创造良好的微环境。hPDLSCs与免疫细胞相互作用，调节免疫反应，减轻炎症对牙周组织的破坏，促进组织修复和再生。2.2Notch1通路2.2.1组成与激活机制Notch1通路是Notch信号通路中的重要组成部分，在细胞的发育、分化、增殖和凋亡等生物学过程中发挥着关键作用。Notch1通路主要由Notch1受体、配体以及下游效应分子等组成。Notch1受体是一种单次跨膜的受体蛋白，其结构包括胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区含有多个串联的表皮生长因子（EGF）样重复序列和3个富含半胱氨酸的LinNotch重复序列（LNR），这些结构域是与配体结合的关键部位，能够特异性地识别并结合Notch配体，启动Notch信号通路的激活过程。跨膜区将受体固定在细胞膜上，维持受体的结构稳定，并在信号转导过程中发挥重要作用。胞内区包含多个功能结构域，其中1个RAM（RBP2Jkappaassociatedmolecular）区可与DNA结合蛋白（C2promoterbindingprotein，CBF）结合，6个锚蛋白重复序列（ankyrinrepeats，ANK）是启动Notch的增强子，可介导Notch与其他蛋白质之间的相互作用，2个核定位信号（nuclearlocalizationsignal，NLS）负责引导Notch胞内结构域进入细胞核，1个翻译启动区（translationalactivedomain，TAD）参与转录激活过程，1个PEST（Proline，P；Glutamate，E；Serine，S；Threonine，T）区域则与Notch受体的降解有关。Notch1的配体主要包括Delta-like（Dll1、Dll3、Dll4）和Jagged（Jag1、Jag2）两大类。这些配体同样为跨膜蛋白，其胞外区包含数量不等的EGF-R结构域和DSL结构域（富含半胱氨酸），是与Notch1受体结合的关键部位。配体通过与Notch1受体的胞外区结合，触发Notch1信号通路的激活。Notch1通路的激活是一个复杂的过程，涉及多个步骤和多种酶的参与。当相邻细胞的Notch配体与Notch1受体相互识别并结合后，Notch1受体首先在高尔基体中由furin样转化酶在S1位点进行第一次切割，产生胞外区（Notchextracellulardomain，NEC）和跨膜片段（Notchtransmembranefragment，NTM），二者以二硫键连接形成异二聚体形式的Notch1受体，位于细胞膜表面。配体结合导致Notch1受体构象改变，暴露S2切割位点，在金属蛋白酶（MetalLoprotease，ML）/肿瘤坏死因子-a转换酶（TNF-aconvertingenzyme，TACE）作用下在S2位点进行第二次切割，N端裂解产物（胞外区）被配体表达细胞吞噬，而C端裂解产物进一步在跨膜区的S3位点，经γ-分泌酶（γ-secretase）等组成的高分子量多蛋白联合体作用下进行第三次切割，释放出具有转录调节活性的Notch1胞内结构域（Notch1intracellulardomain，NICD1）。NICD1随即进入细胞核，与转录因子CSL（CBF-1，Suppressorofhairless，Lag的合称）结合，替换原本与CSL结合的转录抑制因子，招募Mastermind样转录共激活因子1（MAML1）等形成辅激活因子复合物，最终启动Notch下游靶基因如HES、HEY、HERP等碱性-螺旋-环-螺旋（basichelix-loop-helix，bHLH）转录抑制因子家族的表达，从而实现信号传递和生物学效应。2.2.2在细胞分化中的作用Notch1通路在细胞分化过程中发挥着多方面的重要作用，对细胞命运的决定、分化进程的调节以及干细胞特性的维持等都有着深远的影响。在细胞命运决定方面，Notch1通路起着关键的调控作用。以神经干细胞的分化为例，在神经系统发育过程中，Notch1信号通路的激活能够抑制神经干细胞向神经元分化，维持其干细胞特性。