甲状腺结节细针穿刺的细胞块制备技术

202X甲状腺结节细针穿刺的细胞块制备技术演讲人2026-01-09XXXX有限公司202X目录01.引言07.未来发展方向与挑战03.核心操作流程与技术要点05.临床应用价值与拓展02.技术背景与发展历程04.质量控制与标准化管理06.常见问题与解决方案08.总结甲状腺结节细针穿刺的细胞块制备技术XXXX有限公司202001PART.引言引言在甲状腺结节诊疗领域，细针穿刺细胞学检查（Fine-NeedleAspirationCytology,FNAC）目前被公认为术前诊断的“金标准”。其通过获取少量细胞样本进行形态学评估，可有效鉴别结节良恶性，指导临床决策。然而，传统FNAC涂片技术存在局限性：细胞易重叠、分布不均，血液及黏液成分干扰观察，且难以满足后续免疫组化（IHC）、分子检测等精准诊断需求。在此背景下，细胞块（CellBlock,CB）制备技术应运而生，它将穿刺获取的细胞和组织碎片通过物理或化学方法聚集成块，制成类似组织学石蜡块的结构，不仅弥补了涂片技术的不足，更拓展了FNAC的诊断维度。作为一名长期从事甲状腺病理诊断的从业者，我深刻体会到细胞块制备技术是连接细胞形态学与组织病理学、分子病理学的桥梁，其标准化操作与质量控制直接影响诊断的准确性。本文将系统阐述甲状腺结节细针穿刺细胞块制备技术的原理、流程、质量控制、临床应用及未来发展方向，以期为同行提供技术参考与实践指导。XXXX有限公司202002PART.技术背景与发展历程1传统FNAC涂片技术的局限性传统FNAC涂片依赖细胞学医师的经验，其局限性主要体现在三方面：（1）细胞学形态特征不充分：涂片细胞多呈单层分布，但甲状腺滤泡上皮细胞常因重叠导致核细节（如核沟、核内包涵体）难以观察；此外，胶质、血液及炎性背景易掩盖细胞异型性，增加诊断难度。（2）诊断重复性欠佳：不同医师对涂片细胞的解读存在主观差异，尤其在意义不明的非典型性病变（AUS/FLUS）范畴，诊断一致性仅约50%-60%。（3）后续检测受限：涂片样本量有限，难以支持需大样本量的分子检测（如BRAF、RAS基因突变检测），而甲状腺癌的精准分型与预后评估increasingly依赖分子标志物。2细胞块技术的提出与演进细胞块技术的雏形可追溯至20世纪50年代，但直至21世纪初才在FNAC领域广泛应用。其核心目标是将液态或半液态的穿刺样本转化为固态组织块，实现“类组织学”观察。技术发展历经三个阶段：01-早期手工制备阶段：采用血浆凝血块法，将样本与患者血浆混合后离心，利用纤维蛋白原形成凝集块，但该方法细胞收缩明显，结构保存差。02-改良包埋阶段：引入琼脂、明胶等支持介质，通过物理包裹固定细胞，提升细胞块结构完整性，但仍存在包埋不均匀问题。03-标准化与自动化阶段：随着液基细胞学（LBC）技术的普及，细胞块制备与LBC流程结合，采用专用沉淀管、自动化离心设备及组织处理系统，实现了样本处理标准化、流程化。043当前主流细胞块制备方法比较目前国内外公认的细胞块制备方法主要包括以下四类，其原理、优缺点及适用场景各有侧重：|方法类型|原理|优点|缺点|适用场景||--------------------|-------------------------------------------|-------------------------------------------|-------------------------------------------|-------------------------------------------||血浆凝血块法|样本与血浆混合，凝血酶激活纤维蛋白原形成网状结构|操作简单、成本