热空气调节对甜樱桃果实苯丙烷类代谢的分子机制的研究

热空气调节对甜樱桃果实苯丙烷类代谢的分子机制的研究目录TOC\o"1-3"\h\u19481摘要 热空气调节对甜樱桃果实苯丙烷类代谢分子机制的研究前言甜樱桃是指欧洲甜樱桃（Prunusaviumlinn.）,又名大樱桃，为蔷薇科李属樱桃亚属植物[1]。甜樱桃果实由于含有丰富的营养，色泽光亮、颜色鲜艳且其口味酸甜可口深受大众喜爱，又因为其产期较短，同期水果种类较少，易于销售，具有极高的经济价值。但由于种植地区较为集中，异地销售要经过长途运输。但是由于甜樱桃果肉较软、果皮较薄、汁液多，不耐储运。在运输及贮藏过程中极易受到微生物的感染及受到挤压腐烂而造成废弃，且由于运输时间过长及条件不适造成果实品质下降，口感变差，营养物质损失。[2]目前大多数的方法通过是物理、化学、生物和综合防治等控制甜樱桃果实采后微生物侵染产生的腐烂问题，通过气调贮藏、减压冷库贮藏及喷洒化学保鲜剂等方法解决甜樱桃的枯梗、果实脱水软化及口味变差等问题[3]褐变是影响甜樱桃外观品质的主要因素，同时也影响营养物质的含量和口感。果蔬组织发生的主要是酶促褐变，酶促褐变是指花青素等多酚类物质在多酚氧化酶的作用下与氧气发生的生化反应。[4]水果和蔬菜在采后脱离母体之后，组织中仍然进行活跃的新陈代谢活动，在酶的作用下由这种正常的代谢过程而形成色素。花青素是植物呈色的主要色素之一，是黄酮类多酚化合物，[5]是果蔬发生酶促褐变的重要反应底物。目前对花青素的生物合成途径已经普遍产生共识。首先是L-苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）、4-香豆酰CoA连接酶（4CL）作用下转化为4-香豆酰CoA，这一段被称为苯丙烷类代谢途径。之后，4-香豆酰CoA经过查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）和黄烷酮-3-羟化酶（F3H）先后作用转化成二羟黄酮醇。无色黄酮醇再经过二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）、无色花色素双加氧酶催化合成花青素，这个复杂的阶段被称为黄酮类代谢途径。[6]由于人们环境保护和食品安全意识的不断提高,运用化学保鲜剂延长果蔬贮藏期的方法因为其费用昂贵且药物残留正逐渐的被抛弃,相反，物理和生物处理方法因为高效、无药物残留以及可以大规模实施开始受到青睐。[7]目前，采用较多的为物理处理方法或者物理结合生物处理方法，本实验将采用物理热处理方法对甜樱桃的褐变进行研究。较多的实验研究证明果蔬采后进行合适的热处理，通过改变酶的活性和不同物质的含量可以达到延缓成熟衰老、减轻冷害、防止病虫害等的目的。[8]孔祥佳等研究发现热空气处理降低冷藏橄榄果实的冷害率。[9]王静等用55℃热水处理哈密瓜减轻冷害程度[10]陆振中等研究发现适宜的热空气处理有效保持了中华寿桃果实品质。[11]屠康等通过热空气处理，有效延缓金冠苹果的后熟衰老,和控制微生物病害的发生。[12]曹明明等证明适宜的热水处理可以降低葡萄的抗氧化活性和发病率[13]本实验以新鲜甜樱桃为材料，研究了热空气(44℃，114min)处理过[14]，后又常温下分别贮藏1、2、3、4、5天的甜樱桃果实的主要品质指标和相关酶含量的变化情况，以期通过采后提高甜樱桃的贮存时间，为甜樱桃的储藏运输及延长货架期提供有价值的理论依据。1.材料与方法1.1实验材料1.1.1材料与试剂甜樱桃：挑选同等成熟度、大小适中、色泽均匀，无病虫害和无机械损伤的新鲜果实。