DB14∕T 1177-2016 大田转基因棉花外源序列PCR 检测规程

ICS65.020.20DB14DB14/T1177—2016大田转基因棉花外源序列PCR检测规程2016-03-30发布2016-05-30实施山西省质量技术监督局发布IDB14/T1177—2016前言 12规范性引用文件 13术语和定义 14试剂仪器材料 25样品DNA提取 26PCR检测基因 47PCR反应程序及电泳检测 48样品分析结果 59检测档案记录 5附录A（规范性附录）检测引物 6附录B（资料性附录）转基因棉花检测鉴定结果 7DB14/T1177—2016前□□言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山西省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：山西省农业科学院棉花研究所、运城学院、山西三联现代种业科技有限公司。本标准主要起草人：马燕斌、张树伟、王霞、王新胜、吴霞、李燕娥、张相斌、杨帆、邵新胜、韩青龙、马纪农。DB14/T1177—20161大田转基因棉花外源序列PCR检测规程本标准规定了大田转基因棉花外源序列PCR检测的术语和定义、试剂仪器材料、样品DNA提取、PCR检测基因及序列、PCR反应程序及电泳检测、样品分析结果以及检测档案记录。本标准适用于大田种植的山西省审定棉花品种中转外源序列相关成份的检测鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4407.1经济作物种子第1部分：纤维类NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T673转基因植物及其产品检测抽样NY/T1297农作物品种审定规范棉花NY/T2162棉花抗棉铃虫性鉴定方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1转基因棉花棉花自然遗传存在的基因组序列除外，另包含有经人工分离或修饰的基因序列，该序列是通过生物技术手段导入并整合到棉花基因组中，以控制某一功能或性状发生为目的，最终导致棉花基因组序列发生变化的棉花植株、棉花种子及作为亲本遗传产生的后代。3.2外源基因在转基因棉花中，棉花自然遗传进化存在的基因除外，包含有经过生物技术手段导入的、人工分离修饰得到的基因序列，统称为外源基因。经人工分离修饰基因来源可包括棉花在内的任何生物，该基因通常以控制某一功能或性状发生。3.3外源序列DB14/T1177—20162在转基因棉花中，棉花自然遗传进化存在的基因组核苷酸序列除外，包含有经过生物技术手段导入的、人工分离修饰得到的基因组核苷酸序列，统称为外源序列，该人工分离修饰基因组核苷酸序列可包括棉花在内的任何生物。通常包括有基因、调控基因表达的启动子、终止子、相关的常规调控序列区域以及非功能序列组成等。3.4内标基因Sad1Stearoyl-acylcarrierproteindesaturase英文的缩写，指棉花自然遗传存在的基因序列，编码棉花硬脂-酰基载体蛋白脱饱和酶的基因。3.5PCRPolymeraseChainReaction英文的缩写，即聚合酶链式反应；是一种基于DNA双螺旋分子的特点，利用核苷酸扩增仪通过一个包括DNA序列变性、退火引物与模板链结合、目标序列延伸的不断循环的过程来特定扩增目标DNA片段的分子生物学技术。4试剂仪器材料4.1试剂4.1.1DNA提取及电泳常规用试剂葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、β-巯基乙醇、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、盐酸（Hcl）、琼脂糖4.1.2PCR扩增常规试剂Taq酶、dNTP、loadingbuffer4.2仪器电子称、移液枪、高速离心机、水浴锅、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、振荡器4.3材料待检测的棉花材料；阴性对照非转基因棉花样本，阳性对照为转基因棉花样本。取样标准为新生顶端幼嫩新叶0.2g～0.4g，取样后按名称标记，冰上保存，-80℃冰箱保存备用。5样品DNA提取5.1棉花DNA提取液配制5.1.11mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800mL纯净水中，用浓盐酸溶液调pH值至8.0，用纯净水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃条件下，灭菌15min，常温储存备用。DB14/T1177—201635.1.20.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）称取18.61g乙二胺四乙酸二钠溶解于800mL纯净水中，用NaOH调节pH值至8.0，用纯净水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃条件下，灭菌15min，常温储存备用。5.1.310%聚乙烯吡咯烷酮溶液称取100g聚乙烯吡咯烷酮溶解于800mL纯净水中，定容至1000mL，在103.4kPa、121℃条件下，灭菌15min，常温储存备用。5.1.4DNA提取缓冲液称取69.36g葡萄糖于1L烧杯，加500mL纯净水，充分溶解后，加入100mL1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，10mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液，200mL10%聚乙烯吡咯烷酮溶液，10mLβ-巯基乙醇，充分混匀，用纯净水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃条件下，灭菌15min，常温储存备用。5.2棉花裂解缓冲液配方5.2.11mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL纯净水中，用浓盐酸溶液调pH值至8.0，用纯净水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃条件下，灭菌15min，常温储存备用。5.2.20.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）称取18.61g乙二胺四乙酸二钠溶解于800mL纯净水中，用NaOH调节pH值至8.0，用纯净水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃条件下，灭菌15min，常温储存备用。