空间转录组学联合单细胞测序技术进展

空间转录组学联合单细胞测序技术进展演讲人2026-01-13目录技术独立发展历程与局限性解析01技术挑战与优化方向：从“可用”到“好用”的跨越04空间-单细胞联用技术在生命科学中的突破性应用03空间转录组学与单细胞测序的联合策略：技术互补的逻辑必然02未来展望：迈向“时空多组学”与“临床转化”的新纪元05空间转录组学联合单细胞测序技术进展作为生命科学研究领域的从业者，我始终认为，技术的融合是推动科学突破的核心驱动力。近年来，空间转录组学（SpatialTranscriptomics,ST）与单细胞测序（Single-CellRNASequencing,scRNA-seq）技术的联用，正以前所未有的分辨率重构我们对生命复杂性的认知——从细胞命运的分化轨迹，到组织微环境的生态网络，再到疾病发生发展的空间逻辑，这种“空间+单细胞”的双维度解析，已成为揭示生命奥秘的关键钥匙。本文将结合技术原理、应用进展、现存挑战与未来方向，系统阐述这一交叉领域的最新突破，以期为同行提供参考与启发。01技术独立发展历程与局限性解析ONE技术独立发展历程与局限性解析在探讨联合技术之前，需先理解两种技术的独立发展脉络及其固有局限，这是理解联用必要性的逻辑起点。1.1单细胞测序技术：从“细胞群平均”到“细胞异质性”的革命单细胞测序技术的诞生，彻底改变了传统转录组学以“组织块”或“细胞群”为研究对象带来的“平均效应”掩盖。2013年，Tang等首次基于微流控技术实现单细胞转录组捕获，标志着scRNA-seq进入实用化阶段；随后，10xGenomics、Drop-seq等平台的涌现，通过液滴包裹原理实现了数千至数万个细胞的并行测序，极大降低了技术门槛。技术独立发展历程与局限性解析然而，scRNA-seq的固有局限也十分突出：空间信息的丢失。该技术通过酶解或物理dissociation将组织解离为单细胞悬液，虽然获得了高精度的细胞亚型鉴定（如免疫细胞分群、肿瘤细胞异质性），却完全破坏了细胞在原始组织中的空间位置关系。例如，在肿瘤微环境中，癌细胞与基质细胞的互作距离、免疫浸润的“冷/热”表型空间分布等关键信息，均无法通过scRNA-seq直接获取。正如我在参与某项肺癌研究时的亲身经历：即便通过scRNA-seq鉴定出肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的M1/M2亚群，却无法判断这些M2TAMs是直接毗邻癌细胞的“促癌亚群”，还是远离肿瘤的“旁观者”，这一局限极大制约了微环境互作机制的深入解析。2空间转录组学：从“基因表达”到“空间坐标”的跨越为弥补scRNA-seq的空间缺失，空间转录组学应运而生。其核心思想是在保留组织空间结构的前提下，捕获每个空间位置（或“spot”）的转录组信息。2016年，Ståhl等开发的Visium平台（10xGenomics）首次基于组织切片与寡核苷酸探针阵列的结合，实现了“基因表达+空间坐标”的同步获取，标志着ST技术进入快速发展期。随后，原位捕获技术（如MERFISH、seqFISH+）通过荧光原位杂交原理，将分辨率提升至单细胞级别；而激光捕获显微切割（LCM）结合RNA-seq则通过物理切割实现特定空间区域的精准转录组测序。尽管ST技术成功将基因表达锚定回空间位置，但其局限性同样显著：分辨率与通量的权衡。例如，Visium平台的spot直径约为55μm，每个spot包含数十至上百个细胞，其转录组本质上是“细胞群平均”，2空间转录组学：从“基因表达”到“空间坐标”的跨越难以解析单细胞水平的异质性；而高分辨率技术（如MERFISH）虽可实现单细胞定位，但通量极低（通常一次实验仅能检测数百个细胞），且实验成本高昂。