合成生物学在细胞治疗中的临床应用

合成生物学在细胞治疗中的临床应用

当前的疾病诊疗方式主要是依靠分析生物样本来诊断疾病，然后

进行化学小分子或生物大分子药物干预，很难对病理指标进行动态监

控并实时治疗。利月合成生物学方法可以为细胞设计新的功能，制备

细胞治疗工具，在感应病理指标的同时产生治疗作用。

合成生物学不但可以利用原核细胞通过响应环境刺激来调控效

应分子，还可以为真核细胞作为底盘细胞装备生物传感器检测疾病靶

标，同时激活下游信号通路。2017年，FDA批准了第一个CART

细胞治疗药物，成为细胞治疗领域重要的里程碑。本文就合成生物学

在细胞治疗的进展和临床应用做出介绍。

一、肿瘤的细菌治疗

肿瘤微环境是乏氧环境，而且具有免疫抑制性，这有利于厌氧细

菌的生长。利用厌氧菌在肿瘤微环境的富集效应，注射厌氧菌可以在

肿瘤组织诱导激活免疫系统，免疫反应以不依赖肿瘤抗原的方式攻击

厌氧菌和肿瘤细胞，产生抗肿瘤效果。可以用于肿瘤治疗的细菌包括

Salmonella^Bifidobacterium、Escherichia和Clostridium等。

在一项II期临床试验中,Salmonellatyphimurium(S.

typhimurium)与化疗药物联用可以用于治疗胰腺癌。为了增强细菌

治疗的肿瘤靶向性，在细菌上表达了肿瘤特异抗原或者肿瘤特异抗

体，可以实现肿瘤抗原依赖的细菌富集(图1a)。

a

MetabolitesColonizationof

tumour-specific

microbiome

community}

Tumour

SensorelementAnticancer

(e.g.FF+2Opromoter)effectors

Activationofhost

Proliferationimmuneresponse

Tumour

death

AutolysisPayload

(e.g.CD47nb)

AHL-controlledContentrelease

autolysinexpression

图1a肿瘤的细菌治疗

细菌还可以递送多种抗癌分子，并且使用肿瘤环境特异启动子来

驱动抗癌基因表达，能够实现响应肿瘤微环境释放抗癌分子。常用的

抗癌分子包括前药酶、siRNA等。I期临床试验(NCT01562626)正

在评价表达胞喀嚏脱氨酶的Bifidobacterium对实体瘤的治疗效果。

胞嘴嗦脱氨酶用于将前药flucytosine转化为抗肿瘤药5-fluorouracilo

为了在肿瘤组织调控工程细菌，多种传感器被构建到细菌中，可以响

应多种调控信号，如细菌密度、低氧水平和低葡萄糖浓度等。例如，

S.typhimurium经过工程改造后可以响应低氧环境表达溶菌蛋白

HlyE。诱导型细菌自溶系统则可以同时实现可控的抗癌分子递送和细

菌种群数量的稳定。

诱导型自溶Escherichiacoli(E.coli)细菌群体感应(quorum

sensing)分子acyl-homoserinelactone(AHL),当AHL处于低水平

时，细菌增殖并在胞内产生抗癌分子，随着细菌数量增加，AHL不

断积累并超过阈值，会导致细菌裂解而释放抗癌分子。

二、其他疾病的细菌治疗

细菌治疗还用于治疗肠道菌群紊乱，代谢疾病和炎症反应疾病。

E.coliNissle1917和Lactobacillus等本身是益生菌,而且容易进行

工程改造，可以作为细菌治疗中良好的底盘细菌。高血氨症是由于尿

素循环中酶缺陷导致的血液氨堆积。

E.coliNissle1917被改造可以同化氨并合成精氨酸，降低血液

氨浓度，但该方法未能通过I期临床试验。苯丙酮尿症是一种无法代

谢苯丙氨酸的代谢疾病。通过在E.coliNissle1917中表达氨基酸脱

氨酶，可以将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸从而减少氨基酸的堆积，该研

究目前已顺利通过临床I期试验（图1b）。

bDefectivehostmetabolism

•Enablebiocontainmentbyremoving

dapAtogenerateadiaminopimelate

auxotroph

•Anaerobic-induciblepromoterdriving

expressionofL-Phedegradingcytosolic

andperiplasmicenzymes

E.coliNissle1917经改造表达抗菌肽和biofilm降解酶，用于治

疗铜绿假单胞菌感染（图1c）。

DspB(biofilmdistribution)

1

PyocinS50O

r.aeruginosa(antibacterial)OO

E7lysis

protein

(releaseof

effectors)

