强直性脊柱炎：遗传风险剖析与全基因组SNPs连锁及关联研究

强直性脊柱炎：遗传风险剖析与全基因组SNPs连锁及关联研究一、引言1.1研究背景强直性脊柱炎（AnkylosingSpondylitis，AS）是一种主要侵犯骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织及外周关节，并可伴发关节外表现的慢性炎症性疾病，属血清阴性脊柱关节病的范畴。其特征性病理变化是肌腱、韧带、骨骼的附着点病变，以及韧带钙化与骨性强直。AS患者多有关节病变，且大多数先侵犯骶髂关节，逐渐累及脊柱，导致脊柱活动受限，严重时可出现脊柱强直、驼背畸形等，极大地影响患者的生活质量。不仅如此，AS还可能并发主动脉炎、虹膜炎、肾淀粉样变等关节外疾病，给患者的身体健康带来多方面的威胁。流行病学研究表明，AS在全球范围内均有发病，不同种族和地区的发病率存在差异。在白种人中的发病率为0.1%-0.3%，黄种人中的发病率约为0.2%，好发年龄为10-40岁，且男性发病多于女性，病情也相对更严重。家系研究发现，AS存在明显的家族聚集倾向，被列入多基因遗传病范畴。遗传因素在AS的发病中起着重要作用，研究表明，AS的遗传度高达90%以上。人类白细胞抗原B27（HLA-B27）与AS的发病密切相关，90%左右的AS患者HLA-B27呈阳性。然而，HLA-B27阳性人群中仅有约5-10%会发展为AS，这表明除了HLA-B27外，还有其他遗传因素参与了AS的发病过程。全基因组关联研究（Genome-WideAssociationStudy，GWAS）是在全基因组水平上，以单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP）作为分子遗传标记，进行病例-对照关联分析，从而筛选出与复杂性状相关的遗传变异的研究方法。近年来，随着GWAS技术的不断发展和应用，已经发现了多个与AS相关的易感基因位点。这些研究成果为深入了解AS的发病机制提供了重要线索，但目前仍有许多未知的遗传因素有待探索。综上所述，AS作为一种严重影响患者生活质量的慢性疾病，其遗传风险及相关基因的研究具有重要意义。通过深入研究AS的遗传因素，不仅可以进一步揭示其发病机制，为早期诊断和精准治疗提供理论依据，还能为疾病的预防和遗传咨询提供有力支持。1.2研究目的与意义本研究旨在通过全面且深入的研究，系统地探索强直性脊柱炎的遗传风险因素及相关基因，为临床防治工作提供坚实的理论依据。具体而言，研究目的主要涵盖以下几个方面：明确遗传风险因素及风险率：通过在全国范围内开展多中心的遗传流行病学调查，全面收集强直性脊柱炎患者的临床资料和家族史信息，运用科学的统计分析方法，准确寻找影响AS遗传的风险因素。同时，精确计算各级亲属的患病风险率，深入了解AS的遗传风险现状，为遗传咨询和疾病预防提供关键数据支持。寻找易感基因区域及基因：借助全基因组密集型芯片技术，对AS家系的患者进行全基因组扫描，并进行连锁分析，从而精准定位与AS疾病和临床表型相关的易感区域。在此基础上，通过关联分析，在易感区域中深入挖掘与AS发病密切相关的易感基因，进一步揭示AS的发病机制。验证易感基因并探索发病机制：针对全基因组芯片全扫阶段发现的有意义的单核苷酸多态性（SNP），在更大规模的样本中进行验证，以确保研究结果的可靠性和重复性。结合功能基因组学等多学科技术，深入探索这些易感基因在AS发病过程中的作用机制，为开发新的治疗靶点和干预措施奠定理论基础。本研究具有重要的理论意义和临床应用价值：理论意义：深入研究AS的遗传风险因素和相关基因，有助于进一步揭示AS的发病机制，填补该领域在遗传研究方面的部分空白，丰富对多基因遗传病发病机制的认识，为其他复杂疾病的遗传研究提供借鉴和参考。临床应用价值：明确AS的遗传风险因素和风险率，能够为遗传咨询提供科学依据，帮助患者及其家属了解疾病的遗传规律，做出合理的生育决策。确定易感基因区域和基因，有助于开发新的诊断标志物，实现AS的早期诊断和精准治疗，提高治疗效果，改善患者的生活质量，减轻社会和家庭的负担。1.3国内外研究现状在强直性脊柱炎遗传风险研究方面，国内外学者已取得一定成果。早期研究便已明确AS具有显著的遗传倾向和家族聚集性，遗传度高达90%以上。HLA-B27与AS发病的紧密关联也早已被发现，在不同种族人群中，AS患者HLA-B27的阳性率存在差异，如白种人患者中HLA-B27阳性率约为80%-90%，黄种人患者中则约为90%。国内中山大学附属第三医院的研究团队通过对大量AS患者和健康对照人群的研究，进一步深入分析了HLA-B27亚型与AS发病风险及临床表型的关系，发现某些HLA-B27亚型可能与更严重的病情或特定的临床症状相关。国外的研究也在不断探索其他可能影响AS遗传风险的因素。有研究通过对多个AS家系的长期追踪调查，发现除了HLA-B27外，家族中其他遗传背景因素可能在AS发病中起到修饰作用，影响疾病的发病年龄、病情进展速度等。例如，某些基因的多态性可能与AS患者的炎症反应程度相关，进而影响疾病的严重程度。在全基因组SNPs研究领域，近年来随着GWAS技术的广泛应用，国内外均有大量相关研究发表。国外研究团队利用GWAS技术，在欧洲人群中鉴定出多个与AS相关的易感基因位点，如IL23R、ERAP1等基因区域的SNP与AS发病风险显著相关。这些基因参与了免疫调节、细胞因子信号传导等生物学过程，提示AS的发病机制与免疫系统的异常密切相关。