此外，ST技术对样本质量要求苛刻，新鲜冷冻组织的使用限制了临床样本的适用性，这也是我们在实际操作中常遇到的痛点——尤其是对于珍贵的临床活检样本，如何平衡“空间保留”与“细胞活性”成为难题。02空间转录组学与单细胞测序的联合策略：技术互补的逻辑必然ONE空间转录组学与单细胞测序的联合策略：技术互补的逻辑必然面对单一技术的固有局限，研究者们自然想到将二者优势互补：scRNA-seq提供高精度的细胞亚型注释，ST提供细胞的空间分布与互作信息。这种“1+1>2”的联用策略，已发展出多种成熟的技术路径与数据整合框架。1技术联用的核心逻辑与基本原则1空间-单细胞联用的核心逻辑在于：以scRNA-seq构建细胞类型“字典”，以ST为组织“贴图”，将“字典”与“贴图”精准匹配。其基本原则可概括为三点：2-样本来源一致性：理想情况下，联用实验需使用同一组织的相邻切片（或同一组织的部分用于scRNA-seq，部分用于ST），以确保细胞类型与空间位置的对应性；3-技术分辨率适配：根据研究目的选择分辨率——若关注细胞亚群空间分布，可选择中分辨率ST（如Visium）；若关注单细胞空间互作，则需结合高分辨率ST与scRNA-seq；4-数据整合算法优化：开发能处理高维、异构数据的算法，实现细胞类型注释、空间轨迹推断与互作网络构建的无缝衔接。2联合技术的三大主流策略基于上述逻辑，目前空间-单细胞联用已形成三大主流策略，分别针对不同的研究需求：2联合技术的三大主流策略2.1“先单细胞后空间”的参照系策略该策略以scRNA-seq为“金标准”，首先构建组织的细胞类型图谱，再将ST数据中的每个spot转录组与scRNA-seq的细胞类型进行比对，实现spot水平的细胞类型注释。其典型流程为：1.样本分选：取同一组织的一部分制备单细胞悬液，进行scRNA-seq，通过聚类分析鉴定细胞亚型（如T细胞、B细胞、成纤维细胞等），并标记各亚型的marker基因；2.ST实验：取相邻组织切片进行ST测序，获得每个spot的基因表达矩阵；3.数据注释：利用算法（如SingleR、SPOTlight）将spot表达矩阵与scRNA-seq的细胞类型marker进行匹配，推断每个spot的细胞类型组成；2联合技术的三大主流策略2.1“先单细胞后空间”的参照系策略4.空间可视化：将注释结果映射回组织切片，生成细胞类型的空间分布热图。该策略的优势在于注释准确性高，尤其适用于细胞类型复杂的组织（如脑、肿瘤）。例如，在2020年Nature的一项研究中，研究者通过scRNA-seq构建了小鼠前脑的细胞类型图谱（包含136个神经元亚型），再结合Visium数据成功解析了不同神经元亚层在皮层中的空间排布。但其局限在于：ST的spot分辨率仍受限于细胞数量，若一个spot包含多种细胞亚型，注释结果可能出现“平均偏差”。2联合技术的三大主流策略2.2“先空间后单细胞”的定位策略3.单细胞测序：对捕获的单细胞进行scRNA-seq，高精度解析目标区域的细胞异质性；与上述策略相反，该策略首先通过ST获取空间表达模式，再结合空间信息对特定区域进行单细胞水平解析。其核心在于“空间引导的单细胞捕获”，典型流程为：2.区域切割：基于ST的空间定位，利用激光捕获显微切割（LCM）或空间条形码技术（如Slide-seq）精准切割目标区域，获取单细胞或亚细胞群；1.ST初筛：对组织切片进行低/中分辨率ST测序（如Visium），识别感兴趣的空间区域（如肿瘤边缘、免疫浸润热点区）；4.