2026年生物医药研究员分子生物学实验技术实操技能考核题

2026年生物医药研究员分子生物学实验技术实操技能考核题一、选择题（每题2分，共20题）1.在进行PCR扩增时，引物退火温度的确定主要依据是（）。A.引物长度B.引物GC含量C.产物大小D.模板浓度答案：B解析：引物退火温度与GC含量密切相关，GC含量越高，Tm值越大，通常退火温度需相应提高。2.以下哪种方法最适合用于检测微量RNA样本的完整性？（）A.PCR扩增B.电泳分析C.蛋白质印迹D.原位杂交答案：B解析：RNA完整性检测常用琼脂糖凝胶电泳，通过观察18S和28SrRNA条带是否清晰可判断RNA质量。3.在进行WesternBlot实验时，封闭抗体常用的种类不包括（）。A.牛血清白蛋白（BSA）B.脱脂奶粉C.小鼠IgGD.绵羊抗兔IgG答案：D解析：D选项是二抗，封闭抗体应为BSA或脱脂奶粉等非特异性蛋白。4.下列哪种酶参与DNA复制起始？（）A.RNA聚合酶B.DNA聚合酶IIIC.DNA连接酶D.解旋酶答案：B解析：DNA聚合酶III是复制延长的主要酶，而其他酶参与不同阶段。5.在进行基因克隆时，连接酶最常用的类型是（）。A.T4DNA连接酶B.T7RNA连接酶C.E.coliDNA连接酶D.T3RNA连接酶答案：A解析：T4DNA连接酶具有高活性且能连接平末端或粘性末端，应用最广泛。6.琼脂糖凝胶电泳中，DNA条带跑动速度受以下因素影响，错误的是（）。A.琼脂糖浓度B.DNA分子大小C.电场强度D.染料种类答案：D解析：染料种类主要影响迁移速度但不改变电泳原理，其他选项均影响条带跑动。7.以下哪种方法可用于检测基因表达的可逆性？（）A.RT-PCRB.NorthernBlotC.原位杂交D.WesternBlot答案：C解析：原位杂交可检测细胞内mRNA定位及动态变化，其他方法多用于定量分析。8.在进行细胞培养时，Luria-Bertani（LB）培养基通常添加（）。A.酵母提取物和胰蛋白胨B.血清和双抗C.碳酸钙和琼脂D.乙酸盐和谷氨酰胺答案：A解析：LB培养基是通用型培养液，含酵母提取物和胰蛋白胨，不含特殊添加剂。9.CRISPR-Cas9系统中，向导RNA（gRNA）的作用是（）。A.切割DNAB.识别靶向序列C.修复断裂位点D.增强转录活性答案：B解析：gRNA与靶向DNA结合，引导Cas9酶精准切割。10.在进行qPCR实验时，内参基因的选择原则不包括（）。A.表达稳定B.参与核心代谢C.质量控制严格D.易于扩增答案：B解析：内参基因应表达稳定且不受实验条件影响，核心代谢基因可能波动较大。二、填空题（每空1分，共10空）1.PCR反应体系中，dNTPs通常以______摩尔浓度添加，以避免竞争性抑制。答案：等量解析：dNTPs需均衡添加，过高或过低均影响扩增效率。2.WesternBlot中，一抗通常为______抗体，二抗需与一抗的靶标物种相匹配。答案：特异性解析：一抗需特异性识别目标蛋白，二抗需识别一抗物种（如羊抗鼠IgG）。3.RNA干扰（RNAi）的核心机制是通过______降解靶向mRNA。答案：RNA酶H解析：siRNA被RISC识别后，RNA酶H降解互补mRNA。4.细胞培养过程中，CO2培养箱的pH值主要通过______调节。答案：CO2浓度解析：CO2溶于水形成碳酸，影响培养基pH。5.基因芯片的检测原理基于______杂交技术，可同时检测成百上千个基因。答案：核酸解析：基因芯片通过探针与目标核酸杂交进行表达谱分析。6.质粒载体通常含有______和复制起点（ori），以确保在宿主细胞中稳定复制。答案：抗性基因解析：抗性基因用于筛选转化成功细胞，ori保证质粒扩增。7.原核表达系统中，常用______作为启动子，驱动外源基因高效表达。答案：T7RNA聚合酶解析：T7启动子由T7RNA聚合酶驱动，表达量高且特异性强。