基因工程实验基本操作指南

基因工程实验基本操作指南基因工程实验通过定向改造核酸分子实现生物性状的精准调控，其操作的规范性与细节把控直接决定实验成败。本指南聚焦基础实验流程，从样本处理到产物分析，梳理关键操作逻辑与质控要点，为科研实践提供可落地的技术参考。一、实验前的准备工作（一）环境与器材准备基因工程实验对无菌、无核酸污染的环境要求严苛：超净工作台需提前开启紫外灯照射30分钟（操作前通风15分钟）；PCR操作区需独立设置，避免扩增产物“气溶胶污染”模板。移液器、离心机等仪器需定期校准；微量离心管、吸头经高压灭菌（121℃，20分钟），枪头盒、离心管架用75%乙醇擦拭消毒。（二）试剂与耗材准备1.核酸相关试剂：根据实验需求配制/购买DNA提取试剂盒、PCR预混液（含Taq酶、dNTP、缓冲液）、限制性内切酶（及配套缓冲液）、T4DNA连接酶、琼脂糖等。酶类需-20℃保存，避免反复冻融。2.载体与宿主菌：常用载体（如pUC、pET系列）需经质粒提取后定量；宿主菌（如*E.coli*DH5α、BL21）需新鲜活化（-80℃冻存菌需提前复苏并划板培养）。二、核酸的分离与扩增（一）基因组DNA/质粒提取1.植物基因组DNA提取（CTAB法）称取0.1g新鲜组织，液氮研磨成粉后加入600μL预热的CTAB提取液（含β-巯基乙醇），65℃水浴30分钟（期间轻柔颠倒混匀）。加入等体积氯仿-异戊醇（24:1），涡旋后____rpm离心10分钟，取上清转移至新管。加0.6倍体积异丙醇，-20℃静置30分钟沉淀DNA；____rpm离心10分钟，弃上清后用70%乙醇洗涤沉淀2次，晾干后用TE缓冲液溶解。用Nanodrop检测浓度与纯度（理想值：OD₂₆₀/₂₈₀≈1.8，OD₂₆₀/₂₃₀≈2.0）。2.质粒DNA提取（小量法）挑取单菌落接种于5mL含抗生素的LB培养基，37℃振荡培养12~16小时。取1.5mL菌液，____rpm离心1分钟，弃上清后加250μL溶液I（含RNaseA）重悬菌体。加250μL溶液II（温和颠倒混匀，室温静置5分钟，勿剧烈振荡），再加350μL溶液III，颠倒混匀至出现絮状沉淀，____rpm离心10分钟。取上清过柱，按试剂盒说明洗涤、洗脱，最终用TE或ddH₂O溶解质粒，电泳或定量检测。（二）PCR扩增技术1.反应体系设计（以20μL为例）模板DNA（质粒≤10ng，基因组≤100ng）、10μL2×PCR预混液、上下游引物（各0.5μL，10μM）、ddH₂O补至体积。2.程序设置（通用模板）预变性：95℃3分钟；循环（25~35次）：95℃30秒（变性）→*Tm*℃30秒（退火，依引物Tm值调整）→72℃*n*分钟（延伸，1kb/min）；终延伸：72℃5分钟；4℃保存。3.质控要点设置阴性对照（模板换ddH₂O），引物需经PAGE纯化；若条带模糊，可调整退火温度梯度（±5℃）或增加模板量。三、核酸的酶切与连接（一）限制性内切酶酶切1.酶切体系（50μL）质粒DNA（1~5μg）、10×酶切缓冲液5μL、内切酶（1~2μL，单位数依酶活性）、ddH₂O补至体积。2.反应条件37℃水浴1~4小时（依酶说明书）；双酶切若缓冲液兼容，可同时加两种酶；若不兼容，先低盐酶后高盐酶（中间换缓冲液）。3.产物检测取5μL酶切液进行琼脂糖电泳（1%胶，80V电泳30分钟），观察载体骨架与插入片段是否分离。（二）T4DNA连接1.连接体系（20μL）线性化载体（≤0.1pmol）、插入片段（3~10倍载体摩尔数）、10×连接缓冲液2μL、T4连接酶（1μL，200U/μL）、ddH₂O补至体积。2.反应条件粘性末端：16℃过夜；平末端：22℃2小时（快速连接可25℃30分钟，但效率略低）。3.优化策略载体需去磷酸化（用CIAP酶）避免自连；插入片段与载体的摩尔比可通过核酸浓度计算：*摩尔数（pmol）=(ng×10⁻⁹)/(bp×660)*，确保片段量为载体的3~10倍。四、重组载体的转化与筛选（一）感受态细胞制备（CaCl₂法）挑取*E.coli*单菌落接种于5mLLB，37℃振荡培养至OD₆₀₀≈0.4~0.6。菌液冰浴30分钟，4℃4000rpm离心10分钟，弃上清后用预冷的0.1MCaCl₂重悬菌体，冰浴30分钟。再次离心后，用含15%甘油的0.1MCaCl₂重悬，分装后-80℃保存。（二）热激转化取50μL感受态细胞，加入5μL连接产物（或质粒对照），冰浴30分钟。42℃热激90秒（精确计时），迅速冰浴2分钟。加450μL无抗LB，37℃振荡培养1小时（复苏）。取100μL菌液涂布于含抗生素的LB平板，37℃倒置培养12~16小时。（三）阳性克隆筛选1.菌落PCR：挑取单菌落至10μLddH₂O，煮沸5分钟裂解，取1μL作为模板，用载体通用引物（如M13）或插入片段特异性引物PCR，电泳检测条带大小。2.酶切验证：挑取阳性菌落扩大培养，提取质粒后用原酶切体系酶切，电泳观察载体与插入片段条带。3.测序验证：将阳性质粒送测序，比对序列确保无突变或移码。五、蛋白表达与检测（可选）（一）原核表达诱导挑取含重组质粒的BL21菌，接种于含抗生素的LB，37℃培养至OD₆₀₀≈0.6。加IPTG（终浓度0.1~1mM），20~37℃振荡培养3~6小时（低温利于可溶性表达）。（二）蛋白检测1.SDS：收集菌液，超声破碎（冰浴，功率30%，工作3秒停5秒，总时间5分钟），____rpm离心10分钟，取上清与沉淀分别上样，考马斯亮蓝染色后观察目的条带。2.WesternBlot：蛋白转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1小时，加一抗（4℃过夜），TBST洗膜后加二抗（室温1小时），ECL发光显影。六、实验安全与规范1.生物安全：宿主菌、重组菌需经高压灭菌（121℃，20分钟）后处理；操作时佩戴手套、口罩，防止气溶胶吸入。2.试剂安全：EB（溴化乙锭）、DMSO等有毒试剂需妥善保存，操作时戴手套；酶类、核酸染料避免接触皮肤与黏膜。3.数据记录：实验过程需详细记录试剂批号、反应条件、电泳结果等，原始数据（如凝胶