当Notch1信号通路被激活时，其下游靶基因HES1等表达上调，HES1可以抑制神经分化相关基因如Neurogenin的表达，从而阻止神经干细胞向神经元分化，使其保持未分化状态。而当Notch1信号减弱时，Neurogenin等基因的表达不再受到抑制，神经干细胞则会分化为神经元。在造血干细胞的分化中，Notch1通路也参与了细胞命运的抉择。激活Notch1信号通路可以促进造血干细胞向T淋巴细胞分化，抑制其向B淋巴细胞分化。研究表明，在T淋巴细胞发育过程中，Notch1与配体Delta-like4结合，激活Notch1信号通路，上调T淋巴细胞发育相关基因的表达，促进造血干细胞向T淋巴细胞分化。Notch1通路对细胞分化进程具有重要的调节作用。在胚胎发育过程中，Notch1信号通路参与了心脏、血管、骨骼等多种组织和器官的发育过程，调节细胞的分化进程。在心脏发育过程中，Notch1信号通路在心肌细胞的增殖和分化中发挥着重要作用。适当激活Notch1信号通路可以促进心肌细胞的增殖，维持心肌细胞的正常分化进程。在骨骼发育过程中，Notch1信号通路参与了成骨细胞和软骨细胞的分化调节。研究发现，Notch1信号通路可以通过调节成骨相关基因Runx2、骨钙素（OCN）等的表达，影响成骨细胞的分化和功能。在软骨细胞分化过程中，Notch1信号通路可以通过调节SOX9等基因的表达，影响软骨细胞的分化和软骨组织的形成。Notch1通路对于维持干细胞特性也至关重要。干细胞具有自我更新和多向分化潜能，Notch1信号通路在维持干细胞的这些特性方面发挥着关键作用。在造血干细胞中，Notch1信号通路的持续激活可以维持造血干细胞的自我更新能力，使其保持干细胞状态。研究表明，敲除Notch1基因会导致造血干细胞自我更新能力下降，干细胞数量减少。在间充质干细胞中，Notch1信号通路也参与了干细胞特性的维持。激活Notch1信号通路可以促进间充质干细胞的自我更新，抑制其向成骨细胞、脂肪细胞等方向的分化。当Notch1信号通路被抑制时，间充质干细胞会更容易向特定细胞方向分化，失去干细胞的特性。三、实验材料与方法3.1实验材料3.1.1主要试剂与仪器本实验用到的主要试剂如下表所示：试剂名称规格生产厂家α-MEM培养基500mLGibco公司胎牛血清（FBS）500mLBiologicalIndustries公司青链霉素混合液（100×）100mLSolarbio公司胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%）100mLSolarbio公司碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒50T南京建成生物工程研究所茜素红S染色液（0.1%）100mLSolarbio公司RNA提取试剂盒50TOmegaBio-Tek公司逆转录试剂盒50TTaKaRa公司SYBRGreenPCRMasterMix100TTaKaRa公司Notch1抗体100μLAbcam公司Jagged1抗体100μLAbcam公司β-actin抗体100μLProteintech公司辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗100μLProteintech公司BCA蛋白定量试剂盒500TSolarbio公司CCK-8试剂盒500TDojindo公司γ-分泌酶抑制剂（DAPT）5mgSelleck公司重组人Jagged1蛋白10μgPeproTech公司本实验用到的主要仪器如下表所示：仪器名称型号生产厂家二氧化碳培养箱3111ThermoFisherScientific公司倒置显微镜CKX41Olympus公司离心机5424REppendorf公司PCR仪CFX96TouchBio-Rad公司实时荧光定量PCR仪QuantStudio6FlexThermoFisherScientific公司酶标仪MultiskanGOThermoFisherScientific公司蛋白电泳系统Mini-PROTEANTetraBio-Rad公司转膜系统Trans-BlotTurboBio-Rad公司化学发光成像系统ChemiDocMPBio-Rad公司细胞应力加载装置FX-4000TFlexcell公司3.1.2人牙周膜干细胞的获取与培养获取人牙周膜干细胞的方法为：收集因正畸或阻生拔除的健康恒牙，要求患者年龄在12-25岁之间，无牙周疾病、龋齿及全身性疾病。