50mmol/L、pH8.8硼酸缓冲液；0.1mol/L、pH8.8硼酸缓冲液；提取缓冲液（含40g/LPVP、2mmmol/LEDTA和5mmol/Lβ-巯基乙醇）；20mmol/Ll-苯丙氨酸溶液；6mol/L盐酸溶液；0.2mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0，含25%甘油和0.1mol/LDTT)；15μmol/LMgSO4溶液；50μmol/mLATP；1μmol/mLCoA；0.15μmol/mLp-香豆酸；1μmol/L的脱氢栎精；1μmol/LNADPH；6μmol/L的葡萄糖-6-磷酸；1%HCl-甲醇溶液；1.1.2仪器与设备GL立式高速冷冻离心机：盐城市凯特试验仪器有限公司移液枪：德国EppendorfBCD-206TXZ冷藏冷冻柜：青岛海尔股份有限公司UV-1800型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司电子天平HZ1002A∶慈溪红钻衡器设备有限公司双列四孔仪表恒温水浴锅∶上海树立仪器仪表有限公司1.2原料处理将实验用的甜樱桃果实平均分为5组，每一组又分为实验组和对照组。将实验组果实放入44℃培养箱进行热处理114min(由预实验确定)，对照处理组放置2-4℃条件下进行贮藏。再分别在恒温箱21℃条件下放置1~5天，每组用保鲜膜包装标志好之后放于液氮中冷冻一天，取出后置于-20℃冷冻库中保存。1.3指标的测定及实验方法1.3.1苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定称取甜樱桃果实5.0g，放于研钵中，向其中加入5.0ml提取缓冲液（含40g/LPVP、2mmmol/LEDTA和5mmol/Lβ-巯基乙醇），在冰浴条件下迅速研磨成匀浆。将匀浆全部转移至离心管中，于离心机4℃、3000r/min条件下离心30min，取上清液，将上清液于4℃下保藏。分别向2支试管中各加入3.0ml50mmol/L硼酸缓冲液（pH8.8）、0.5mL20mmol/Ll-苯丙氨酸溶液。其中一支试管加入0.5ml上清液，另一支试管中加入0.5ml经煮沸失活的上清液作为对照。然后，将2支试管置于37℃水浴锅中保温60min。保温结束后马上向2支试管中各加入0.1ml6mol/L盐酸溶液使反应结束。用蒸馏水调零，分别测定2支试管中的溶液在波长290nm处的吸光度值。重复三次。[15]酶活性表示为U/mgprotein（U）。1.3.22,4-香豆酰-辅酶A连接酶(4CL)活性的测定称取甜樱桃果实3.0g，放入研钵中，向其中加入5ml4℃预冷的0.2mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0，含25%甘油和0.1mol/LDTT)，在冰浴条件下迅速研磨成匀浆，将匀浆全部转移至离心管，在4℃条件下11250rpm下离心20min，取上清液，4℃条件下保存备用。[16]取2支试管，分别向其中加入0.45ml15μmol/LMgSO4溶液，0.15mL50μmol/mLATP，0.15ml1μmol/mLCoA和0.5ml上清液，一支试管中加入0.15μmol/mLp-香豆酸，另一支试管作为对照不加，在333nm处测定其吸光度值，以每分钟吸光度值变化0.01为1个4CL活力单位(U)酶活性表示为U/mgprotein。[17]重复测定3次。1.3.3二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)活性的测定称取1.0g甜樱桃果实，放入研钵中，加入液氮迅速研磨均匀，再加入5ml-20℃的丙酮，使其充分混匀，将混合液全部转移至离心管中，在4℃条件下，13000rpm离心20min，收集全部沉淀，沉淀用4ml混合溶液[0.1mol/L硼酸缓冲液(pH8.8),0.1gPVPP,5mmol/L抗坏血酸]溶解，收集全部溶液转移到离心管中。在4℃条件下，12000rpm离心20min，取上清液，4℃保存备用。取一支试管，向其中加入0.5ml上清液，0.6ml由1000mmol/LTris缓冲液（pH7.4）、1μmol/L的脱氢栎精、1μmol/LNADPH、0.5mol的酶提液、1单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以及6μmol/L的葡萄糖-6-磷酸组成的反应液，将试管在34℃水浴锅中保温1h，用1ml的乙酸乙酯提取3次，合并提取液，用0.2ml的蒸馏水抽提3次。