国内中山大学附属第三医院等机构的研究人员，通过对中国汉族人群的GWAS分析，也发现了多个新的AS易感基因位点。如在染色体5q14.3区域EDIL3与HAPLN1基因间位点（rs4552569）以及12q12区域的ANO6基因（rs17095830）与AS发病存在关联。这些研究成果为揭示AS在不同种族人群中的遗传异质性提供了重要依据。然而，当前的研究仍存在一些不足之处。首先，虽然已经发现了多个与AS相关的遗传因素，但这些遗传因素仅能解释部分AS患者的发病机制，仍有大量的遗传风险因素尚未被发现。其次，不同种族人群中AS的遗传特征存在差异，目前针对亚洲人群，尤其是中国人群的大规模、深入的遗传研究相对较少，样本量和研究范围有待进一步扩大。此外，对于已发现的易感基因位点，其具体的生物学功能和作用机制尚未完全明确，如何将这些遗传研究成果转化为临床诊断和治疗的有效手段，还需要进一步的探索和研究。二、强直性脊柱炎遗传风险研究2.1强直性脊柱炎概述2.1.1疾病特征强直性脊柱炎是一种主要侵犯中轴关节的慢性炎症性疾病，其病理特征主要表现为附着点炎，即肌腱、韧带、关节囊等附着于骨的部位发生炎症，这是AS区别于其他关节炎的重要病理特点。随着病情的发展，炎症会逐渐导致关节软骨破坏、骨质增生以及关节间隙狭窄，最终可引起关节强直和畸形。AS通常累及的部位包括骶髂关节、脊柱关节和外周关节。骶髂关节是AS最早且最常受累的部位，患者常出现下腰部或臀部疼痛，疼痛可呈间歇性或持续性，活动后可稍缓解，但休息时尤其是夜间疼痛可能加重。脊柱关节受累时，患者会出现脊柱疼痛、僵硬，活动受限，严重时可导致脊柱畸形，如驼背、脊柱侧弯等，使患者的身高降低，身体活动范围严重受限，影响日常生活的诸多方面，如穿衣、洗漱、行走等。外周关节受累相对较少，但也可出现髋、膝、踝等大关节的肿痛，部分患者还可能出现指、趾等小关节的病变，表现为腊肠指（趾），即手指或足趾呈弥漫性肿胀，形似腊肠。除关节症状外，AS还可能伴发多种关节外表现。眼部受累较为常见，可出现葡萄膜炎，表现为眼红、眼痛、视力下降等症状，若不及时治疗，可能导致视力永久性损害。心血管系统受累可表现为主动脉瓣关闭不全、心脏传导阻滞等，影响心脏功能。肺部受累时，可出现肺上叶纤维化，患者可能出现咳嗽、气短等症状，严重影响呼吸功能。此外，AS患者还可能出现肾脏淀粉样变，表现为蛋白尿、肾功能减退等；神经系统受累可出现马尾综合征，表现为下肢感觉和运动障碍、大小便失禁等。这些关节外表现不仅增加了患者的痛苦，也给治疗带来了更大的挑战，严重影响患者的生活质量和身体健康，使患者在身体和心理上都承受着巨大的压力。2.1.2流行病学特征强直性脊柱炎在全球范围内均有发病，但发病率和患病率在不同种族和地区存在明显差异。在白种人群中，AS的发病率约为0.1%-0.3%，患病率相对较高。而在黄种人群中，发病率约为0.2%，如在中国，通过大规模的流行病学调查研究发现，AS的患病率约为0.3%，不同地区之间也可能存在一定的波动。在一些特定的人群或地区，发病率可能会更高，如某些少数民族聚居地区，由于遗传背景相对集中等因素，AS的发病情况可能更为突出。AS的发病年龄通常在10-40岁之间，发病高峰年龄在20-30岁，这一年龄段的患者往往处于学习、工作和生活的关键时期，疾病的发生对他们的个人发展和家庭生活产生严重影响。在性别分布上，男性发病多于女性，男女发病比例约为2-3:1。男性患者病情往往较重，进展较快，更容易出现脊柱强直和关节畸形等严重并发症；而女性患者症状相对较轻，病情进展相对缓慢，且外周关节受累更为常见，有时诊断相对困难，容易导致误诊或漏诊。此外，有家族遗传史的人群，其AS的发病率显著高于普通人群，这进一步表明遗传因素在AS发病中的重要作用。家族中若有AS患者，其一级亲属（父母、子女、兄弟姐妹）的发病风险明显增加，提示遗传因素在AS的发病中起着关键作用，且可能存在多个遗传基因的相互作用以及遗传与环境因素的交互影响。2.2遗传因素对强直性脊柱炎的影响2.2.1遗传倾向与家族聚集性大量的研究和实际病例表明，强直性脊柱炎具有显著的遗传倾向和家族聚集性。许多家系研究为这一观点提供了有力的证据，例如，有一个家族中，连续三代都出现了AS患者。在这个家族中，第一代的父亲被诊断为AS，其子女中有两人也相继发病，而在第三代中，又有一名孙辈被确诊患有AS。这种在家族中连续出现患者的现象并非个例，充分体现了AS遗传的持续性和家族聚集的特征。有家族史的人群与无家族史人群相比，AS的发病风险存在明显差异。相关研究数据显示，普通人群中AS的发病率约为0.2%-0.3%，而在有AS家族史的人群中，发病率可高达4%-10%，甚至更高。在一些AS家系中，一级亲属（父母、子女、兄弟姐妹）的发病风险显著高于普通人群。这表明遗传因素在AS的发病中起着关键作用，家族遗传背景是AS发病的重要危险因素之一。家族聚集性不仅体现在发病率上，还体现在疾病的发病年龄、病情严重程度等方面。在某些家族中，患者的发病年龄相对集中，病情进展也较为相似。如有的家族中多个患者都在青少年时期发病，且病情发展迅速，较早出现脊柱强直和关节畸形等严重并发症。这种家族内发病特征的相似性，进一步提示了遗传因素对AS发病的重要影响，可能存在某些共同的遗传基因或遗传背景，使得家族成员在面对相同的环境因素时，更容易发病且表现出相似的疾病特征。2.2.2遗传风险相关因素分析遗传风险相关因素众多，其中性别因素与AS发病存在一定关联。临床研究发现，男性AS患者的发病年龄通常明显早于女性患者。