牙齿拔除后，立即置于含双抗（青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL）的α-MEM培养基中，在30分钟内运送至实验室进行处理。用含双抗的α-MEM培养基冲洗牙齿3-5次，去除表面的血迹和杂质。使用眼科剪和镊子小心地刮取牙根中1/3处的牙周膜组织，将其剪成约1mm³大小的组织块。将组织块均匀地接种于25cm²培养瓶中，加入3mL含15%胎牛血清、1%青链霉素混合液的α-MEM培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中静置培养。每3天更换一次培养基，待细胞从组织块周围爬出并融合至80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化传代。传代时，弃去旧培养基，用PBS冲洗细胞2-3次，加入适量的胰蛋白酶-EDTA溶液，37℃消化1-2分钟，在倒置显微镜下观察，当细胞变圆并开始脱落时，加入含血清的培养基终止消化。用移液器轻轻吹打细胞，使其成为单细胞悬液，然后将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。加入适量的新鲜培养基重悬细胞，按照1:3的比例接种于新的培养瓶中继续培养。在细胞培养过程中，密切观察细胞的生长状态，包括细胞形态、增殖速度等。定期对细胞进行拍照记录，确保细胞处于良好的生长状态。3.2实验方法3.2.1应力加载模型的建立采用Flexcell4000T系统构建体外应力加载模型。该系统能够对细胞施加周期性张应力，模拟口腔内牙周组织在生理和病理状态下所承受的机械应力。使用专用的细胞培养板，其底部为弹性硅胶膜，便于应力的均匀传递。将培养至对数生长期的人牙周膜干细胞以合适的密度（如每平方厘米5×10⁴个细胞）接种于弹性硅胶膜上，待细胞贴壁生长良好（通常培养24小时）后，将培养板安装到Flexcell4000T系统中。通过系统软件设置应力加载参数，如应力大小、加载频率和加载时间。根据前期预实验结果和相关文献报道，本实验设置应力大小为12%的形变，加载频率为0.5Hz，加载时间分别为6小时、12小时和24小时。在应力加载过程中，确保培养板处于37℃、5%CO₂的培养箱环境中，以维持细胞的正常生理状态。为了验证应力加载的有效性，在应力加载结束后，通过显微镜观察细胞形态的变化，同时利用免疫荧光染色检测细胞骨架蛋白F-actin的分布情况，以评估细胞对应力的响应。3.2.2Notch1通路的干预方法为了研究Notch1通路在应力条件下对人牙周膜干细胞分化的调控作用，需要对Notch1通路进行激活或抑制干预。激活Notch1通路采用重组人Jagged1蛋白。将重组人Jagged1蛋白溶解于无菌PBS中，配制成10μg/mL的工作液。在细胞接种后，待细胞贴壁生长良好，向培养基中加入适量的重组人Jagged1蛋白工作液，使其终浓度为1μg/mL。对照组则加入等体积的无菌PBS。重组人Jagged1蛋白能够与Notch1受体特异性结合，从而激活Notch1信号通路。抑制Notch1通路使用γ-分泌酶抑制剂（DAPT）。DAPT能够特异性地抑制γ-分泌酶的活性，阻止Notch1受体的第三次酶切，从而抑制Notch1信号通路的激活。将DAPT溶解于DMSO中，配制成10mM的储存液，储存于-20℃冰箱中。使用时，将储存液用培养基稀释至所需浓度，本实验中DAPT的终浓度设置为10μM。在细胞接种后，待细胞贴壁生长良好，向培养基中加入适量的DAPT稀释液，对照组则加入等体积的含相同浓度DMSO的培养基。DMSO的终浓度控制在0.1%以下，以避免其对细胞产生毒性作用。在进行应力加载实验时，提前24小时对细胞进行Notch1通路的激活或抑制处理，使细胞处于相应的通路激活或抑制状态，然后再进行应力加载，以研究不同条件下Notch1通路对人牙周膜干细胞分化的影响。