乙酸乙酯部分用氮气吹干，然后加入2.5ml的正丁醇-盐酸（95:5，v/v）快速搅拌充分溶解，之后在水浴锅中34℃保温30min，测定溶液在波长550nm处的吸光度，酶活性表示为U/mgprotein[18]1.3.4花青素含量的测定称取2.0g甜樱桃果实，放入研钵中，加入少许经预冷的温度为4℃的1%HCl-甲醇溶液，在冰浴条件下迅速研磨成匀浆，将匀浆全部转入20ml刻度试管中。用1%HCl-甲醇溶液冲洗研钵，一并转移到试管中，定容至刻度，混合均匀，于4℃温度下避光提取20min,提取期间不断摇晃，过滤之后收集滤液，弃掉沉淀。以1%HCl-甲醇溶液作为空白参比调零，分别测定滤液在波长600nm、530nm处的吸光度值，重复三次。每克甜樱桃果实在波长530nm和600nm处吸光度值的差额是指甜樱桃果实的花青素含量。[15]1.3.5色度值和色调值的测定在甜樱桃果实的表面选择三个不同的点进行测量，可得到每个测定点的L*、a*、b*。色度值由（a*2+b*2)1/2计算所得，色调值由arctan(b*/a*)计算所得。[19]2实验结果与分析2.1热空气处理对甜樱桃果实PAL活性的影响苯丙氨酸解氨酶是连接初级代谢和苯丙烷类代谢第一步反应的酶，是关键酶和限速酶[20],也是合成花青素的首要关键酶。实验结果表明：经过热空气处理的实验组的PAL活性在第一天出现了上升，之后的4天里保持稳定，有轻微的下降。对照组的PAL活性在前三天都有明显的上升，在第四天和第五天保持稳定，有轻微的上升。两组之间相比较，第一天出现了较小的差距，第二天和第三天差距不断地拉大，在第四天和第五天两组都保持稳定，差距只有轻微的加大。所以，热空气处理对甜樱桃的PAL活性有很明显的抑制作用。图SEQ图\*ARABIC1甜樱桃果实中PAL活性变化Fig.1ChangesofPALactivityinsweetcherryfruit2.2热空气处理对甜樱桃果实4CL活性的影响4CL作用于苯丙烷代谢途径最后一步反应，以C4H酶的催化产物羟基香豆酸为底物，催化其生成相应的硫酯，[21]是甜樱桃果实酚类物质合成的控制关键。点。实验结果表明：经过热空气处理过的实验组的4CL活性第一天有所下降，之后保持平稳。对照组的4CL活性一直保持平稳，有轻微的上升。两组之间相比较，第一天出现较小的差距，之后差距维持平稳。所以，热空气处理明显降低4CL贮藏期的活性。图SEQ图\*ARABIC2甜樱桃果实4CL活性变化Fig.2Changesof4CLActivityinSweetCherryFruits2.3热空气处理对甜樱桃果实DFR活性的影响DFR以NADPH为辅因子，催化二氢黄酮醇在C4位发生立体特异的还原反应，将无色黄酮醇转化为无色花青素，是花青素合成过程中的关键酶。[22]实验结果表明：经过热空气处理的实验组的DFR活性第一天保持平稳，第二天和第三天有所上升，后两天在第三天的基础上保持平稳。对照组的DFR活性前三天在不断增长，后两天保持平稳，有轻微的下降。两组相对照，第一天产生差距，之后差距加大并保持几乎不变。所以，热空气处理有效的降低了甜樱桃果实在贮藏期的DFR的活性。图SEQ图\*ARABIC3甜樱桃果实DFR活性的变化Fig.3ChangesofDFRActivityinSweetCherryFruits2.4热空气处理对甜樱桃果实花青素含量的影响花青素是一类重要的天然色素物质，是植物的主要呈色物质之一，作为一种酚类物质，是甜樱桃果实发生酶促褐变的物质条件。实验结果表明：经过热空气处理的实验组的花青素含量每天都有较小的增长。对照组的花青素含量在第一天和后两天又轻微的增长，而在第二天和第三天增长迅速。两组相比较，第一天无明显差距，之后的四天里差距先增大后减小。所以，热空气处理使得甜樱桃果实花青素含量明显减少。图SEQ图\*ARABIC4甜樱桃果实花青素含量的变化Fig.4ChangesofAnthocyaninContentinSweetCherryFruits2.5热空气处理对甜樱桃果实色度值和色调值的影响色度值和色调值是果实褐变的最直接的体现。