数据融合：将单细胞数据回溯至原始空间位置，实现“宏观空间”与“微观单细胞”2联合技术的三大主流策略2.2“先空间后单细胞”的定位策略的双向验证。该策略的优势在于靶向性强，能聚焦ST初筛的关键区域，降低scRNA-seq的细胞数需求，尤其适用于样本量有限的临床研究。例如，在2021年Science的一项乳腺癌研究中，研究者通过Visium定位到肿瘤内部的“免疫排斥热点区”，再利用LCM捕获该区域单细胞，发现了一群此前未被鉴定的免疫抑制性巨噬细胞亚群，其高表达PD-L1且特异性分布于肿瘤坏死区域。2联合技术的三大主流策略2.3“同步整合”的一体化策略1为避免样本分选带来的误差，近年来出现了一体化空间单细胞测序技术，即在保留组织空间结构的同时，直接捕获单细胞水平的转录组与空间坐标。其代表技术包括：2-10xGenomicsXenium：基于原位探针捕获技术，通过荧光编码同时实现单细胞水平的基因检测与空间定位，分辨率约0.5-1μm；3-MERFISH/seqFISH+升级版：在传统多重荧光原位杂交基础上，结合条形码编码技术，可检测数千个基因的单细胞表达与空间位置；4-空间ATAC-seq与RNA-seq联用：如Vizgen的MultiplexedFISH技术，同步检测染色质开放状态与基因表达的空间分布，实现表观遗传与转录组的空间整合。2联合技术的三大主流策略2.3“同步整合”的一体化策略该策略的优势在于“一次实验、双维数据”，无需样本分选，最大程度保留原始组织信息。例如，2022年Cell发表的Xenium技术研究中，研究者对人类乳腺癌切片进行同步空间单细胞测序，不仅鉴定出12种细胞亚型，还揭示了癌细胞的“空间迁移轨迹”——部分癌细胞沿血管内皮细胞呈线性排列，提示血管可能是肿瘤转移的“轨道”，这一发现通过传统联用策略难以获得。3数据整合算法：从“匹配”到“重构”的跨越无论采用何种技术策略，数据整合都是联用的核心挑战。传统方法（如SPOTlight）通过“非负矩阵分解（NMF）”将ST的spot表达矩阵分解为scRNA-seq的细胞类型特征，但这种方法假设每个spot的细胞类型组成是“离散”的，忽略了连续细胞状态（如分化轨迹）的影响。近年来，基于图神经网络（GNN）与生成模型的新算法成为热点：-GNN-based整合：将细胞（scRNA-seq）与spot（ST）构建为二分图，通过GNN学习细胞类型与空间位置的关联，例如SpatialDWCGNN算法能同时考虑细胞表达相似性与空间邻近性，提升注释准确性；-生成模型（如VAE）：利用变分自编码器（VAE）学习低维表达空间，将scRNA-seq的细胞嵌入与ST的spot嵌入对齐，例如STAGATE算法通过空间邻近性约束VAE训练，实现了细胞类型注释与空间轨迹推断的一体化；3数据整合算法：从“匹配”到“重构”的跨越-多组学整合框架：如Seurat5.0新增的“SpatialIntegration”模块，支持scRNA-seq、ST、空间蛋白组学等多模态数据的联合分析，通过“锚点点（anchor）”匹配技术，实现不同批次、不同平台数据的无缝整合。这些算法的进步，使得空间-单细胞联用从“数据匹配”走向“机制重构”——不仅能注释细胞类型，还能推断细胞分化路径的空间动态、预测细胞间通讯网络，甚至模拟组织发育的“时空程序”。03空间-单细胞联用技术在生命科学中的突破性应用ONE空间-单细胞联用技术在生命科学中的突破性应用技术的最终价值在于解决科学问题。空间-单细胞联用技术凭借其“高分辨率+空间定位”的双重优势，已在发育生物学、肿瘤学、神经科学等领域取得多项突破性进展，这些进展不仅深化了基础认知，也为临床转化提供了新思路。