通过对大量病例的统计分析，男性患者的平均发病年龄约为20-22岁，而女性患者的平均发病年龄约为23-25岁。男性患者的病情往往更为严重，更容易出现脊柱强直、关节畸形等严重并发症，对患者的生活质量和身体功能造成更大的影响。这可能与男性和女性在生理结构、激素水平以及免疫系统等方面的差异有关，这些差异可能导致男性在遗传因素和环境因素的共同作用下，更容易触发AS的发病机制，且病情进展更为迅速。父母患病情况也是影响AS发病的重要因素。若父或母亲患AS，其子女（先证者）的发病年龄明显早于非父母患病的先证者。研究数据显示，父母患病组先证者的平均发病年龄约为18-20岁，而非父母患病组先证者的平均发病年龄约为21-23岁。父母患病的先证者髋关节受累的比例也明显增加。髋关节受累是AS较为严重的临床表现之一，会导致患者髋关节疼痛、活动受限，严重影响患者的行走和日常生活能力。这表明父母的遗传因素对子女的发病具有重要影响，可能存在某些特定的遗传基因或遗传背景，通过遗传传递给子女，增加了子女发病的风险和病情的严重程度。胎次因素在女性先证者中也有一定的体现。对于女性先证者，在父或母亲患病组中是第一胎出生的比例明显高于非父母患病组。这可能与遗传因素在胎次传递过程中的某些特点有关，也可能涉及到孕期环境、母亲的身体状况等因素对胎儿遗传易感性的影响。例如，母亲在生育第一胎时，其身体内的激素水平、免疫系统等可能处于特定的状态，这种状态可能对胎儿的遗传物质产生影响，使得第一胎出生的女性在遗传了父母相关遗传因素的基础上，更容易发病。但目前关于胎次与AS发病关系的具体机制尚未完全明确，还需要进一步的研究来深入探讨。2.3强直性脊柱炎遗传风险率调查2.3.1研究设计与方法为了深入探究强直性脊柱炎的遗传风险率，本研究采用多中心遗传流行病学调查的设计方案。在全国范围内精心选取10个具有代表性的中心，这些中心分布于不同地区，涵盖了不同的地理环境、生活习惯和遗传背景人群，以确保研究样本的多样性和代表性。在样本选取方面，共纳入2039例AS患者作为研究对象。这些患者均经过严格的临床诊断标准确诊，确保疾病诊断的准确性。采用面对面问卷调查的方式，全面收集患者的详细信息。调查内容不仅包括患者的疾病类型，明确区分是中轴型、外周型，还是中轴+外周型，还涵盖了髋关节受累、腊样指、虹膜炎或葡萄膜炎等关节外表现的情况，以及炎性腰背痛、中轴起病或外周起病等疾病起病特征和临床表现。同时，详细询问AS家族史，全面排查一级亲属（FDRs）、二级亲属（SDRs）及三级亲属（TDRs）中是否有AS患者，确保家族遗传信息的完整性。数据收集完成后，运用SPSS16.0软件进行数据分析。该软件功能强大，能够进行各种复杂的统计分析，如相关性分析、差异性检验等，有助于深入挖掘数据中的潜在信息，准确分析比较在家族遗传中是否存在影响AS遗传的因素。为了准确衡量AS患者的血缘亲属的患病风险，本研究使用标准化发生率（SIRs）这一重要指标。其计算公式为SIR=AS血缘亲属中的AS患者人数/用中国汉族人群患病率为基础所计算出的预期AS患病人数。通过这一指标，可以直观地反映出患者血缘亲属相对于普通人群的患病风险程度，为评估遗传风险提供了量化的依据，使研究结果更具科学性和说服力。2.3.2研究结果与分析在2039例AS患者中，男女比例呈现出明显的差异，为4.07:1（1637:402），男性患者数量远多于女性患者。患者的平均年龄为27.32±8.90岁，处于青壮年时期，这一年龄段的患者正处于人生的关键阶段，疾病的发生对他们的生活和工作产生了巨大的影响。平均起病年龄是20.71±7.15岁，发病年龄相对较早，提示早期诊断和干预的重要性。在这些患者中，420例（20.60%）有家族史，表明遗传因素在AS发病中占据重要地位，家族遗传背景是不可忽视的风险因素。疾病类型方面，1102例（54.05%）为中轴+外周型，这一类型较为常见，涉及中轴关节和外周关节的同时受累，对患者的身体功能影响较大。636例（31.20%）例有髋关节受累，髋关节受累是AS较为严重的临床表现之一，会导致患者行走困难，严重影响生活质量。94例（4.6l%）有腊样指，162例（7.95%）有虹膜炎或葡萄膜炎，这些关节外表现也给患者带来了额外的痛苦。851例（41.74%）首发症状是以外周型表现，提示在疾病早期，外周关节症状可能较为突出，容易被忽视或误诊。在患病相关风险因素的分析中，性别因素表现显著，男性患者的起病年龄明显早于女性患者（P=0.000）。男性患者平均起病年龄约为20-22岁，女性患者平均起病年龄约为23-25岁，这可能与男性和女性在生理结构、激素水平以及免疫系统等方面的差异有关。父母患病情况也对AS发病产生重要影响，父或母亲患AS的先证者的发病年龄明显早于非父母患病的先证者（18.70±5.46岁/20.88±7.23岁，P=O.001），且髋关节受累明显多于父母无患AS的先证者（P=0.000）。这表明父母的遗传因素对子女的发病具有重要影响，可能存在某些特定的遗传基因或遗传背景，通过遗传传递给子女，增加了子女发病的风险和病情的严重程度。对于女性先证者，在父或母亲患病组中是第一胎出生的比例明显高于非父母患病组（P=0.031），但目前关于胎次与AS发病关系的具体机制尚未完全明确，还需要进一步的研究来深入探讨。然而，无论是父或母亲患病/非父母患病组还是母亲患病/父亲患病组，腊样指、眼炎和首发症状均没有差别，这提示这些因素可能与父母患病情况的关联性较小，可能受到其他因素的影响。