在色度值方面，热空气处理过的实验组始终高于对照组，第一天，热空气处理过的实验组稍微高于对照组，在之后的四天里，两组之间的数值差距越来越大，都呈下降趋势。在色调值方面，两组始终呈下降趋势，第一天两组没有区别，在第二天和第三天实验组明显高于对照组且差距不断增大，第四天和第五天差距保持不变。所以，热空气处理明显的减缓了甜樱桃果实的颜色变化，延缓褐变的发生。图SEQ图\*ARABIC5甜樱桃果实Chroma的变化Fig.5ChangesofChromainSweetCherryFruits图SEQ图\*ARABIC6甜樱桃果实hue的变化Fig.6Changesofhueinsweetcherryfruit结论综合以上指标的测定结果，可以看出，在整个贮藏期间，热空气处理有效的降低了甜樱桃果实苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）的活性，减少了花青素的积累，减缓了色度值和色调值的降低。本实验研究结果表明，热空气处理可减缓甜樱桃果实褐变的发生，其原因可能是通过抑制或破坏花青素生物合成途径的关键酶的活性来减少褐变底物花青素的含量，从而延长货架期和保持其营养价值。这为热空气处理在果蔬保鲜方面的商用提供理论支持，但在实际生产中需要结合不同的具体实际进行研究。近年来，物理方法保鲜果蔬正逐渐被研究者们重视，随着研究的深入，方法将会更加的简便和完整。参考文献蔡宇良,李珊,陈怡平,赵桂仿,付润民.不同甜樱桃品种果实主要内含物测试与分析[J].西北植物学报,2005(02):304-310.焦中高，刘杰超，王思新.甜樱桃采后生理与贮藏保鲜[J].果树学报，2003,206）：498~502兰士波.欧洲甜樱桃研究进展及开发利用前景[J].中国林副特产,2012(02):89-94.姚森.原花青素及在酶促褐变中的作用研究进展[J]饮料工业2016，16（5）64-68胡雅馨,李京,惠伯棣.蓝莓果实中主要营养及花青素成分的研究[J].食品科学,2006(10):600-603.王星，罗双霞，于萍，罗蕾，赵建军，王彦华，申书兴，陈雪平.茄科蔬菜苯丙烷类代谢及相关基因酶基因研究进展.[J]园艺学报2017,44（9）1738-1748孟霞，勒燕飞，王嘉智，张利，康英，朱欣伟.甜樱桃果实采后贮藏保鲜技术研究综述.[J]四川林业科技2017,38（5）128-147LURIES.Postharvestheattreatments[J].PostharvestBiologyandTechnology,1998,14:257-269.孔祥佳,林河通,郑俊峰,林艺芬,陈艺晖.热空气处理诱导冷藏橄榄果实抗冷性及其与膜脂代谢的关系[J].中国农业科学,2012,45(04):752-760.王静，茅林春，李学文，张辉，张明明，鞠国栋.热处理降低哈密瓜果实活性氧代谢减轻冷害[J]农业工程学报，2016（2）280-286陆振中,徐莉,王庆国.热空气处理对中华寿桃贮藏品质的影响[J].农业工程学报,2010,26(01):375-379.屠康,邵兴锋,赵艺泽.采后热空气处理对金冠苹果后熟衰老及病害的影响[J].果树学报2006，23（4）562~567曹明明，阎瑞香，冯叙桥，关文强.热处理对鲜切玫瑰香葡萄抗氧化活性及生理生化品质的影响[J]食品科学，2012(8)279-284王雷.不同激发子处理对甜樱桃果实采后青霉病的抑制作用及其机理研究[学位论文]2015-南京农业大学：食品科学与工程曹建康，姜微波，赵玉梅.果蔬采后生理生化实验指导.中国轻工业出版社.2007.9范存斐，毕阳，王云飞，任亚琳，杨志敏，王毅.水杨酸对厚皮甜瓜采后病害及苯丙烷代谢的影响[J]中国农业科学，2012(3)584-589.李云萍.紫心甘薯花色苷的积累与合成酶活性的关系研究[学位论文]2010-西南大学：植物学顾东东.甘薯茎尖色泽、脂溶性提取物抗氧化能力及其与β-胡萝卜素含量的关系[学术论文]2016-西南大学：遗传学刘佳.美洲南瓜苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因克隆、表达分析及品种抗灰霉病的研究[学术论文]2013-甘肃农行大学：