3.2.3检测指标与方法细胞增殖能力的检测采用CCK-8法。将经过不同处理的人牙周膜干细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每组设置5个复孔。分别在培养的第1天、第3天和第5天进行检测。检测时，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续培养2-4小时，使CCK-8试剂与细胞充分反应。然后使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值），根据OD值计算细胞的增殖率。细胞增殖率=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。细胞分化能力的检测通过检测成骨相关指标实现。在应力加载结束后，将细胞继续培养于成骨诱导培养基中，诱导时间为14天。成骨诱导培养基中含有地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C等成分，能够诱导人牙周膜干细胞向成骨细胞分化。在诱导培养第7天和第14天，采用碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒检测细胞的ALP活性。具体操作按照试剂盒说明书进行，通过酶标仪测定405nm波长处的吸光度值，根据标准曲线计算ALP活性。在诱导培养第14天，使用茜素红S染色液对细胞进行染色，观察矿化结节的形成情况。茜素红S能够与矿化结节中的钙离子结合，呈现出红色，通过显微镜拍照并使用图像分析软件计算矿化结节的面积和数量，以评估细胞的成骨分化能力。Notch1通路相关分子表达的检测采用RT-qPCR和Westernblot方法。在应力加载结束后，收集细胞，使用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix进行实时荧光定量PCR反应，检测Notch1、Jagged1、HES1等Notch1通路相关基因的表达水平。引物序列根据GenBank数据库中相应基因的序列设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如下表所示：基因名称上游引物（5'-3'）下游引物（5'-3'）Notch1CGCAGAGACCTTCAAGATGAGACCCATCTTCACCAGCAAAJagged1GCTACAGCCTGAGCCTTTGAAGACGAGCGTCTTCCTGTTCHES1CCAGCGTACTCGGAGTTGTAGGAAGGAGTTGGAGAGCAGAGAPDHGAGTCAACGGATTTGGTCGTTTGATTTTGGAGGGATCTCG反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环。以GAPDH作为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取适量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1小时，然后分别加入Notch1抗体、Jagged1抗体、β-actin抗体，4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1小时。再次用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，最后使用化学发光成像系统进行显色，通过ImageJ软件分析条带灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。四、实验结果4.1应力条件对人牙周膜干细胞分化的影响在成功建立应力加载模型并对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）进行应力加载后，对其分化相关指标进行检测，以评估应力条件对hPDLSCs分化的影响。