1发育生物学：解析细胞命运的“空间编程逻辑”发育的核心是细胞在特定时间与空间位置选择特定命运，而空间-单细胞联用技术为解析这一“空间编程逻辑”提供了前所未有的工具。以哺乳动物大脑皮层发育为例，传统研究通过体外培养或时间序列scRNA-seq推测神经干细胞（NSCs）的分化轨迹，但无法回答“NSCs如何感知空间位置信息并分化为特定神经元亚型”。2021年Nature的一项研究利用空间-单细胞联用技术，对小鼠胚胎E12.5-E18.5的皮层切片进行同步测序，发现：-NSCs的“空间代谢区”：靠近侧脑室的NSCs高表达糖酵解基因（如Hexokinase1），而远离侧脑室的NSCs高表达氧化磷酸化基因，这种空间代谢差异直接决定了NSCs的分化方向——前者分化为投射神经元，后者分化为中间神经元；1发育生物学：解析细胞命运的“空间编程逻辑”-神经元迁移的“空间路径”：通过追踪新生神经元的空间坐标变化，首次绘制了神经元从室区（VZ）到板区（CP）的“三维迁移轨迹”，发现不同神经元亚型沿特定“放射状胶质纤维”迁移，且迁移路径受空间梯度信号（如Reelin蛋白）调控。这些发现彻底改变了我们对大脑发育的认知——细胞命运并非随机选择，而是由“空间位置编码”的微环境程序化决定。类似地，在器官再生研究中（如斑马鱼心脏再生），空间-单细胞联用揭示了损伤区域心肌细胞的“空间重编程”过程：部分心肌细胞去分化为干细胞状态，并在特定空间位置（如损伤边缘）重新分化为心肌细胞，这一发现为心脏病再生治疗提供了新靶点。2肿瘤学：重构肿瘤微环境的“生态地图”肿瘤微环境（TME）是肿瘤发生、转移、耐药的“土壤”，其复杂性远超传统认知。空间-单细胞联用技术通过绘制TME的“细胞生态地图”，正在重塑我们对肿瘤进展的理解。2肿瘤学：重构肿瘤微环境的“生态地图”2.1肿瘤异质性的空间结构肿瘤的“时空异质性”是治疗失败的核心原因，而空间-单细胞联用可解析不同空间区域的细胞亚型差异。例如，在2020年Cell的一项胰腺癌研究中，研究者对原发灶、转移灶和癌旁组织进行空间-单细胞测序，发现：01-原发灶内部存在“免疫排斥区”（T细胞浸润稀少，CAFs高表达CXCL12）与“免疫活跃区”（T细胞富集，DCs成熟度高），且两区域交界处的癌细胞高表达上皮-间质转化（EMT）基因；02-转移灶的癌细胞并非来自原发灶的“随机亚群”，而是特异性来自原发灶的“前沿浸润区”，该区域癌细胞高表达MMP9和VEGFA，提示其更强的侵袭与转移能力。03这一发现解释了为何单一活检样本难以代表肿瘤整体heterogeneity——不同空间区域的癌细胞具有不同的生物学行为，治疗需“空间分型”。042肿瘤学：重构肿瘤微环境的“生态地图”2.2免疫微环境的“空间互作网络”免疫细胞与肿瘤细胞、基质细胞的空间互作决定免疫治疗响应。空间-单细胞联用可构建“细胞互作的空间距离矩阵”，解析哪些互作是“促效”的，哪些是“抑制”的。例如，在2022年NatureCancer的一项黑色素瘤研究中，通过MERFISH技术结合scRNA-seq，发现：-CD8+T细胞的“空间聚类”与患者生存率正相关：当CD8+T细胞与DCs形成“免疫synapse”结构（距离<10μm）时，T细胞高表达IFN-γ和颗粒酶B，提示抗肿瘤活性强；-调节性T细胞（Tregs）的“空间定位”决定免疫抑制强度：Tregs若与CD8+T细胞直接接触，会显著抑制T细胞活性；若仅与CAFs接触，则主要抑制成纤维细胞的活化。2肿瘤学：重构肿瘤微环境的“生态地图”2.2免疫微环境的“空间互作网络”这些发现为优化免疫治疗提供了新思路——例如，通过药物调控Tregs的空间分布，使其远离CD8+T细胞，可增强免疫检查点抑制剂的疗效。