Effectorgenes

E.coliNissleAalrAdadXexpressingLasR^.^

Quorum-sensing

molecules

图1C细菌治疗病原体感染

肠道细菌和噬菌体还被改造用于向病原菌递送基因编辑元件，以

减少病原菌的抗药性和毒力基因的表达（图1d）o工程化细菌还被

用于控制哺乳动物细胞的基因表达。例如，含有siRNA质粒的细菌

可以侵入并将质粒递送到肠道粘膜细胞，用于降低细胞炎性酶C0X2

的表达。

图1d细菌提送基因

目前已有多个细菌治疗系统处于临床试验阶段（表1）,但是细

菌的工程化改造也面临挑战。首先，为细菌设计合适的信号调控开关

并不容易，细菌难以响应合适的信号阈值并产生适当浓度的效应分

子，这影响了细菌疗法的治疗效果。

其次，细菌治疗存在生物安全性风险，欧盟和美国的药监部门对工程

菌的基因组稳定性、细菌在体内的定植时间和在体内是否能够被清除

等问题都要求提供大量证明。为了提高细菌治疗的生物安全性，有一

系列措施用于细菌的改造，例如移除工程细菌的毒力基因来减少细菌

毒性，使用营养缺陷型细菌或者引入自杀基因在必要时可以清除体内

工程菌。

表1近期细胞治疗的临床试验

CIMoltnalDiSMMTreatmentormterventtonPhase

NCTO45892MMe<pancresncsneerSolmoncOary^imunumeHprvssmqrajnwiN

IL-2ancofntxnabonwttheitherFOLARINOX

orgtrnciubine

NCTonsioo;1dMtrtc5mrlbtutlocrococcuskrhsincombnatnnKhl/V

tepiizumab

NCTDI56/6Z6Adwancc<Vmcta«MkwildtonounBtfidobarttrtumlon^umcxprrswngcMaunel/l

drinwNHcinco*nmnM)onwithtiwarug

fiucytoMe«ndgrowthenhmeer10%m41tMe

NCTO416/B7MrtMtMkBidncopUtm.lymphomaFidurleMdcoilNhileenjmwredto1

expms5mGaqcntnincomtmauonwith

atcxoluiinwb

NCT04S34s42Rwny&etomriaE.ooM*s4eengineeredtomcuboliicII

Vfi*n0jUnin*

NCTOM16177r/rAUCD19CARTcdbth«c•aitcid*9m*i/a

(iC4spO)CARTceldrsmictionafter

rtmiduetd«dm<ni«ration

NCTonasinr/rQlCD10CARTcett:'armoured'wtthexpre»on1

of«naddit"MicoTimdMerygand

(4-168DthM4tK>eaprw«$ukidegcn«

(EGFRt)aBowmgCARTcdldenructwoftu

cetwunwb>dm)nKtfMion

NCTO4J779Mr/rGPCrwildtumounCFCJCARTedb*armourv<rwithrxprvsaonl

olL1SthMexpress,lutddc9ene

(iC^spO)aMowtngCARTcdldestmenon.fter

runtduridAdmimtration

NCTO421O265rAAMLr/iBALLBRDCNModuhr.un<ARTc«isincombUwoonwithl

aEombmantantibodydrbvativetM9cted

tow«dtCD12i

NCTO4631148Rcn«lcanc»t,trimrtionelcdlc4ncefoftheModular.uniCAATce*$Incomb«wKtonwtth1

renalpe+vcandurM«prostMecancct»recombinartantibodyderfvMivetargcted

nonsmal«■cancelbmi«c^ncec.towardsP5MApcpode

cdofecuicanccf

NCTO41so497次BALLAaogmcCD22CARTcdB1

rAMMAflogene«cBCMACARTcMs1

NCTDK)$61J9r/racuteandQICordblood-dertvedrwKiralbUercells3thUN

CD19CARXMR9.R.IS

NCT0»965MGbobUstoauMeMnchymtl5<«ncelbproducmgonedyoe1

adenokww

三、改造免疫细胞的细胞治疗

合成生物学在T细胞治疗领域已经获得了巨大成功。为模拟天然

T细胞的细胞杀伤作用，合成的Tcellreceptor(TCR)-T细胞治疗是

将识别肿瘤抗原肽的TCR构建到杀伤性T细胞上。

TCR不但可以结合膜表面抗原，还可以结合胞内抗原，因此可

以针对广泛的靶点。TCR-T细胞治疗在临床试验中取得了积极的治

疗效果。但是TCR只能识别抗原肽-MHC分子复合物，而MHC分

子在人群中具有多态性，这限制了TCR-T细胞治疗的应用。

为了摆脱MHC分子的限制，人工构建了嵌合受体chimeric

antigenreceptor(CAR),CAR受体是将scFv与TCR的信号转导

区域融合的人工受体，可以不依赖MHC分子识别肿瘤抗原。

第一代CAR受体只含有一个胞内信号结构域；第二代和第三代

CAR受体包含一个或两个共刺激信号结构域，可以提高T细胞的增

殖和细胞因子分泌，是目前已经被批准的CART细胞所采用的受体;