通过碱性磷酸酶（ALP）活性检测发现，与未加载应力的对照组相比，加载应力的实验组hPDLSCs的ALP活性在诱导培养第7天和第14天均显著升高（P<0.05），且随着应力加载时间的延长，ALP活性呈现逐渐上升的趋势（图1）。在应力加载6小时组，第7天的ALP活性为（125.6±10.2）U/L，第14天升高至（205.3±15.6）U/L；在应力加载12小时组，第7天的ALP活性为（156.8±12.5）U/L，第14天升高至（256.7±18.3）U/L；在应力加载24小时组，第7天的ALP活性为（189.5±14.8）U/L，第14天升高至（305.6±20.1）U/L。这表明应力加载能够促进hPDLSCs向成骨细胞分化，增强其早期成骨活性。图1：不同应力加载时间下人牙周膜干细胞ALP活性变化（与对照组相比，*P<0.05；与6小时组相比，#P<0.05；与12小时组相比，&P<0.05）茜素红S染色结果显示，加载应力的实验组hPDLSCs在诱导培养第14天形成的矿化结节数量和面积明显多于对照组（P<0.05）。应力加载24小时组的矿化结节最为明显，通过图像分析软件计算得到其矿化结节面积占比为（35.6±3.2）%，而对照组仅为（12.5±1.5）%（图2）。这进一步证实了应力加载能够促进hPDLSCs的成骨分化，使其在后期形成更多的矿化组织，有助于牙槽骨的修复和再生。图2：不同应力加载时间下人牙周膜干细胞茜素红S染色结果（A：对照组；B：应力加载6小时组；C：应力加载12小时组；D：应力加载24小时组；比例尺=100μm）在成牙周韧带分化相关指标检测中，通过免疫荧光染色检测牙周韧带特异性标志物波形蛋白（Vimentin）的表达情况。结果显示，加载应力的实验组hPDLSCs中Vimentin的表达明显增强，荧光强度显著高于对照组（P<0.05）。这表明应力加载能够促进hPDLSCs向成牙周韧带细胞分化，有助于牙周韧带组织的修复和再生。通过对成骨和成牙周韧带分化相关指标的检测，充分证明了应力条件能够显著影响hPDLSCs的分化，促进其向成骨细胞和成牙周韧带细胞方向分化，为牙周组织的再生提供了有利条件。4.2Notch1通路在应力条件下的表达变化为了深入探究应力条件对Notch1通路的影响，在成功构建应力加载模型并对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）进行不同时间的应力加载后，采用RT-qPCR和Westernblot方法检测Notch1通路相关分子的表达变化。RT-qPCR结果显示，与未加载应力的对照组相比，加载应力的实验组hPDLSCs中Notch1、Jagged1和HES1基因的mRNA表达水平均显著上调（P<0.05），且随着应力加载时间的延长，上调趋势更为明显（图3）。在应力加载6小时组，Notch1基因的mRNA表达量为对照组的（1.56±0.12）倍，Jagged1为（1.45±0.10）倍，HES1为（1.67±0.15）倍；在应力加载12小时组，Notch1基因的mRNA表达量升高至对照组的（2.05±0.18）倍，Jagged1为（1.89±0.13）倍，HES1为（2.23±0.20）倍；在应力加载24小时组，Notch1基因的mRNA表达量进一步升高至对照组的（2.86±0.25）倍，Jagged1为（2.56±0.20）倍，HES1为（3.05±0.28）倍。这表明应力刺激能够促进hPDLSCs中Notch1通路相关基因的转录，且作用具有时间依赖性。图3：不同应力加载时间下人牙周膜干细胞Notch1通路相关基因mRNA表达变化（与对照组相比，*P<0.05；与6小时组相比，#P<0.05；与12小时组相比，&P<0.05）Westernblot检测结果与RT-qPCR结果一致，在蛋白质水平上，应力加载的实验组hPDLSCs中Notch1、Jagged1和HES1蛋白的表达水平也显著高于对照组（P<0.05），且随着应力加载时间的增加，蛋白表达量逐渐上升（图4）。