关于AS的遗传风险率，研究结果显示，2039例先证者中，一级亲属患病率为3.84%；二级亲属患病率是0.87%；三级亲属患病率是0.315%，三者间有显著性差异（P=O.000）。这表明亲属级别越高，与先证者的血缘关系越近，患病风险越高，充分体现了遗传因素在AS发病中的作用，血缘关系的紧密程度与患病风险呈正相关。2039例先证者总的亲属的患病风险是普通人群的3.65倍，一级亲属（FDRs）的患病风险是普通人群的15.18倍，二级亲属（SD黜）的患病风险是普通人群的3.44倍，均明显高于普通人群（P<0.05）；三级亲属（TDRs）的患病风险则与普通人群无统计学上差异。这进一步明确了AS患者亲属的患病风险与普通人群的差异，一级和二级亲属的患病风险显著增加，而三级亲属虽然也存在一定风险，但在统计学上与普通人群无明显差异。有家族史的AS患者总的亲属患病风险是普通人群的17.31倍，一级亲属（FDRs）的患病风险是普通人群的68.74倍，二级亲属（SDRs）的患病风险是普通人群的16.49倍，三级亲属（TDRs）的患病风险是普通人群的5.92倍，均明显高于总体AS的亲属和普通人群（P<O.05）。这充分说明有家族史的AS患者亲属的患病风险更高，家族遗传因素在AS发病中起着关键作用，对于有家族史的人群，应加强疾病的监测和预防。2.4讨论本研究通过多中心遗传流行病学调查，对强直性脊柱炎的遗传风险因素及风险率进行了深入探究，结果具有重要的临床意义和遗传学价值。研究结果显示，男性AS患者发病年龄明显早于女性，这一差异可能与多种因素相关。从生理结构上看，男性和女性的脊柱及骶髂关节在发育和结构特点上存在一定差异，这些差异可能影响了疾病的易感性和发病时间。激素水平方面，雄激素和雌激素对免疫系统的调节作用不同，雄激素可能在一定程度上增强了免疫反应，使得男性更容易在早期触发AS的发病机制。此外，免疫系统的差异也不容忽视，男性的免疫系统在应对外界刺激时，可能产生更为强烈的炎症反应，从而导致发病年龄提前。这种性别差异在临床诊断和治疗中具有重要的参考价值，提示医生在面对年轻男性患者出现腰背痛等疑似AS症状时，应提高警惕，及时进行相关检查，以便早期诊断和治疗。父母患病情况对AS患者的发病有着显著影响。父亲或母亲患病的AS患者发病年龄明显早于父母无患病者，且髋关节受累的比率显著增高。这表明遗传因素在AS发病中起着关键作用，父母的遗传基因可能通过多种方式影响子女的发病。某些特定的遗传突变或基因多态性可能直接传递给子女，增加了子女发病的风险。遗传背景可能影响了子女免疫系统的发育和功能，使得他们在面对相同的环境因素时，更容易出现免疫异常，进而引发AS。对于这类高风险人群，早期进行基因检测和健康监测至关重要，以便及时发现疾病的早期迹象，采取有效的干预措施，延缓疾病的进展。在遗传风险率方面，本研究明确了总体AS患者其一级和二级亲属患病风险明显高于普通人群，且亲属中与先证者的血缘关系越接近，患病的风险越大。这一结果进一步证实了AS的遗传倾向，提示遗传因素在疾病发病中的主导作用。血缘关系越近，遗传物质的相似性越高，携带相同致病基因或遗传风险因素的可能性也就越大。对于有家族史的人群，遗传咨询和疾病预防显得尤为重要。遗传咨询可以帮助他们了解自身的遗传风险，提供合理的生育建议，避免遗传疾病的传递。加强疾病预防意识，定期进行体检和筛查，有助于早期发现疾病，提高治疗效果。有家族史的AS患者的亲属患病风险率也显著高于总体AS的亲属和普通人群。这说明家族遗传因素在AS发病中具有累积效应，家族中存在多个患病个体时，遗传风险会进一步增加。对于这类家族，应加强健康教育，提高家庭成员对AS的认识和警惕性。建立完善的家族健康管理机制，定期组织家庭成员进行健康检查，及时发现和治疗潜在的疾病风险。本研究还存在一定的局限性。研究仅在全国10个中心进行，虽然尽量选取了具有代表性的地区，但样本的地域覆盖范围仍有待进一步扩大，以更全面地反映不同地区人群的遗传特征和发病情况。研究主要基于问卷调查和临床诊断，对于一些潜在的遗传因素和环境因素的评估可能不够精确，未来的研究可以结合更先进的基因检测技术和环境监测方法，深入探究遗传与环境因素的交互作用对AS发病的影响。三、强直性脊柱炎全基因组SNPs连锁研究3.1全基因组SNPs连锁分析原理与方法3.1.1基本原理全基因组SNPs连锁分析基于孟德尔遗传定律和基因连锁理论。在减数分裂过程中，位于同一条染色体上的基因倾向于一起传递，这种现象被称为基因连锁。然而，同源染色体之间会发生交换和重组，导致基因之间的连锁关系发生改变。重组率是衡量基因之间连锁紧密程度的重要指标，重组率越低，说明基因之间的连锁越紧密，在遗传过程中一起传递的概率越高。单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每300个碱基对中就有1个，其总数可达数百万个。由于SNP具有数量多、分布广泛、遗传稳定性高等特点，被广泛用作遗传标记。在全基因组SNPs连锁分析中，通过检测大量的SNP位点，构建高密度的遗传图谱。当一个基因与某个SNP位点紧密连锁时，在家族遗传中，该基因与SNP位点会共同传递给后代。通过分析家系中疾病表型与SNP位点的共分离情况，可以推断出与疾病相关的基因所在的染色体区域。例如，在一个AS家系中，如果某个SNP位点在患病个体中总是与疾病表型同时出现，而在健康个体中不出现或很少出现，那么就可以推测该SNP位点附近可能存在与AS发病相关的基因。