8.真核表达系统中，转录终止主要依赖______结构，在多聚腺苷酸化位点下游形成。答案：多聚胸苷酸解析：Poly(A)信号与RNA聚合酶解离相关，促进转录终止。9.流式细胞术通过______检测细胞，可分析细胞数量、大小及荧光标记物。答案：激光散射和荧光解析：激光散射反映细胞物理特性，荧光检测分子表达水平。10.限制性内切酶识别的识别序列通常具有______对称性，切割后形成粘性或平末端。答案：回文解析：回文序列在正反链上互补，如EcoRI识别GAATTC。三、简答题（每题5分，共5题）1.简述PCR反应体系中dNTPs的作用及其优化原则。答案：dNTPs是PCR合成DNA的原料，需以等摩尔浓度添加（约200μM），过高会导致非特异性扩增，过低则抑制延伸。优化时应考虑模板浓度、退火温度等因素，避免过量或不足。2.比较qPCR和传统PCR在检测灵敏度和定量方面的差异。答案：qPCR通过实时监测荧光信号实现定量检测，灵敏度高，可检测ng级RNA；传统PCR为终点检测，仅判断扩增是否发生，无法定量。qPCR适用于表达分析，传统PCR适用于基因存在性验证。3.简述WesternBlot实验中封闭步骤的原理和注意事项。答案：封闭步骤通过非特异性蛋白（如BSA）占据抗体结合位点，避免假阳性。注意事项包括封闭时间（4-12h）、温度（室温或4℃）、封闭剂浓度（无血清培养基效果更佳）。4.解释CRISPR-Cas9系统中，gRNA设计的关键要素。答案：gRNA设计需考虑靶向序列的Tm值（60-80℃）、避免PAM序列邻近、避免脱靶效应（如发夹结构）。优先选择无同源的内源基因序列，确保精准切割。5.简述RNA干扰（RNAi）的生物学机制及其应用场景。答案：RNAi通过siRNA（约21nt）触发mRNA降解，抑制基因表达。机制包括siRNA加载RISC，RNA酶H降解靶mRNA。应用场景包括基因功能验证、疾病治疗（siRNA药物）。四、实验设计题（每题10分，共2题）1.设计一个实验方案，验证某基因在细胞应激条件下的表达变化。答案：实验步骤：（1）用H2O2处理细胞（应激组），设未处理组（对照组）；（2）提取总RNA，用TRIzol法裂解；（3）反转录为cDNA，用qPCR检测目标基因表达（设GAPDH为内参）；（4）分析应激组与对照组的相对表达倍数变化。关键点：-细胞同步化（传代时间固定）；-RNA纯度检测（A260/A280）；-重复实验（至少3次）。2.设计一个基因敲除实验，验证某基因的功能缺失表型。答案：实验步骤：（1）设计sgRNA和敲除载体（含筛选标记如Neo）；（2）转染细胞，筛选G418抗性克隆；（3）PCR验证基因敲除（如长片段PCR检测缺失）；（4）观察表型变化（如细胞形态、功能实验）。关键点：-对照实验（空载体转染）；-同源重组效率（测序验证）；-表型分析标准化（图像采集、统计分析）。五、计算题（每题5分，共2题）1.某qPCR实验中，目标基因Ct值从对照组10.5下降至处理组8.5，计算相对表达倍数。答案：相对表达=2^(-ΔCt)，ΔCt=10.5-8.5=2，相对表达=2^(-2)=0.25（即处理组表达降低4倍）。2.已知限制性内切酶EcoRI识别序列为GAATTC，其Tm值为37℃。若退火温度设为55℃，计算该酶的最优识别位点。答案：EcoRI识别序列对称，最佳退火温度应覆盖两端序列Tm值范围。假设两端序列Tm差异不大，最优位点为中间位置（如G...AATTC...C），确保退火平衡。六、论述题（每题10分，共2题）1.论述基因编辑技术CRISPR-Cas9在生物医药研究中的优势与局限性。答案：优势：-高效（单细胞水平编辑）；-易设计（gRNA快速合成）；-成本低（较传统方法）；-可修正基因缺陷。局限性：-脱靶效应（非靶向切割）；-