低|细胞收缩明显，结构易破坏，不适合分子检测|基层医院、样本量极少的紧急情况|3当前主流细胞块制备方法比较|琼脂包埋法|琼脂加热后与样本混合，冷却后形成固态凝胶包埋|细胞结构保存好，切片质量高|操作繁琐，温度控制要求严格|需要高质量形态学观察及IHC检测的样本||液基细胞学沉淀法|LBC处理后剩余沉淀物，经固定、脱水、透明、浸蜡|与LBC流程兼容，标准化程度高，适合分子检测|依赖LBC设备，成本较高|有LBC设备的中心医院，需同时进行涂片和细胞块制备||组织胶法|样本与组织胶（如HistoGel）混合，离心后胶体固化|操作便捷，细胞分布均匀，切片不易破碎|胶体可能影响部分抗原表达|需要快速制备且兼顾形态学与IHC的样本|注：实际工作中，需根据样本类型（如囊性实性混合、血供丰富）、实验室条件及检测需求选择合适方法，其中液基沉淀法与组织胶法因标准化程度高，已成为目前主流推荐方案。XXXX有限公司202003PART.核心操作流程与技术要点核心操作流程与技术要点细胞块制备技术是一门“细节决定成败”的操作艺术，每个步骤均需严格遵循标准化流程，以确保细胞块的质量满足诊断需求。以下以临床应用最广泛的液基细胞学沉淀法和组织胶法为例，分步骤阐述关键操作要点。1样本获取与初步处理1.1穿刺操作规范甲状腺结节FNAC通常使用21-25G注射器，在超声引导下进行穿刺，以获取足够的细胞量（建议至少6-8个pass）。操作需注意：-避免血液过度稀释：穿刺时尽量避开结节内血管丰富的区域，若样本血性明显，可立即更换针筒，弃去前1-2ml血液后再收集样本；-保证组织碎片完整性：对于实性结节，可采用“提插式”穿刺，避免单纯负压吸引导致细胞破碎；-样本分装：若需同时进行涂片和细胞块制备，可将每个pass的样本分别滴于载玻片（涂片2-4张，自然干燥或95%乙醇固定）和含细胞保存液（如ThinPrep保存液）的LBC管中，避免交叉污染。1样本获取与初步处理1.2LBC样本处理流程采用LBC系统（如ThinPrep或AutoCytePrep）处理样本时，需严格按照仪器说明书操作，核心步骤包括：-细胞采集：将穿刺样本直接注入含有保存液的LBC管中，保存液中的乙醇可迅速固定细胞，防止自溶；-细胞清洗：仪器通过梯度离心和过滤去除血液、黏液及杂质，保留有形成分；-细胞转移：清洗后的细胞转移至沉淀管，准备后续细胞块制备。个人经验分享：在临床工作中，曾遇一例甲状腺淋巴瘤患者，穿刺样本血性极重，初涂片因背景干扰难以诊断，后通过LBC系统充分清洗，细胞块中成功保留大量异型淋巴细胞，结合CD20、CD3等IHC染色，明确诊断。这一案例让我深刻认识到，样本前处理的彻底性直接关系到后续诊断的准确性。2固定与保存固定是细胞块制备的关键步骤，其目的是保持细胞形态结构及抗原完整性，防止腐败。常用固定液及选择原则如下：|固定液类型|浓度|作用机制|适用场景|注意事项||------------------|----------------|-------------------------------------------|-------------------------------------------|-------------------------------------------||95%乙醇|95%-100%|使蛋白质变性沉淀，保持细胞结构|LBC样本沉淀物、组织胶混合样本|固定时间需≥2小时，避免过度干燥|2固定与保存|10%中性福尔马林|10%缓冲甲醛溶液|交联蛋白质，保存抗原表位|需进行长期保存或分子检测的样本|固定时间≤24小时，过久固定可能影响DNA提取||Carnoy液|氯仿:乙醇:冰醋酸=6:3:1|适合富含糖原的细胞（如甲状腺滤泡上皮细胞）|需要良好保存糖原或核结构的样本|毒性较强，需在通风橱中使用|操作要点：-固定液体积需确保样本完全浸没，一般固定液与样本体积比例≥10:1；-避免使用含有重金属的固定液（如Bouin液），以免干扰后续IHC染色；-固定后的样本可在4℃保存，但需在1周内完成包埋，以防抗原降解。