通过不断缩小候选区域，进一步筛选和分析候选基因，从而定位与疾病相关的易感基因。3.1.2实验方法与技术本研究使用IlluminaHuamHap610.QuadSNP芯片对AS患者进行全基因组扫描。IlluminaHuamHap610.QuadSNP芯片是一种高密度的基因芯片，能够同时检测超过60万个SNP位点，具有检测通量高、准确性好等优点。该芯片基于Illumina公司的Infinium技术，采用50mer寡核苷酸探针退火，利用特异荧光基团判定基因型，能够准确地检测出样本中的SNP位点信息。实验流程如下：首先，采集广东籍贯的10个AS家系中所有AS患者的外周血样本，使用常规的血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，确保提取的DNA质量和浓度符合实验要求。然后，对提取的DNA进行质量检测，使用Nanodrop分光光度计测量DNA的浓度和纯度，确保DNA的纯度在1.8-2.0之间，浓度在50ng/μL以上。使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，确保DNA没有降解。将合格的DNA样本按照芯片说明书的要求进行处理，包括DNA片段化、末端修复、加A尾、连接特异性接头等步骤。将处理后的DNA样本与IlluminaHuamHap610.QuadSNP芯片进行杂交，在适宜的温度和湿度条件下，让DNA与芯片上的探针充分结合。杂交完成后，使用IlluminaiScan扫描仪对芯片进行扫描，获取芯片上每个SNP位点的荧光信号强度数据。数据收集完成后，使用专门的连锁分析软件进行数据分析。本研究使用的连锁分析软件为GeneHunter，该软件基于复杂性状的非参数连锁分析方法，能够有效地分析基因与疾病之间的连锁关系。在分析过程中，将疾病表型（如AS疾病、炎性腰背痛等）作为参数，设置合适的参数，如遗传模型、重组率等，进行连锁分析。通过计算LOD值（优势对数计分）来评估基因与疾病之间的连锁强度，LOD值大于3通常被认为具有显著的连锁关系，提示该区域可能存在与疾病相关的易感基因。三、强直性脊柱炎全基因组SNPs连锁研究3.2基于AS家系的全基因组SNPs连锁分析3.2.1家系选择与临床资料收集本研究精心选择了广东籍贯的10个AS家系作为研究对象。选择广东籍贯家系主要基于以下考虑：广东地区人口众多，遗传背景相对丰富且具有一定的独特性，能够为研究提供多样化的遗传样本。同时，广东地区医疗资源相对集中，便于开展临床资料的收集和后续的研究工作。家系的纳入标准严格，要求家系中至少有3例明确诊断为AS的患者，且三代内有血缘关系，以确保遗传信息的连续性和可靠性，有利于准确分析遗传因素在AS发病中的作用。在临床资料收集方面，对10个AS家系中所有的AS患者进行了全面且细致的信息采集。收集的内容涵盖多个关键方面，包括患者的性别，性别因素在AS的发病年龄、病情严重程度等方面可能存在差异，对其进行分析有助于深入了解AS的发病机制。年龄和发病年龄是重要的临床指标，发病年龄的早晚可能与遗传因素以及环境因素的暴露时间等有关，通过准确记录发病年龄，可以为研究遗传与环境因素的交互作用提供数据支持。病程的长短反映了疾病的发展进程，不同病程的患者可能具有不同的病理生理变化和遗传特征，对病程的研究有助于了解疾病的动态发展过程。临床表型的收集也十分关键，包括腊样指、髋关节受累、外周关节炎、炎性腰背痛等。腊样指是AS的一种特殊临床表现，其出现可能与特定的遗传背景或免疫反应相关；髋关节受累是AS较为严重的并发症之一，严重影响患者的生活质量，研究髋关节受累与遗传因素的关系，有助于早期预测和干预；外周关节炎和炎性腰背痛是AS常见的症状，对这些症状与遗传因素的关联分析，能够为疾病的早期诊断和治疗提供依据。收集这些临床资料，能够为后续的连锁分析提供全面的数据支持，有助于准确寻找与AS疾病和临床表型相关的易感区域，深入揭示AS的遗传机制。3.2.2连锁分析结果通过严格的实验操作和数据分析流程，对10个AS家系的78名AS患者进行全基因组扫描和连锁分析，获得了一系列重要结果。在连锁分析中，AS疾病、炎性腰背痛、HLA-B27三个关键参数的LOD值表现突出。其中，AS疾病的LOD值为5.164，炎性腰背痛的LOD值为5.807，HLA-B27的LOD值为6.141，三个参数的LOD值均大于3，这在统计学上具有显著意义，强烈提示这些参数与特定的基因区域存在紧密连锁关系。进一步分析发现，这三个参数的LOD值大于3的易感区域均明确指向6p21区域。6p21区域在人类基因组中包含众多基因，这些基因参与了多种生物学过程，如免疫调节、炎症反应等，与AS的发病机制密切相关。该区域长约9.44Mb，范围从26283831到35727532。这一精确的易感区域定位，为后续深入研究AS的致病基因提供了重要的靶点和方向。在6p21这一易感区域内，存在多个可能与AS发病相关的基因。其中，除了已知的与AS发病密切相关的HLA-B27基因外，TCF19等25个基因也被发现具有重要的研究价值，成为进一步在该区寻找AS疾病的易感基因研究的新靶点。TCF19基因参与了细胞的分化和发育过程，在免疫系统中可能发挥着调节作用，其功能异常可能导致免疫失衡，进而增加AS的发病风险。对这些新靶点基因的深入研究，将有助于进一步揭示AS的发病机制，为开发新的诊断方法和治疗策略提供理论依据。