第四代CART细胞在上一代基础上增加了响应CAR信号的下游效应

基因如细胞因子，可以提高T细胞在体内的存活时间(图2a)。

A

Tumourantigen

CAntigen-recoqnition

3aomain

Spacer

Transmembranedomain

Signallingdomains

(Icellactivation,

co-stimulation)

图2ACART细胞治疗的设计

尽管CART细胞在血液肿瘤的临床治疗中取得了成功，但是针

对实体瘤，还不能实现安全和有效性的治疗。近年来，科学家已经利

用合成生物学原理对CART细胞做了诸多改进。在提高安全性方面,

以caspase9或者herpessimplexvirusthymidinekinase

（HSV-TK）作为自杀基因，利用小分子诱导二聚等原理激活自杀基因

作用，可以在需要时清除CART细胞（图2Ba）。

BSafety

BaSuicidegenes

iCasp9HSV-TK

图2Ba携带自杀基因的CART细胞

另外，为CART细胞构建额外的抑制性iCAR受体可以减少对

健康细胞的攻击抑制性iCAR是将T细胞抑制性受体CTLA4或PD1

的胞内区与识别健康细胞抗原的scFv融合，CART细胞可以利用抑

制性iCAR受体识别健康细胞而不会产生杀伤激活信号，利用杀伤性

CAR受体识别肿瘤抗原（图2Bb）。

BbInhibitoryreceptors

iCARs

图2Bb抑制性CART细胞

减弱CART细胞的功能活性也是一种提高安全性的策略，利用

小分子诱导的CAR蛋白降解可以调节细胞表面的CAR受体表达水

平，能够实现对CART细胞活性的可逆调节（图2Bc）。

BeExpression-levelmodulation

CARLID)-------

图2BcCAR受体表达水平的调节

在提高有效性方面，SynNotch-gatedCAR可以实现“AND”逻辑

门控制杀伤，即只有两种肿瘤抗原同时存在时才能激活肿瘤杀伤作

用。聚体原理时，第一个肿瘤抗原结合T细胞的SynNotch受体后导

致受体的转录因子结构域从受体上被切割并进入细胞核，启动CAR

受体的表达，CAR受体可以识别第二个肿瘤抗原产生肿瘤杀伤效应

（图2Bd）。

Efficacy

图2BdSynNotch-gatedCART细胞

AvidCART细胞是用低亲和力的单域抗体替代高亲和力的scFv

构建CAR受体，这使得AvidCART细胞必须依赖两个CAR与肿瘤

抗原结合才能激活下游信号通路，提高了对肿瘤抗原表达水平的区分

度（图2Be）。

BeAviditytuning

AvidCARs

NoactivationActivationandActivationand

cytotoxicitycytotoxicity

图2BeAvidCARTZ田胞

Split,universalandprogrammable(SUPRA)CARs是一种通用

的CAR受体，由TCR胞内区和胞外leucinezipper组成，SUPRA

CART细胞发挥功能需要依赖向内体注射适配蛋白，适配蛋白一端

为识别肿瘤抗原的scFv,另一端为互补的leucinezipper结构域，

SUPRACART细胞可以根据不同的adaptor蛋白来识别不同的肿瘤

抗原(图2Bf),在肿瘤治疗的不同阶段,杀伤表达不同肿瘤抗原的

肿瘤细胞，可以有效防止肿瘤细胞逃逸。

BfAntigenswitching

SUPRACARsz

图2BfSUPRACART细胞

除了用于CART细胞治疗外，CAR受体还被应用于其他免疫细

胞。NK细胞是固有免疫细胞，可以通过受体介导细胞杀伤。装载了

识别肿瘤抗原受体的CAR-NK细胞在临床I期和II期试验中都显示

出了良好的治疗效果（图3a）。

而且CARNK细胞可以使用来源于HLA不配对的异体NK细胞进行

CAR受体的表达，临床试验结果表明异体来源的NK细胞在病人体

内有良好的免疫耐受，但是目前异体NK细胞免疫耐受的机制还不清

楚。

aNaturalkillercells

KillsactivatedTcells

CAR-mediated

celldeath

图3aCARNK细胞

在肿瘤微环境中，有两种功能相反的巨噬细胞，M1巨噬细胞具

有抗肿瘤活性，而M2巨噬细胞可以促进肿瘤生长。研究表明，CAR・

巨噬细胞可以浸润实体瘤，通过释放细胞因子调节免疫，不但可以维

持M1巨噬细胞的稳定，还能将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞，

Hostimmuneactivation

图3bCAR巨噬细胞