3细胞块包埋技术包埋是将固定后的细胞转化为固态组织块的核心步骤，不同方法的操作细节差异显著。3细胞块包埋技术3.1液基沉淀法包埋流程（1）离心沉淀：将LBC处理后的沉淀管放入离心机，以1500-2000rpm离心10分钟，弃上清液，底部可见细胞沉淀；（2）脱水透明：依次加入80%乙醇（2ml，离心5分钟）、95%乙醇（2ml，离心5分钟）、100%乙醇Ⅰ（2ml，离心5分钟）、100%乙醇Ⅱ（2ml，离心5分钟），每次弃上清液后加入新的乙醇，彻底去除水分；（3）浸蜡：加入60℃的warmed石蜡（2ml），混匀后离心5分钟，弃上清液，重复1-2次，使细胞完全浸透石蜡；3细胞块包埋技术3.1液基沉淀法包埋流程关键质控点：1-浸蜡温度不宜超过65℃，以免细胞结构破坏；3-脱水不彻底会导致切片时细胞脱落，需确保每步乙醇更换完全；2-包埋时避免产生气泡，可在石蜡中加入少量表面活性剂（如Tween-80）减少气泡产生。4（4）包埋：将石蜡-细胞混合物倒入包埋模具中，冷却凝固后即形成细胞块。3细胞块包埋技术3.2组织胶法包埋流程（1）样本与胶混合：将固定后的细胞沉淀与预热的HistoGel（50-60℃）按1:1比例混合，用移液器轻轻吹打混匀，避免剧烈震荡导致细胞破碎；（2）离心固化：混合液倒入离心管，离心（800-1000rpm，5分钟），使胶体包裹细胞并沉淀于管底；（3）脱蜡处理：将离心管放入冰水中冷却10分钟，使胶体凝固；取出胶块，置于包埋纸中，按常规组织学流程进行脱水、透明、浸蜡（因胶体已固定，脱水时间可较组织缩短）；（4）包埋切片：浸蜡后的胶块包埋于石蜡中，制成细胞块。个人经验总结：组织胶法操作相对简便，尤其适合样本量较少（如仅1个pass）的情况，但需注意胶体与细胞的比例需严格控制——胶体过多会导致切片时“胶层过厚”，细胞分布稀疏；胶体过少则细胞易聚集成团，影响观察。我曾通过反复试验，确定“细胞沉淀+胶体体积=100μl”的最佳比例，显著提升了细胞块的切片质量。4切片与染色技术细胞块的切片厚度与染色质量直接影响形态学观察及IHC检测的准确性。4切片与染色技术4.1切片制备-裱片：切片后立即置于45℃的纯水展片，捞片于防脱载玻片上，60℃烘烤30分钟，防止脱片。03-切片工具：使用一次性刀片或一次性切片刀，避免组织刀反复使用造成的切片卷曲；02-切片厚度：推荐2-4μm，过厚（>5μm）会导致细胞重叠，观察困难；过薄（<2μm）易切片破损，细胞丢失；014切片与染色技术4.2常规染色与特殊染色0102030405-HE染色：作为基础染色，需细胞核（蓝紫色）、细胞质（红色）对比清晰，胶质呈淡粉红色；-特殊染色：-PAS染色：显示糖原，用于甲状腺滤泡性肿瘤的鉴别。-刚果红染色：用于淀粉样变性的诊断，甲状腺髓样癌中常伴淀粉样物质沉积；-铁染色：鉴别含铁血黄素沉积（如陈旧性出血）与黑色素；4切片与染色技术4.3免疫组化染色细胞块的最大优势是支持IHC检测，甲状腺结节常用IHC抗体及意义如下：|抗体名称|阳性意义|应用场景||----------------|-------------------------------------------|-------------------------------------------||TTF-1|甲状腺滤泡上皮起源|鉴别