2肿瘤学：重构肿瘤微环境的“生态地图”2.3耐药性的“空间起源”肿瘤耐药性的产生常与特定微环境“避难所”相关，而空间-单细胞联用可定位这些“耐药克隆”的空间位置。例如，在2023年Science的一项EGFR突变肺癌研究中，对治疗前后的肿瘤样本进行空间-单细胞测序，发现：01-在“药物低渗透区”边缘，存在一群“干细胞样癌细胞”，其高表达ABC转运蛋白（如ABCG2），可外排化疗药物，形成“耐药核心”。03-耐药后，肿瘤内部出现“药物低渗透区”（由CAFs密集排列形成，高表达ECM蛋白如CollagenI），该区域的癌细胞持续激活旁路通路（如MET信号）；023神经科学：绘制大脑的“细胞类型空间图谱”大脑是已知最复杂的器官，包含数千种细胞类型，其功能高度依赖细胞的空间排布。空间-单细胞联用技术正在绘制“人类大脑细胞类型空间图谱”，为理解神经退行性疾病、精神疾病提供基础。12-小胶质细胞的“空间活化异质性”：Aβ斑块周围聚集一群“疾病相关小胶质细胞（DAMs）”，其高表达Trem2和ApoE，具有吞噬Aβ的功能；而在远离斑块的脑区，小胶质细胞呈现“促炎表型”（高表达IL-1β、TNF-α），可能与神经元损伤相关；3以阿尔茨海默病（AD）为例，传统研究聚焦于β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积与Tau蛋白磷酸化的空间分布，却忽略了神经免疫微环境的动态变化。2021年Cell的一项研究利用空间-单细胞联用技术，对AD患者死后脑组织（海马区）进行测序，发现：3神经科学：绘制大脑的“细胞类型空间图谱”-神经元的空间退化模式：Tau蛋白过度磷酸化的神经元并非随机分布，而是沿特定神经环路（如内嗅皮层-海马环路）呈“梯度退化”，提示AD进展的“空间传播”特征。这些发现为AD治疗提供了新靶点——例如，增强斑块周围DAMs的吞噬功能，或抑制远离斑块的促炎小胶质细胞，可能减缓神经元退化。4其他领域的应用拓展除上述领域外，空间-单细胞联用技术还在免疫学（如淋巴结生发中心的B细胞分化空间动态）、代谢性疾病（如脂肪组织的“空间炎症灶”）、再生医学（如类器官的空间成熟度评估）等方面展现出广阔应用前景。例如，在2023年NatureMethods的一项研究中，研究者通过空间-单细胞联用优化类器官培养方案，发现添加特定空间信号分子（如Wnt3a）可使类器官中的细胞空间排布更接近真实组织，显著提升类器官的临床应用价值。04技术挑战与优化方向：从“可用”到“好用”的跨越ONE技术挑战与优化方向：从“可用”到“好用”的跨越尽管空间-单细胞联用技术已取得显著进展，但在实际应用中仍面临多重挑战，这些挑战既是技术瓶颈，也是未来突破的方向。1技术层面的核心挑战1.1样本处理与通量限制-样本需求高：空间-单细胞联用通常需要较多的组织量（尤其是scRNA-seq部分），而临床活检样本往往有限（如穿刺活检仅数十毫克），难以满足实验需求；01-新鲜冷冻依赖：多数ST平台（如Visium）需新鲜冷冻组织（FFPE样本的RNA降解严重影响数据质量），但新鲜样本的获取与运输对临床研究构成极大限制；02-通量不足：高分辨率ST（如MERFISH）和空间单细胞技术（如Xenium）一次实验仅能检测1-2个组织切片，难以满足大规模队列研究的需求。