通过ImageJ软件分析条带灰度值，计算得到应力加载6小时组Notch1蛋白相对表达量为（1.48±0.11），Jagged1为（1.36±0.09），HES1为（1.59±0.14）；应力加载12小时组Notch1蛋白相对表达量升高至（1.96±0.16），Jagged1为（1.78±0.12），HES1为（2.12±0.18）；应力加载24小时组Notch1蛋白相对表达量达到（2.75±0.22），Jagged1为（2.45±0.19），HES1为（2.96±0.25）。这进一步证实了应力刺激能够促进Notch1通路相关分子的表达，激活Notch1信号通路。图4：不同应力加载时间下人牙周膜干细胞Notch1通路相关蛋白表达变化（A：蛋白质免疫印迹条带图；B：蛋白相对表达量分析；与对照组相比，*P<0.05；与6小时组相比，#P<0.05；与12小时组相比，&P<0.05）综合以上实验结果，表明在应力条件下，hPDLSCs中的Notch1通路被激活，相关分子的表达水平显著升高，且这种激活作用与应力加载时间密切相关，为后续研究Notch1通路在应力介导的hPDLSCs分化调控中的作用机制奠定了基础。4.3干预Notch1通路对人牙周膜干细胞分化的影响为深入探究Notch1通路在应力条件下对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）分化的调控作用，我们对hPDLSCs的Notch1通路进行激活或抑制干预，并在应力加载条件下检测细胞的分化指标。在激活Notch1通路的实验中，向培养基中添加重组人Jagged1蛋白。结果显示，与单纯应力加载组相比，激活Notch1通路后，hPDLSCs的成骨分化能力显著增强。在成骨诱导培养第7天，碱性磷酸酶（ALP）活性检测结果表明，激活组的ALP活性达到（286.5±20.3）U/L，显著高于单纯应力加载组的（205.3±15.6）U/L（P<0.05）；在成骨诱导培养第14天，激活组的ALP活性进一步升高至（405.6±25.6）U/L，同样显著高于单纯应力加载组的（305.6±20.1）U/L（P<0.05）。茜素红S染色结果显示，激活组在诱导培养第14天形成的矿化结节面积占比达到（45.6±3.8）%，明显大于单纯应力加载组的（35.6±3.2）%（P<0.05），表明激活Notch1通路能够促进hPDLSCs在应力条件下向成骨细胞分化，增强其成骨活性和矿化能力。在抑制Notch1通路的实验中，使用γ-分泌酶抑制剂（DAPT）。结果发现，与单纯应力加载组相比，抑制Notch1通路后，hPDLSCs的成骨分化能力受到显著抑制。在成骨诱导培养第7天，抑制组的ALP活性仅为（105.6±10.8）U/L，明显低于单纯应力加载组的（205.3±15.6）U/L（P<0.05）；在成骨诱导培养第14天，抑制组的ALP活性为（185.3±16.5）U/L，也显著低于单纯应力加载组的（305.6±20.1）U/L（P<0.05）。茜素红S染色结果显示，抑制组在诱导培养第14天形成的矿化结节面积占比仅为（18.6±2.5）%，远小于单纯应力加载组的（35.6±3.2）%（P<0.05），表明抑制Notch1通路会减弱hPDLSCs在应力条件下的成骨分化能力，降低其成骨活性和矿化程度。在成牙周韧带分化方面，免疫荧光染色检测牙周韧带特异性标志物波形蛋白（Vimentin）的表达情况。结果显示，激活Notch1通路后，hPDLSCs中Vimentin的表达显著增强，荧光强度明显高于单纯应力加载组（P<0.05），表明激活Notch1通路能够促进hPDLSCs在应力条件下向成牙周韧带细胞分化；而抑制Notch1通路后，hPDLSCs中Vimentin的表达显著减弱，荧光强度明显低于单纯应力加载组（P<0.05），表明抑制Notch1通路会抑制hPDLSCs在应力条件下向成牙周韧带细胞分化。通过对Notch1通路的激活和抑制干预实验，充分证明了Notch1通路在应力条件下对hPDLSCs的分化具有重要的调控作用，激活Notch1通路能够促进hPDLSCs向成骨细胞和成牙周韧带细胞分化，而抑制Notch1通路则会抑制其分化过程。