DB14∕T 1789-2019 禽流感病毒H7亚型抗体竞争ELISA检测方法

ICS11.220B41DB14IDB14/T1789—2019前言 12缩略语 1 14实验条件 1 16结果判定 27注意事项 3附录A（规范性附录）试剂配制方法 4DB14/T1789—2019本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山西省农业农村厅提出并监督实施。本标准由山西省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山西省动物疫病预防控制中心、武汉科前生物股份有限公司、华中农业大学。本标准主要起草人：雷宇平、王仲兵、郎小兵、金梅林、董晓辉、但汉并、卢月、胡明明、王治维、芦俊彦、樊慧锦、宁艳、雷冲、王锦、刘田勇。DB14/T1789—20191禽流感病毒H7亚型抗体竞争ELISA检测方法本标准规定了应用竞争酶联免疫吸附法检测血清中禽流感病毒H7亚型抗体方法的缩略语、实验原理、实验条件、实验方法、结果判定和注意事项。本标准适用于禽流感病毒H7亚型抗体的检测。2缩略语下列缩略语适用于本文件。ELISA：酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay）OD：光密度值(opticaldensity)HRP：辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)3实验原理本标准采用竞争酶联免疫吸附法，该方法利用抗原抗体反应具有特异性的特点，将特异性的H7亚型禽流感病毒血凝抑制试验抗原吸附到固相载体的表面，将待检血清和特异性酶标单抗同时加入包被板孔。由待检血清中的抗体和酶标单抗竞争与包被抗原结合，待检血清中抗体越多，结合在包被抗原上的酶标单抗就越少，阳性血清反应呈色浅于阴性血清。4实验条件4.1实验室环境实验操作在15℃~25℃下进行。未灭活的感染性材料的实验活动，应在Ⅱ级生物安全柜内进行。4.2仪器Ⅱ级生物安全柜、离心机、酶标仪、洗板机（或手洗）、微量移液器、冰箱、恒温箱。5实验方法5.1实验材料禽流感病毒H7亚型包被抗原、HRP标记的禽流感病毒H7亚型HA蛋白的单克隆抗体（酶标记物）、底物液、终止液、样品稀释液、洗涤液、包被液、封闭液。试剂配制方法见附录A。5.2样品准备DB14/T1789—20192取动物全血，待血液充分凝固后，4000r/min离心10min，收集血清。也可等凝固后自然析出血清。血清应清亮，无溶血。样品处理过程中应防止样品的污染，注意个人安全防护。5.3包被用包被液将包被抗原稀释至工作浓度2μg/mL，加至抗原包被板中，每孔100μL，放置2℃~8℃条件下，包被15h。5.4封闭弃去包被液，每孔加入封闭液200μL，置37℃±1℃孵育2h；弃去封闭液，拍干，再置37℃±5.5待检血清的稀释待检血清在血清稀释板中做10倍稀释。5.6操作步骤5.6.1加样取抗原包被板，先用洗涤液洗涤抗原包被板1次，稀释好的待检血清、阴性对照和阳性对照各取50μL，加至抗原包被板中，每板待检血清设1孔，阴、阳性对照各设2孔，同时加入酶标记物50μL。轻轻振匀孔中样品，置37℃±1℃下温育45min。5.6.2洗涤弃去孔中液体，每孔加入洗涤液200μL，重复洗涤5次，最后一次拍干。5.6.3加酶标抗体将辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体用封闭液1:1000稀释，每孔加100μL，37℃±1℃放置30min。5.6.4洗涤弃去孔中液体，每孔加入洗涤液200μL，重复洗涤5次，最后一次拍干。5.6.5加底物液每个反应孔加入底物液100μL，置20℃~25℃下避光显色15min。5.6.6加终止液每孔加终止液50μL，10min内在酶标仪上测定450nm波长处的OD值。6结果判定试验成立的条件：阴性对照的平均OD450nm值大于1.0，阳性对照的抑制率（PI值）大于50%。S=样品孔OD450nm值，N=阴性对照孔平均OD450nm值。PI值=(1-S/N)×100%。DB14/T1789—20193若被检样品的抑制率小于40%，该样品判为禽流感病毒H7亚型抗体阴性。若被检样品的抑制率大于或等于40%，该样品判为禽流感病毒H7亚型抗体阳性。7注意事项7.1人员防护实验过程中注意做好个人的安全防护工作。7.2样品处理血清应在Ⅱ级生物安全柜中析出。7.3废弃物处理操作区应有专门的固体和液体废弃物收集容器。废弃物经高压灭菌后按相关规定处理。DB14/T1789—20194试剂配制方法A.1包被液包被液为碳酸盐缓冲液（0.025mol/L，pH9.6）。将下列试剂按序加入1000mL规格的容器中，加800mL蒸馏水充分溶解，定容至1000mL。碳酸钠（Na2CO3）1.59g碳酸氢钠（NaHCO3）2.93g加蒸馏水至1000mLA.2洗涤液氯化钠（NaCl）8.0g氯化钾（KCl）0.2g十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）2.9g磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2gTween-200.5mL加蒸馏水至1000mLA.3底物液商品化TMB显色液。A.4终止液98%浓硫酸（H2SO4）108.8mL加蒸馏水至1000mLA.5样品稀释液氯化钠（NaCl）8.0g氯化钾（KCl）0.2g十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）2.9g磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g加蒸馏水至1000mLA.6封闭