031技术层面的核心挑战1.2数据复杂性与算法瓶颈-高维异构数据整合：scRNA-seq与ST的数据维度（基因数）、稀疏性（零值比例）、分辨率（细胞/spot）差异巨大，现有算法难以完全消除“批次效应”与“空间偏差”；-动态过程建模不足：现有算法多针对静态组织切片，难以解析发育、疾病进展中的“时空动态”（如细胞迁移的连续轨迹、微环境随时间的渐变）；-细胞互作网络推断的准确性：基于空间距离的细胞互作预测（如CellChat、NicheNet）存在“相关性不等于因果性”的问题，缺乏实验验证的高通量方法。1技术层面的核心挑战1.3技术成本与标准化缺失-高昂成本：一次空间-单细胞联用实验（包括scRNA-seq+ST+数据整合）的成本可达数万至数十万元，限制了其在中小实验室的推广；-标准化不足：不同实验室的样本处理、实验流程、数据分析参数存在差异，导致不同研究的结果难以直接比较，亟需建立统一的标准操作规范（SOP）。2优化方向与技术迭代针对上述挑战，学术界与工业界正在从多个方向进行技术优化：2优化方向与技术迭代2.1样本制备技术的革新-FFPE适配性提升：开发新型探针捕获技术（如10xGenomics的FFPEVisium），通过RNA修复与扩增技术，使FFPE样本可用于空间转录组测序，这将极大拓展临床样本的应用范围；-微量样本扩增技术：基于多重置换扩增（MDA）或模板交换扩增（TEA）技术，实现微量组织（如单细胞水平的空间捕获）的转录组扩增，解决临床活检样本量不足的问题；-高通量ST平台：如Slide-seqV2通过提高探针密度，将通量提升至一次检测10个以上组织切片，为大规模队列研究奠定基础。2优化方向与技术迭代2.2数据算法的智能化升级-人工智能（AI）驱动的数据整合：利用深度学习模型（如Transformer、图神经网络）处理高维异构数据，例如SpatialTransformer算法通过自监督学习捕捉空间表达模式，提升注释准确性；01-因果推断工具：结合单细胞CRISPR筛选（如空间Perturb-seq），通过扰动基因表达验证细胞互作的因果关系，从“相关性分析”走向“机制解析”。03-时空动态建模：开发基于动力学模型（如Fokker-Planck方程）的算法，解析细胞迁移、分化的连续时空过程，例如STEMNET算法可模拟神经干细胞在空间中的分化轨迹；022优化方向与技术迭代2.3成本控制与标准化推进-技术平台国产化：国内企业（如华大基因、达安基因）已推出自主的空间转录组平台，降低仪器与试剂成本；-自动化实验流程：开发自动化样本处理系统（如Hamilton公司的液体处理平台），减少人工操作误差，提升实验重复性；-数据共享与标准化：建立国际性数据库（如HumanCellAtlas的空间扩展），统一数据格式与注释标准，促进多中心研究的协作。05未来展望：迈向“时空多组学”与“临床转化”的新纪元ONE未来展望：迈向“时空多组学”与“临床转化”的新纪元空间-单细胞联用技术的未来，不仅在于技术的进一步优化，更在于向“多组学整合”与“临床落地”的深度拓展。作为这一领域的见证者与参与者，我对其未来发展抱有三大期待：1从“转录组”到“时空多组学”的融合当前的空间-单细胞联用主要聚焦转录组，但生命的复杂性远非转录组所能涵盖。未来，空间多组学技术将成为主流——通过同步检测同一空间位置的基因组（如空间DNA-seq）、表观组（如空间ATAC-seq）、蛋白组（如空间CODEX）和代谢组（如空间代谢组），构建“全维度”细胞状态图谱。例如，在肿瘤研究中，若能同时检测癌基因突变（基因组）、组蛋白修饰（表观组）、免疫检查点蛋白（蛋白组）和代谢物浓度（代谢组）的空间分布，将可精准解析“驱动突变-表观重编程-免疫逃逸-代谢重编程”的全链条机制，为个性化治疗提供更全面的依据。2从“基础研究”到“临床诊疗”的转化空间-单细胞联用技术的终极价值在于解决临床问题。目前，其临床转化