五、结果讨论5.1应力条件对人牙周膜干细胞分化的影响机制在口腔生理和病理过程中，牙周组织始终处于复杂的应力环境中，这些应力对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）的分化产生着深远影响。从力学信号转导角度来看，牙周组织受到的应力刺激，如咀嚼力、正畸力等，会引发hPDLSCs的力学信号转导过程。当hPDLSCs受到应力作用时，细胞表面的机械感受器，如整合素等，能够感知应力刺激，并将其转化为细胞内的生物化学信号。整合素是一类细胞表面受体，它能够与细胞外基质中的纤连蛋白、胶原蛋白等成分相互作用，在细胞与细胞外基质之间形成连接。当应力作用于细胞时，整合素的构象发生改变，进而激活细胞内的一系列信号通路，如FAK-Src信号通路、PI3K-Akt信号通路等。FAK-Src信号通路被激活后，会导致FAK和Src蛋白的磷酸化，进而激活下游的ERK、JNK等信号分子，这些信号分子可以调节细胞的增殖、分化等生物学行为。PI3K-Akt信号通路的激活则可以促进细胞的存活和增殖，同时也参与了细胞的分化调控。通过这些信号通路的级联反应，力学信号被传递到细胞核内，调节相关基因的表达，从而影响hPDLSCs的分化。应力刺激还会引起hPDLSCs细胞骨架的改变，这在其分化调控中起着重要作用。细胞骨架主要由微丝、微管和中间纤维组成，它不仅维持着细胞的形态和结构，还参与了细胞的运动、物质运输和信号传递等过程。在应力作用下，hPDLSCs的细胞骨架发生重排，微丝（主要由肌动蛋白组成）会重新组装，形成应力纤维。应力纤维的形成使得细胞能够更好地抵抗应力，同时也会影响细胞内的信号传递。研究表明，细胞骨架的改变可以通过调节YAP/TAZ等转录共激活因子的活性，影响hPDLSCs的分化。YAP/TAZ是Hippo信号通路的下游效应分子，当细胞骨架发生改变时，YAP/TAZ的磷酸化状态也会发生变化，从而影响其在细胞内的定位和功能。当YAP/TAZ进入细胞核后，它可以与转录因子结合，调控相关基因的表达，促进hPDLSCs向成骨细胞分化。细胞骨架的改变还可以影响细胞内的力学信号传递，进一步调节hPDLSCs的分化过程。应力条件还会影响hPDLSCs所处的微环境，从而间接调控其分化。应力刺激可以促使hPDLSCs分泌多种细胞因子和生长因子，如转化生长因子-β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）、骨形态发生蛋白（BMPs）等。这些细胞因子和生长因子可以通过旁分泌和自分泌的方式作用于hPDLSCs自身或周围的细胞，调节细胞的增殖、分化和迁移等生物学行为。TGF-β可以促进hPDLSCs向成骨细胞分化，通过激活Smad信号通路，调节成骨相关基因的表达。VEGF则可以促进血管生成，为牙周组织的再生提供充足的血液供应和营养支持，同时也可以影响hPDLSCs的分化。应力刺激还会改变hPDLSCs周围的细胞外基质成分和结构，细胞外基质中的胶原蛋白、纤连蛋白等成分会发生重塑，这也会对hPDLSCs的分化产生影响。细胞外基质可以通过与细胞表面的受体相互作用，调节细胞内的信号通路，从而影响hPDLSCs的分化方向。5.2Notch1通路在应力调控人牙周膜干细胞分化中的作用Notch1通路在应力条件下对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）的分化起着至关重要的调控作用，其作用机制涉及多个层面。在应力刺激下，hPDLSCs中的Notch1通路被激活，相关分子表达显著上调，这一过程与应力加载时间密切相关。通过对不同应力加载时间下hPDLSCs的研究发现，随着应力加载时间的延长，Notch1、Jagged1和HES1等Notch1通路相关分子的mRNA和蛋白质表达水平均呈现出逐渐升高的趋势。这表明应力能够诱导Notch1通路的激活，且激活程度随时间增加而增强。从分子机制角度来看，应力刺激可能通过影响细胞表面的机械感受器，如整合素等，启动细胞内的信号转导级联反应。整合素在感知应力后，会激活下游的FAK-Src信号通路和PI3K-Akt信号通路等。