3.3讨论本研究通过对广东籍贯的10个AS家系进行全基因组SNPs连锁分析，明确了6p21区域为AS疾病、炎性腰背痛以及HLA-B27的重要易感区域，这一结果具有重要的遗传学意义和临床价值。6p21区域包含众多基因，这些基因在免疫调节、炎症反应等生物学过程中发挥着关键作用，而这些生物学过程与AS的发病机制密切相关。HLA-B27基因作为已知的与AS发病高度相关的基因，位于6p21区域，这进一步证实了该区域在AS发病中的重要地位。HLA-B27基因编码的人类白细胞抗原在免疫系统中起着重要的识别和调控作用，其异常表达可能导致免疫系统对自身组织的错误识别和攻击，引发炎症反应，从而增加AS的发病风险。除HLA-B27基因外，该区域内的TCF19等25个基因成为新的研究靶点。TCF19基因参与细胞分化和发育过程，在免疫系统中可能具有调节功能，其功能异常可能破坏免疫平衡，使机体更容易受到炎症刺激，进而增加AS的发病可能性。对这些新靶点基因的深入研究，将有助于进一步揭示AS的发病机制，为开发新的诊断方法和治疗策略提供理论基础。连锁分析结果对于深入理解AS的遗传机制具有重要作用。通过连锁分析，确定了与AS相关的易感区域，这为后续的基因定位和功能研究提供了明确的方向。以往的研究虽然已经发现了一些与AS相关的遗传因素，但对于这些因素之间的相互作用以及它们如何协同影响AS的发病机制，仍存在许多未知。本研究的连锁分析结果为解答这些问题提供了重要线索，有助于构建更加完整的AS遗传发病模型。明确易感区域后，可以进一步开展关联分析，在该区域内筛选与AS发病密切相关的SNP位点，深入研究这些位点的功能和作用机制，从而揭示遗传因素在AS发病中的具体作用方式。这对于理解AS的遗传异质性也具有重要意义，不同个体之间AS的发病机制可能存在差异，通过对易感区域和相关基因的研究，可以更好地解释这种遗传异质性，为个性化的诊断和治疗提供依据。然而，本研究也存在一定的局限性。研究仅选取了广东籍贯的10个AS家系，样本量相对较小，且地域范围有限，可能无法完全代表所有AS患者的遗传特征。未来的研究需要进一步扩大样本量，涵盖不同地域、不同种族的AS家系，以提高研究结果的普遍性和可靠性。连锁分析虽然能够定位易感区域，但对于确定具体的致病基因还存在一定的困难，需要结合其他研究方法，如全基因组关联分析、功能基因组学研究等，进一步验证和深入探究相关基因的功能和作用机制，以更全面地揭示AS的遗传风险因素和发病机制。四、强直性脊柱炎全基因组SNPs关联研究4.1全基因组关联分析原理与流程4.1.1原理基础全基因组关联分析（GWAS）的理论基石是群体遗传学中的连锁不平衡（LD）理论。在减数分裂过程中，位于同一条染色体上的基因并非完全独立地进行遗传，而是倾向于一起传递，这种现象被称为基因连锁。连锁不平衡则是指在一个群体中，不同位点的等位基因之间非随机组合的现象。当两个位点处于连锁不平衡状态时，它们的等位基因在遗传过程中会呈现出一定的相关性。在人类基因组中，单核苷酸多态性（SNP）广泛存在，平均每300个碱基对中就有1个SNP，总数可达数百万个。这些SNP作为遗传标记，在全基因组关联分析中发挥着关键作用。由于连锁不平衡的存在，某些SNP位点可以作为其附近基因的代表标记。当一个SNP与某个疾病相关的基因紧密连锁时，这个SNP位点的特定等位基因在疾病患者群体中的频率往往会与正常人群存在显著差异。通过对大量样本中SNP位点的基因型进行检测，并与疾病表型进行关联分析，就能够筛选出与疾病相关的SNP位点，进而定位到潜在的致病基因。具体而言，在GWAS研究中，通常会选取两组样本，一组是患有强直性脊柱炎的患者（病例组），另一组是健康对照人群（对照组）。然后，利用高通量基因分型技术，对两组样本的全基因组范围内的SNP位点进行检测，获取每个样本在各个SNP位点上的基因型信息。通过统计学方法，比较病例组和对照组中每个SNP位点的等位基因频率。如果某个SNP位点的等位基因频率在病例组和对照组之间存在显著差异，且这种差异在统计学上具有显著性意义，那么就可以认为该SNP位点与强直性脊柱炎存在关联。这种关联可能意味着该SNP位点本身就是致病突变，也可能是因为它与真正的致病基因紧密连锁，从而间接反映了致病基因的存在。4.1.2研究流程与关键步骤全基因组关联分析通常包括两个关键阶段：第一阶段是芯片全扫，第二阶段是有意义SNP的验证。在芯片全扫阶段，需要收集大量的样本，包括病例组和对照组。样本的选择应具有代表性，尽量涵盖不同性别、年龄、地域和遗传背景的个体，以提高研究结果的普遍性和可靠性。采集样本的外周血或其他组织，提取基因组DNA，确保DNA的质量和纯度符合实验要求。使用高密度的SNP芯片对基因组DNA进行基因分型，如IlluminaHumanHap610.QuadSNP芯片等，这些芯片能够同时检测数十万个甚至上百万个SNP位点。对基因分型得到的数据进行严格的质量控制，包括剔除检出率低的SNP位点（如检出率低于95%的位点）、剔除最小等位基因频率（MAF）过低的SNP位点（如MAF低于0.01的位点）、剔除不符合哈迪-温伯格平衡（HWE）的SNP位点（如HWE检验P值小于1×10^-6的位点）等，以确保数据的准确性和可靠性。经过质量控制后的数据，使用专业的统计分析软件，如PLINK等，进行初步的关联分析，计算每个SNP位点与强直性脊柱炎表型之间的关联强度，通常使用P值来衡量，P值越小，说明该SNP位点与疾病的关联越显著。根据预先设定的阈值（如P值小于5×10^-8），筛选出在全基因组水平上与强直性脊柱炎显著相关的SNP位点，这些位点被认为是有意义的SNP，进入下一阶段的验证。