甲状腺癌与转移性癌（如肺腺癌）||PAX8|甲状腺、肾、Müller管上皮起源|鉴别甲状腺癌与乳腺癌等转移性癌|4切片与染色技术4.3免疫组化染色|Galectin-3|甲状腺癌相关标志物（敏感性80%-90%）|辅助诊断甲状腺乳头状癌（PTC）||CK19|滤泡上皮细胞表达，PTC常弥漫阳性|鉴别PTC与良性滤泡性病变||CgA/Syn|神经内分泌标志物|诊断甲状腺髓样癌（MTC）||CT|降钙素，MTC特异性标志物|确诊MTC，术前评估及术后随访|IHC染色质控要点：-设置阳性对照（如甲状腺癌组织）和阴性对照（PBS代替一抗）；-优化抗体稀释浓度和孵育时间，避免非特异性染色；-使用自动染色仪可减少操作误差，提高重复性。XXXX有限公司202004PART.质量控制与标准化管理质量控制与标准化管理细胞块制备的质量控制（QC）是保障诊断准确性的核心环节，需覆盖从样本采集到报告发出的全流程。根据美国病理学家协会（CAP）及国际细胞病理学会（IAC）指南，建议建立以下QC体系：1样本前QC-样本量评估：每个甲状腺结节FNAC至少获取6个pass，涂片细胞量≥10个高倍视野（HPF）的良性细胞，或≥5个HPF的异型细胞，否则视为“不满意样本”，需重新穿刺；-样本拒收标准：样本明显干涸、容器破损、标签信息不全（如无患者ID、穿刺日期）时，需与临床沟通重新采集。2制备过程QC1-操作人员资质：细胞块制备需由经过培训的技术人员完成，掌握离心、包埋、切片等基本技能，定期参加技术培训与考核；2-仪器设备维护：离心机、包埋机、切片机等设备需定期校准，确保参数准确（如离心转速、温度控制）；3-质控样本监测：每月使用已知阳性和阴性的细胞样本（如正常甲状腺细胞系、PTC细胞系）进行制备流程测试，评估细胞块结构完整性、染色效果及IHC符合率。3细胞块质量评价标准合格的细胞块需满足以下标准：-形态学质量：HE染色切片中细胞结构清晰，无大片红细胞或炎性背景干扰，细胞分布均匀；-细胞量充足：切片中可见≥50个甲状腺上皮细胞（或根据诊断需求足够的异型细胞）；-切片质量：无切片折叠、破碎，裱片牢固，脱片率<5%；-IHC有效性：阳性对照染色阳性，阴性对照无着色，目标抗体呈现特异性染色（如TTF-1在甲状腺细胞核阳性）。4不满意样本的处理与改进当细胞块质量不达标时，需分析原因并采取改进措施：-细胞量不足：与临床沟通调整穿刺针型号（如使用25G细针获取更精准样本）或增加穿刺次数；-背景干扰严重：优化LBC清洗参数，或采用组织胶法减少血液影响；-切片质量差：检查切片刀锋利度，调整切片厚度，或更换包埋模具。临床案例反思：曾有一例“甲状腺滤泡性肿瘤”患者，细胞块因脱水不彻底导致切片大量细胞脱落，仅少量细胞可供观察，最终报告为“细胞量不足，无法诊断”。后经分析，发现LBC沉淀物在100%乙醇中离心时间不足，通过延长离心至10分钟并增加一次100%乙醇清洗，后续细胞块切片质量显著改善，成功检出滤泡性癌。这一教训让我深刻认识到，QC不是“走过场”，而是需落实到每个具体操作的细节中。XXXX有限公司202005PART.临床应用价值与拓展临床应用价值与拓展细胞块制备技术已从单纯的辅助诊断工具，发展为甲状腺结节精准诊疗体系的重要组成部分，其临床价值主要体现在以下方面：1提升诊断准确性，减少重复穿刺传统FNAC对甲状腺乳头状癌（PTC）的诊断敏感性约70%-85%，特异性约90%-95%，但对滤泡性肿瘤（如滤泡性腺瘤、滤泡性癌）的诊断特异性仅约60%，因滤泡性癌需血管或包膜侵犯才能确诊，而FNAC难以获取完整结构。细胞块通过连续切片可观察细胞排列方式、滤泡结构及包膜情况，结合IHC（如Ki-67、p53）检测，可提升滤泡性肿瘤的诊断准确性，使重复穿刺率降低20%-30%。