5.2.310%十六烷基三甲基溴化铵溶液称取100g十六烷基三甲基溴化铵，溶解于800mL纯净水，加热促进溶解，加纯净水定容到1000mL，室温保存。5.2.410%聚乙烯吡咯烷酮溶液称取100g聚乙烯吡咯烷酮溶解于800mL纯净水中，定容至1000mL，在103.4kPa、121℃条件下，灭菌15min，常温储存备用。5.2.5裂解缓冲液称取81.8g氯化钠于1L烧杯，加300mL纯净水，充分溶解后，加入1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液100mL，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液40mL，10%十六烷基三甲基溴化铵溶液200mL，10%聚乙烯吡咯烷酮溶液200mL，β-巯基乙醇10mL，充分混匀，用纯净水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃条件下，灭菌15min，常温储存备用。使用前按1:100加入β-巯基乙醇。5.3DNA提取5.3.1取样取植株嫩叶0.1g～0.2g，加入预冷的新鲜配制的提取缓冲液300μL，研磨。4℃5000rpm离心20min，弃上清液。DB14/T1177—201645.3.2裂解沉淀中加入300μL65℃预热裂解缓冲液，65℃水浴30min，期间翻转混匀2～3次。5.3.3去除蛋白加入24:1的氯仿∶异戊醇混合液400μL，缓慢翻转30次以上，泛白即可，8000rpm离心15min～20min，将上清液转入1.5mL的干净离心管中，加0.6体积的预冷的异丙醇，翻转20次以上，混匀，静置10min左右，8000rpm转速，室温离心10分钟，弃上清液。5.3.4洗涤在沉淀中加入1mL70%的乙醇，轻微振荡，1,000rpm离心2min。倒掉上清液，通风干燥约10min5.3.5溶解加30μLTE缓冲液，溶解DNA，并保存。5.4电泳缓冲液的配制TAE电泳缓冲液配制：称取242.2gTris，用300mL蒸馏水加热搅拌溶解，加100mLNa2EDTA·2H2O(pH8.0，500mmol/L)，用冰乙酸调至pH8.0，加水定容至1000mL。使用时用蒸馏水稀释成50倍体积的TAE。6PCR检测基因6.2NPTII基因的检测NPTII基因为抗抗卡纳霉素基因。引物见附录A。6.3抗虫基因的检测抗虫基因检测是对编码Bt蛋白的外源cry1Ac基因或cry1Ab基因,或者是由cry1Ac和cry1Ab融合的基因进行PCR检测。引物见附录A。6.4调控元件的检测包括CaMV35S启动子、FMV35S启动子、NOS启动子、NOS终止子和CaMV35S终止子等植物转化载体中必要组成型序列的检测。引物见附录A。7PCR反应程序及电泳检测7.1PCR对照设置在试样PCR反应的同时，应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。根据检测目的，以非转基因棉花组织提取的DNA作为阴性对照，已检测的转基因棉花为阳性对照、以去离子水作为空白对照。DB14/T1177—201657.2PCR反应程序在PCR反应管中配制反应体系，反应体系30µL:2×GCbuffer15µL（使用10×buffer3µL，调整ddH2O补足30µL）、dNTPMix0.5µL、引物各0.5µL、ExTaq酶0.1µL、模板DNA0.5µL、去离子水补足30µL。反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸45s；循环5次；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸45s，循环25次；最后72℃延伸10min，12℃保存。每个样品PCR反应设置3次重复。7.3电泳检测7.3.1凝胶配制配制0.8%～1%琼脂糖凝胶。称取0.8g～1g的琼脂糖，放入三角瓶中，微波加热溶化后，制成凝胶板待用。7.3.2加样PCR扩增完成后，每一PCR管中加入3.3µL～4µLloadingbuffer,移液枪吸取加样，220V电压，电泳8min～10min。操作过程戴一次性PE手套防护,预防EB污染。7.3.3凝胶成像分析电泳结束后，取出凝胶，在凝胶成像仪中观测。根据DNA分子量标准估计扩增条带大小，将电泳结果拍照形成电子文件存档。如需通过序列分析确认PCR扩增片段是否为目标DNA片段，可通过凝胶回收片段克隆测序后与序列进行比对。凝胶回收按试剂盒说明进行。8样品分析结果PCR扩增结果条带大小与引物扩增目标大小一致，表明可检测到目标条带；PCR扩增结果条带大小与引物扩增目标大小不一致，表明不能检测到目标条带。结果记录参见附录B。9检测档案记录应详细记录植株名称、田间检测、DNA检测、凝胶电泳等检测结果，并建立档案。检测记录格式及参见附录B。DB14/T1177—20166 检测引物表A.1给出了PCR检测引物。表A.1引物列表扩增目标序列扩增片段大小棉花内标基因Sad1正向引物Sad-F15’-TGGCCTCTAATCATTGTTATGATG-3’282bpSadt-R15’-TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC-3’NptII基因Npt-F685’-ACTGGGCACAACAGACAATCG-3’289bpNpt-R3565’-GCATCAGCCATGATGGATACTTT-3’Bt基因正向引物Bt-F15’-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3’301bp反向引物Bt-R15’-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’CaMV35S启动子正向引物35S-F15’-GCTCCYACAAATGCCATCATTGC-3’反向引物35S-R15’-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3’FMV35S启动子FMVS-F15’-AAGACATCCACCGAAGACTTA-3’210bpFMV-R15’-AGGACAGCTCTTTTCCACGTT-3’NOS启动子PNOS-F15’-GCCGTTTTACGTTTGGAACTG-3’PNOS-R15’-TTATGGAACGTCAGTGGAGC-3’NOS终止