在有意义SNP验证阶段，为了进一步确认第一阶段筛选出的SNP位点与强直性脊柱炎的真实关联，需要在更大规模的独立样本中进行验证。可以从不同地区、不同医院收集更多的病例组和对照组样本，以增加样本的多样性和代表性。对这些样本进行相同的基因分型和质量控制流程，然后针对第一阶段筛选出的有意义SNP位点进行再次检测和关联分析。如果这些SNP位点在验证样本中仍然表现出与强直性脊柱炎的显著关联，且关联方向与第一阶段一致，那么就可以更有力地证明这些SNP位点与强直性脊柱炎之间的真实关联。在验证过程中，还可以采用meta分析等方法，将多个研究的数据进行合并分析，进一步提高研究结果的可靠性和统计效能。在整个全基因组关联分析过程中，数据的统计分析方法至关重要。常用的统计分析方法包括卡方检验、Logistic回归分析等。卡方检验用于比较病例组和对照组中SNP位点的等位基因频率是否存在显著差异。Logistic回归分析则可以在考虑多个协变量（如年龄、性别、地域等）的情况下，评估SNP位点与强直性脊柱炎发病风险之间的关联强度，计算优势比（OR）及其95%置信区间。通过这些统计分析方法，可以准确地筛选出与强直性脊柱炎相关的SNP位点，为后续的基因功能研究和疾病机制探索奠定基础。四、强直性脊柱炎全基因组SNPs关联研究4.2中国散发AS患者全基因组SNPs关联分析4.2.1研究对象与样本采集本研究选取了中国汉族人群中的散发AS患者作为研究对象。为确保研究结果的可靠性和代表性，在样本选择上制定了严格的标准。纳入标准为：符合1984年修订的纽约标准，即下腰背痛的病程至少持续3个月，疼痛随活动改善，但休息不减轻；腰椎在前后和侧屈方向的活动受限；胸廓扩展范围小于同年龄和性别的正常值；双侧骶髂关节炎Ⅱ-Ⅳ级，或单侧骶髂关节炎Ⅲ-Ⅳ级。同时，排除患有其他风湿性疾病、严重心脑血管疾病、恶性肿瘤等可能影响研究结果的疾病患者。共纳入1837例散发AS患者，这些患者来自全国多个地区，包括北京、上海、广州、成都、武汉等，地域分布广泛，涵盖了不同的生活环境和遗传背景。患者年龄范围为10-50岁，平均年龄为28.5±7.8岁，其中男性1256例，女性581例，男女比例为2.16:1。同时，选取了4231名健康志愿者作为对照人群，对照人群同样来自上述地区，年龄范围为10-50岁，平均年龄为27.8±8.2岁，其中男性2900名，女性1331名，男女比例为2.18:1。对照人群经过详细的体格检查和相关实验室检查，排除患有风湿性疾病及其他慢性疾病的个体，以确保其健康状态，作为准确的对照样本。在样本采集方面，采集所有研究对象的外周静脉血5ml，置于含有EDTA抗凝剂的采血管中。采集过程严格遵循无菌操作原则，避免污染。采集后的血液样本在4℃条件下保存，并在24小时内进行基因组DNA提取。使用常规的血液基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书的操作步骤进行提取，确保提取的DNA质量和浓度符合后续实验要求。提取的DNA经Nanodrop分光光度计检测浓度和纯度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，DNA浓度不低于50ng/μL。采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，确保DNA无降解，以保证后续基因分型实验的准确性。4.2.2关联分析结果通过对1837例散发AS患者和4231名健康对照者的1,356,350个常染色体SNPs进行全基因组关联分析，取得了一系列重要发现。研究成功鉴别出两个新的基因位点。其中一个位于染色体上5q14.3区域EDIL3与HAPLN1基因间位点（rs4552569），该位点与AS发病存在显著关联，P值达到8.77×10^-10，这表明该位点的变异与AS发病风险之间存在紧密联系。EDIL3基因编码的蛋白质在细胞外基质的形成和维持中发挥重要作用，其功能异常可能影响骨骼和关节的正常结构和功能，进而增加AS的发病风险。HAPLN1基因参与软骨和结缔组织的形成，对维持关节的稳定性和正常功能至关重要，该基因区域的变异可能干扰软骨的正常发育和修复，从而与AS的发病相关。另一个新基因位点是12q12区域的ANO6基因（rs17095830），P值为1.63×10^-8，同样显示出与AS发病的显著关联性。ANO6基因编码一种钙激活的氯离子通道蛋白，参与细胞内钙离子信号传导和氯离子转运等重要生理过程，其功能异常可能导致细胞内环境紊乱，引发炎症反应，从而在AS的发病机制中发挥作用。研究还对从前在欧洲家系中报道的强直性脊柱炎与MHC区域（topSNP,rs13202464;P<5×10^-324）和2p15区域的关联性进行了验证。在中国汉族人群中，同样证实了AS与这些区域存在关联性，进一步支持了先前在欧洲人群中的研究结果，表明这些区域在不同种族人群的AS发病中可能具有共同的作用机制。其中，MHC区域的rs13202464显示了中国汉族人群HLA-B27变异体（包括HLA-B2704、HLA-B2705和HLA-B2715）的风险效应。HLA-B27变异体在AS发病中的重要作用已得到广泛认可，其可能通过影响免疫系统的识别和反应，导致自身免疫异常，进而引发AS。本研究进一步明确了rs13202464位点与HLA-B27变异体的风险关联，为深入理解AS的遗传发病机制提供了更详细的信息。