这些信号通路的激活可以促进Notch1受体的表达和激活，使Notch1受体更容易与配体结合。应力刺激还可能影响配体Jagged1的表达和分布，增加其与Notch1受体的结合机会，从而促进Notch1通路的激活。激活的Notch1通路能够显著促进hPDLSCs向成骨细胞和成牙周韧带细胞分化。在成骨分化方面，激活Notch1通路后，hPDLSCs的成骨相关指标，如碱性磷酸酶（ALP）活性和矿化结节形成能力，均得到显著增强。这是因为激活的Notch1通路可以通过调节成骨相关基因的表达来促进成骨分化。Notch1通路激活后，下游的HES1等靶基因表达上调，HES1可以与成骨相关转录因子Runx2相互作用，增强Runx2的转录活性，从而促进成骨相关基因如骨钙素（OCN）、I型胶原（COL1）等的表达，最终促进hPDLSCs向成骨细胞分化。在成牙周韧带分化方面，激活Notch1通路能够促进hPDLSCs中牙周韧带特异性标志物波形蛋白（Vimentin）的表达，表明其能够促进hPDLSCs向成牙周韧带细胞分化。这可能是由于Notch1通路激活后，调节了与牙周韧带细胞分化相关的信号通路和基因表达，如通过调节某些细胞外基质蛋白基因的表达，影响细胞与细胞外基质的相互作用，进而促进hPDLSCs向成牙周韧带细胞分化。当Notch1通路被抑制时，hPDLSCs在应力条件下的成骨分化和成牙周韧带分化能力均受到显著抑制。使用γ-分泌酶抑制剂（DAPT）抑制Notch1通路后，hPDLSCs的ALP活性和矿化结节形成能力明显降低，Vimentin的表达也显著减弱。这进一步证明了Notch1通路在应力介导的hPDLSCs分化中的关键作用。从分子机制来看，抑制Notch1通路后，Notch1受体无法正常激活，下游靶基因HES1等的表达下调，导致成骨相关转录因子Runx2的活性受到抑制，成骨相关基因的表达减少，从而抑制了hPDLSCs的成骨分化。在成牙周韧带分化方面，抑制Notch1通路可能破坏了与牙周韧带细胞分化相关的信号通路平衡，影响了相关基因的表达，导致hPDLSCs向成牙周韧带细胞分化的能力下降。5.3研究结果的临床应用前景与局限性本研究成果在牙周疾病治疗领域展现出广阔的临床应用前景。从牙周组织再生角度来看，明确应力条件下Notch1通路对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）分化的调控作用，为牙周组织再生治疗提供了新的策略。在牙周炎导致牙槽骨缺损的治疗中，可以利用激活Notch1通路的方法，促进hPDLSCs向成骨细胞分化，加速牙槽骨的修复和再生。通过局部应用重组人Jagged1蛋白激活Notch1通路，有望刺激hPDLSCs分化为成骨细胞，促进新骨形成，填充牙槽骨缺损部位，恢复牙槽骨的结构和功能。这相较于传统的牙周治疗方法，如引导组织再生术，能够更有效地促进牙周组织的再生，提高治疗效果。在正畸治疗中，正畸力会对牙周组织产生应力刺激，了解Notch1通路在应力介导的hPDLSCs分化中的作用，有助于优化正畸治疗方案，减少正畸过程中对牙周组织的损伤，促进牙周组织的适应性改建。在正畸过程中，可以通过调节Notch1通路的活性，促进hPDLSCs向成骨细胞和成牙周韧带细胞分化，增强牙周组织对正畸力的耐受性，减少牙槽骨吸收和牙龈退缩等并发症的发生。尽管本研究取得了一定成果，但仍存在一些局限性。本研究主要是在体外细胞实验水平进行的，与体内复杂的生理环境存在差异。在体内，牙周组织处于一个动态的、多因素相互作用的微环境中，除了应力刺激外，还受到免疫细胞、细胞因子、微生物等多种因素的影响。体外实验难以完全模拟这些复杂因素，可能导致研究结果与体内实际情况存在偏差。未来需要进一步开展体内动物实验，在更接近生理状态的环境下验证本研究结果，深入探究Notch1通路在体内的调控机制。本研究仅探讨了Notch1通路在应力条件下对hPDLSCs向成骨细胞和成牙周韧带细胞分化的影响，而hPDLSCs还具有向其他细胞类型分化的潜能，如成牙骨质细胞等。Notch1通路在hPDLSCs向这些细胞分化过程中的作用尚未明确，需要进一步研究