2支持分子病理检测，指导精准治疗约70%-80%的甲状腺癌存在驱动基因突变，如BRAFV600E突变（PTC，发生率40%-45%）、RAS突变（滤泡性癌，发生率40%-50%）、RET/PTC重排等。细胞块因含有足够量的DNA/RNA，可满足分子检测需求：-BRAFV600E突变检测：采用PCR或一代测序（Sanger），突变提示PTC高风险，需行甲状腺全切+淋巴结清扫；-BRAF与RAS联合检测：若BRAF阴性而RAS突变，提示滤泡性肿瘤，需结合术中冰冻决定手术范围；-分子分型检测：对于难治性甲状腺癌（如未分化癌、转移性MTC），细胞块可进行NGS检测，指导靶向药物（如索拉非尼、仑伐替尼）选择。2支持分子病理检测，指导精准治疗临床应用实例：一例45岁男性患者，甲状腺结节FNAC初诊为“AUS/FLUS”，细胞块检测出BRAFV600E突变，结合IHC（Galectin-3+、CK19+），修正诊断为“PTC”，临床行甲状腺全切+中央区淋巴结清扫，术后病理证实为微小癌（0.3cm）。这一案例充分体现了细胞块分子检测对临床决策的指导价值。3疑难病例会诊与远程病理细胞块切片具有可重复性、易储存和运输的特点，适合疑难病例的远程会诊。例如，基层医院可将细胞块切片寄送至上级医院，由专家进行形态学观察及IHC复核，避免了涂片易损坏、信息丢失的问题。此外，细胞块还可建立“病理生物库”，长期保存样本，为回顾性研究及新标志物开发提供资源。4教学与科研价值细胞块作为“类组织学”样本，是细胞学教学的优质工具，初学者可通过观察细胞块的滤泡结构、细胞异型性，快速理解甲状腺细胞病理学特征。在科研方面，细胞块结合激光捕获显微切割（LCM）技术，可精准分离目标细胞群（如癌巢、间质细胞），进行基因表达谱分析、蛋白质组学研究，推动甲状腺癌发病机制与靶向治疗的研究进展。XXXX有限公司202006PART.常见问题与解决方案常见问题与解决方案尽管细胞块制备技术已相对成熟，但在实际操作中仍会遇到各类问题，以下总结常见问题及其解决策略：1细胞块中细胞量不足原因：穿刺样本量少、离心不彻底、包埋时细胞丢失。-穿刺时采用“快速提插法”，每个pass旋转针芯180后退出，增加细胞获取量；-组织胶法中减少胶体比例，确保细胞浓度。-离心时增加转速（2000rpm）或延长离心时间（10分钟）；解决方案：2细胞块切片时细胞脱落原因：脱水不彻底、切片过厚、载玻片防脱处理不当。01解决方案：02-增加乙醇清洗次数，确保无水乙醇步骤彻底脱水；03-调整切片厚度至3μm，使用一次性刀片；04-采用多聚赖氨酸或APES防脱载玻片，裱片后60℃烘烤1小时。053IHC染色结果假阴性-优化抗原修复方法（如TGF-β修复液修复10分钟，pH6.0）；04-更换新批次抗体，设置阳性对照验证抗体活性。05-避免固定超过24小时，优先使用95%乙醇固定；03解决方案：02原因：固定时间过长、抗原修复不充分、抗体效价降低。014细胞块中出现大量气泡原因：浸蜡时震荡过度、石蜡温度过高。解决方案：-浸蜡时轻轻混匀，避免剧烈涡旋；-控制石蜡温度在58-60℃，防止石蜡汽化产生气泡；-包埋前静置5分钟，让气泡浮出表面。XXXX有限公司202007PART.未来发展方向与挑战未来发展方向与挑战随着精准医学的发展，甲状腺结节细针穿刺细胞块制备技术将向以下方向演进：1自动化与标准化传统手工制备存在操作差异大、效率低等问题，自动化细胞块制备系统（如ThyroCell®）正逐步应用于临床。该系统通过自动化离心、固定、包埋流程，减少人为误差，提高制备效率，尤其适合样本量大的中心医院。未来，人工智能（AI）辅助的细胞块