实验2：分离以尿素为氮源的微生物课件

实验2：分离以尿素为氮源的微生物尿素是蛋白质降解的产物，通常用作植物的氮肥。但是植物的根几乎不吸收尿素，尿素经微生物(脲酶)分解为氨,氨溶解于水中成为铵根离子而被植物吸收。一、基础知识1、尿素(脲)：大量尿素的存在会对环境造成污染，如土壤板结、肥料利用率下降、地下水污染等。例如：2、选择培养基：

添加或减少某种成分，以允许某种微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。培养基中缺乏有机碳源时可筛选出自养型微生物只以尿素为氮源的培养基可筛选出含脲酶的微生物一、基础知识3、玻璃砂漏斗：

玻璃砂(砂芯)漏斗有6种：

G1~G6(砂芯含有不同规格小孔)。G6孔径最小，细菌不能滤过。

若培养基中含有不能加热灭菌的化合物，如尿素(加热会

分解)等，只能用G6玻璃砂漏斗过滤来除去微生物。

玻璃砂漏斗用前也要进行高压蒸汽灭菌(121℃，15min)。

用后需用1mol/L的HCl浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液呈中性，干燥后保存。各种规格吸头各种规格移液器移液器的使用

根据取用溶液体积选用适当

的移液器操作方法：设定体积安装吸头吸液放液卸掉吸头从大值调整到小值时，逆时针旋转体积调节按纽到刚好即可。从小值调整到大值时，应顺时针先调至超过设定值后再回调。设定体积安装吸头将移液器顶端垂直插入吸头，再轻轻用力下压的同时，左右微微转动，上紧即可。切记用力不能过猛，选择与移液器匹配的吸头。吸液1、预洗吸头：吸取、排放样液2~3次，让吸头内壁形成一道

同质液膜，确保移液工作的精度和准度。一般液体，正向吸液(将按钮按到第一档释放吸液)粘稠液体和易挥发液体，反相吸液(将按钮直接按到第二档吸液)2、垂直吸液、慢吸慢放：吸头垂直浸入液面2-4mm。尽量避

免吸头浸入液面过深，以免液压对吸液的精确度造成影响。

吸液速度切记不能过快，以免导致液体吸入移液器内部。将移液枪提离液面需停约1~3秒，观察是否有液滴缓慢的流出。若有流出，说明有漏气现象。卸掉吸头

一般用力下按吸头脱卸按纽即可卸掉吸头。

将吸头丢弃到废物收集器中。

移液器如不使用，将刻度调到最大量程，使弹簧

恢复原形，延长移液器的使用寿命。（二）实验原理：

在土壤中，存在一些细菌，它们含有脲酶，能分解尿素(脲)作为其生长的氮源(NH3)1.利用尿素培养基(以尿素为惟一氮源的选择培养基)，分离出土壤中含脲酶的细菌。2CO32NH2OH+¾¾®¾+脲酶22)(ONH=C二、实验内容2.细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使PH升高，使酚红指示剂变红。为什么要设置全营养LB固体培养基？起对照作用。土壤中含有多种细菌，在全营养LB培养基中，多数细菌都能生长；而在仅以尿素为氮源的培养基中，只有含有脲酶的微生物才能生长。1、为什么用琼脂糖替代琼脂作为固化剂？酚红在此起什么作用？

琼脂是末被纯化的混合物，内含有一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。

酚红为酸碱指示剂，在酸性环境呈黄色，在碱性环境呈红色。通过酚红的颜色变化，可检测培养基中pH的变化。思考与练习：注意：取样时尽量只取悬液。称量—溶化—调PH—分装—加塞封口—包扎—灭菌二、实验内容（五）实验步骤：1、配制培养基并灭菌2、倒平板3、制备细菌悬液4、用涂布分离法分离细菌5、细菌培养6、观察、对比全营养LB固体培养基和尿素固体培养基(除尿素外)均进行高压蒸汽灭菌；尿素固体培养基待冷却到60℃，加入用G6玻璃漏斗过滤的尿素溶液。用10-4和10-5的土壤稀释液各浓度均做三个培养皿培养基倒置培养，37℃24~48h。实验组与对照组菌落数制成10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液用移液器取0.1ml土壤稀释液用涂布器涂布分离二、实验内容（六）实验结果：10-4、10-5土壤稀释液尿素培养基上涂布结果10-4、10-5土壤稀释液全营养LB培养基上涂布结果

这说明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占少数。因为人和其他哺乳动物产生的排泄物毕竟是少量的，且尿素还可以在高温下自然分解，因此，以尿素为氮源的菌群较少。4、与全营养培养基上的菌落数相比，为什么尿素培养基上只有少数菌落？思考与练习：2.有脲酶的细菌在生态系统稳定上起什么作用？3.有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？

土壤中大量尿素的存在会对环境造成污染，如土壤板结、肥料利用率下降、地下水污染等。有脲酶的细菌能分解尿素，并利用所形成的氨，有利于自然界中的氮循环。

有脲酶的细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素(中性)分解产生氨(碱性)，导致培养基中酚红指示剂变为