4.3讨论本研究通过对中国汉族人群中散发AS患者进行全基因组SNPs关联分析，成功鉴别出两个新的基因位点，这一发现具有重要的生物学意义和临床价值。位于5q14.3区域EDIL3与HAPLN1基因间位点（rs4552569）和12q12区域的ANO6基因（rs17095830）与AS发病存在显著关联。这两个新基因位点的发现，为深入理解AS的发病机制提供了新的视角。EDIL3基因编码的蛋白质在细胞外基质的形成和维持中发挥重要作用。细胞外基质对于骨骼和关节的结构和功能至关重要，其异常可能导致骨骼和关节的稳定性下降，增加炎症反应的易感性，从而促进AS的发生发展。HAPLN1基因参与软骨和结缔组织的形成，对维持关节的正常结构和功能起着关键作用。该基因区域的变异可能影响软骨的合成、修复和代谢过程，使得关节软骨更容易受到损伤，进而引发炎症反应，与AS的发病密切相关。ANO6基因编码一种钙激活的氯离子通道蛋白，参与细胞内钙离子信号传导和氯离子转运等重要生理过程。细胞内钙离子和氯离子的平衡对于细胞的正常功能至关重要，ANO6基因功能异常可能导致细胞内环境紊乱，影响免疫细胞的活性和炎症介质的释放，从而在AS的发病机制中发挥作用。这些新易感基因位点的发现对AS分子机制研究具有深远意义。以往对AS发病机制的研究主要集中在HLA-B27及少数已知基因上，新基因位点的出现拓展了研究的方向。通过深入研究这些基因的功能及其相互作用网络，可以进一步揭示AS发病的分子生物学过程。研究EDIL3、HAPLN1和ANO6基因与其他免疫调节基因、炎症相关基因之间的相互关系，有助于全面了解AS发病过程中免疫失衡和炎症反应的发生机制。这为构建更完整的AS发病机制模型提供了重要依据，有助于深入理解AS的遗传异质性，即不同个体之间AS发病机制的差异，为个性化治疗提供理论基础。新易感基因位点的发现对AS的预测、诊断和治疗具有潜在的重要价值。在疾病预测方面，这些基因位点可作为新的遗传标记，与现有的HLA-B27等标记相结合，提高AS发病风险预测的准确性。对于有AS家族史或具有相关遗传背景的人群，通过检测这些基因位点的变异情况，可以更精准地评估其发病风险，实现早期预警，从而采取有效的预防措施，如调整生活方式、定期体检等，延缓或阻止疾病的发生。在诊断方面，新基因位点的检测可以作为辅助诊断指标，尤其是对于一些症状不典型或HLA-B27阴性的AS患者，提高诊断的准确性和及时性，减少误诊和漏诊。在治疗方面，这些基因位点可能成为新的治疗靶点。开发针对EDIL3、HAPLN1和ANO6基因的药物或治疗方法，有望干预AS的发病过程，为AS的治疗提供新的策略，提高治疗效果，改善患者的生活质量。本研究还验证了AS与欧洲家系中报道的MHC区域和2p15区域的关联性，进一步支持了这些区域在AS发病中的重要作用。MHC区域的rs13202464显示了中国汉族人群HLA-B*27变异体的风险效应，这与以往的研究结果一致，强调了HLA-B27在AS发病中的关键地位。这也表明不同种族人群在AS发病机制上存在一定的共性，为跨种族的AS研究提供了参考依据。然而，本研究也存在一定的局限性。研究仅针对中国汉族人群中的散发AS患者，对于其他种族和家族性AS患者的遗传特征研究不足，未来需要进一步扩大研究范围，涵盖不同种族和家系的样本，以全面揭示AS的遗传多样性。关联分析虽然能够发现基因位点与疾病的关联，但对于基因的具体功能和作用机制还需要进一步的功能研究来验证，如通过细胞实验、动物模型等方法深入探究新基因位点在AS发病中的具体作用途径。五、结论与展望5.1研究主要成果总结本研究通过全面且深入的研究，在强直性脊柱炎遗传风险及全基因组SNPs连锁和关联研究方面取得了一系列重要成果。在强直性脊柱炎遗传风险研究中，明确了多个遗传风险相关因素。男性AS患者发病年龄明显早于女性，这可能与男性和女性在生理结构、激素水平以及免疫系统等方面的差异有关。父亲或母亲患病的AS患者发病年龄明显早于父母无患病者，且髋关节受累的比率显著增高，提示父母的遗传因素对子女的发病具有重要影响。对于女性先证者，在父或母亲患病组中是第一胎出生的比例明显高于非父母患病组，表明胎次因素在女性先证者中可能与AS发病存在关联，但具体机制尚待进一步研究。在遗传风险率方面，总体AS患者其一级和二级亲属患病风险明显高于普通人群，且亲属中与先证者的血缘关系越接近，患病的风险越大。2039例先证者中，一级亲属患病率为3.84%；二级亲属患病率是0.87%；三级亲属患病率是0.315%，三者间有显著性差异。2039例先证者总的亲属的患病风险是普通人群的3.65倍，一级亲属（FDRs）的患病风险是普通人群的15.18倍，二级亲属（SDRs）的患病风险是普通人群的3.44倍。有家族史的AS患者总的亲属患病风险是普通人群的17.31倍，一级亲属（FDRs）的患病风险是普通人群的68.74倍，二级亲属（SDRs）的患病风险是普通人群的16.49倍，三级亲属（TDRs）的患病风险是普通人群的5.92倍，均明显高于总体AS的亲属和普通人群。在强直性脊柱炎全基因组SNPs连锁研究中，对广东籍贯的10个AS家系进行研究，通过全基因组扫描和连锁分析，确定了6p21区域为AS疾病、炎性腰背痛以及HLA-B27的重要易感区域。该区域长约9.44Mb，范围从26283831到35727532。除了已知的HLA-B27基因外，TCF19等25个基因成为进一步在该区寻找AS疾病的易感基因研究的新靶点。这一发现为深入研究AS