《牛结核分枝杆菌抗体荧光偏振检测方法 》征求意见稿

ICS11.220

B41

团体标准

T/CVMAXXXXX—XXXX

牛结核分枝杆菌抗体荧光偏振检测方法

FluorescencepolarizationdetectionofantibodiesagainstMycobacteriumbovis

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX--XX实施

中国兽医协会发布

XX/TXXXXX—XXXX

牛结核分枝杆菌抗体荧光偏振检测方法

1范围

本标准规定了牛结核病荧光偏振试验技术要求：试验原理、试剂和材料、仪器设备、样品的采集和

保存、操作方法和结果判定。

本标准适用于实验室对牛结核病血清样本的检疫、筛查和监控。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3生物安全措施

为了保护实验室人员的安全，应由经过生物安全培训的工作人员进行牛结核分枝杆菌病的检测，应

当采取预防气溶胶感染的生物措施。所有废弃物应按照GB19489中的有关规定处置。

4试验原理

溶液中的分子作随机转动。分子的大小是影响转动效率的主要因素，与其成反比关系。因而小分子

较大分子转动得快。如果给分子标记上荧光色素，通过68.5°角度的转动时间即可通过测量水平和垂直

的偏振光强度来确定。因而，大分子比转动快的小分子发射更多的偏振光。

诊断牛结核病时，将与牛结合分枝杆菌MPB70、MPB83、ESAT-6蛋白表位区域氨基酸序列相同的肽缀

合物，标记上异硫氰荧光素（FITC）,作为抗原。当加到待检血清中，若有抗体与标记抗原结合，就会

降低其转动速度。用荧光偏振仪器测定出偏振值，通过偏振值变化情况判定样品的阴、阳性。

5试剂和材料

5.1阳性对照：牛结核分枝杆菌荧光偏振商品化试剂。

5.2阴性对照：牛结核分枝杆菌荧光偏振商品化试剂。

5.325×浓缩的反应缓冲液：牛结核分枝杆菌荧光偏振商品化试剂。

5.4结合物：标记有异硫氰荧光素结核分枝杆菌表面抗原MP70多肽缀合物，牛结核分枝杆菌荧光偏振

商品化试剂。

1

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5.596孔黑色平板微孔板

5.6除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682规定的三级水。

6仪器和设备

6.1荧光偏振仪。

6.2微量板振荡器。

6.3微量移液器（10µL、20µL、100µL、200µL、1000µL）及配套吸头（无核酸酶）。

6.4冰箱（2℃～8℃和-20℃两种）

6.5温箱：温度范围应满足16℃～26℃。

6被检样品

被检样品为牛的血清样品。在未处理的试管或血清分离管中无菌采集血液。允许血液凝结并分离血

清。避免使用严重溶血或受污染的血清。新鲜血清应用穿刺取得。将血清于2℃～8℃保存7天，或在-20℃

冷冻4个月，避免反复冻融。在试验前，冷冻样品应完全解冻并混合良好

7操作方法

8.1将试剂盒和样品恢复至室温（16℃～26℃）。

8.2将25×浓缩反应缓冲液用蒸馏水作1：25稀释。制备稀释的反应缓冲液应避免有颗粒物，配置后的

溶液放置室温保存，并在1个月内使用。

8.3分别取20µL阴性对照加入微孔板A1、B1、C1孔中，取20µL阳性对照加入微孔板D1孔中。取20µL待

检血清样品加入微孔板内其余相应孔中。向微量板加样或加液体时应避免气泡产生。

8.4取180µL稀释的反应缓冲液加入到微孔板的每个反应孔中，置振荡器上中速振荡2min。

8.5将反应板置室温（16℃～26℃）。孵育3min～5min后，置荧光偏振仪（激发波长485nm，发射波长

528nm）上读取缓冲液和样品的初始值，作为空白偏振值。

8.6取10µL结合物加入到每个反应孔中，置振荡器上中速振荡2min。

8.7将反应板置室温（16℃～26℃）孵育2min～3min，置荧光偏振仪上读取最终偏振值。

8结果判定

对照或样品对的偏振值计算见式（1）：

FP=A-B

式中：

FP———对照或样品的偏振值，mP；

A——对照或样品的最终偏振值，mP；

B——对照或样品的初始偏振值，mP。

当阳性对照的偏振值在120mP～250mP之间，阴性对照的偏振值在70mP～90mP之间时，方可进行被检

样品的结果判定。若阳性对照或阴性对照的偏振值超过规定的范围，需要根据仪器手册的说明书重新校

正仪器。

2

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结果判定计算公式（2）：

△=FP-C

式中：

△———样品的偏振值与阴性对照平均值的差值，mP；

FP——对照或样品的偏振值，mP；

C——阴性对照平均偏振值，mP。

当被检样品△＜10mP，样品判为阴性；10mP≤△≤20mP，样品判为可疑；△﹥20mP，样品判为

阳性。

阳性和可疑样品应必须重新检测两次。如果两次重检的结果△均小于10mP，则样品判为阴性；若

两次重检中有任何一次样品的在阳性值范围，则样品判为阳性。

A

3

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前  言

本标准按GB/T1.1-2010给出的规则起草。

本标准由中国兽医协会提出并归口。

本标准起草单位：上海市动物疫病预防控制中心、北京融通鑫业科技有限公司。

本标准主要起草人：于慧茹、赵洪进、王建、杨显超、赵保亮、陶田谷晟、杨德全、鞠厚斌、李

鑫、沈海潇、葛菲菲、白艺兰。

I

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牛结核分枝杆菌抗体荧光偏振检测方法

1范围

本标准规定了牛结核病荧光偏振试验技术要求：试验原理、试剂和材料、仪器设备、样品的采集和

保存、操作方法和结果判定。

本标准适用于实验室对牛结核病血清样本的检疫、筛查和监控。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3生物安全措施

为了保护实验室人员的安全，应由经过生物安全培训的工作人员进行牛结核分枝杆菌病的检测，应

当采取预防气溶胶感染的生物措施。所有废弃物应按照GB19489中的有关规定处置。

4试验原理

溶液中的分子作随机转动。分子的大小是影响转动效率的主要因素，与其成反比关系。因而小分子

较大分子转动得快。如果给分子标记上荧光色素，通过68.5°角度的转动时间即可通过测量水平和垂直

的偏振光强度来确定。因而，大分子比转动快的小分子发射更多的偏振光。

诊断牛结核病时，将与牛结合分枝杆菌MPB70、MPB83、ESAT-6蛋白表位区域氨基酸序列相同的肽缀

合物，标记上异硫氰荧光素（FITC）,作为抗原。当加到待检血清中，若有抗体与标记抗原结合，就会

降低其转动速度。用荧光偏振仪器测定出偏振值，通过偏振值变化情况判定样品的阴、阳性。

5试剂和材料

5.1阳性对照：牛结核分枝杆菌荧光偏振商品化试剂。

5.2阴性对照：牛结核分枝杆菌荧光偏振商品化试剂。

5.325×浓缩的反应缓冲液：牛结核分枝杆菌荧光偏振商品化试剂。

5.4结合物：标记有异硫氰荧光素结核分枝杆菌表面抗原MP70多肽缀合物，牛结核分枝杆菌荧光偏振

商品化试剂。

1

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5.596孔黑色平板微孔板

5.6除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682规定的三级水。

6仪器和设备

6.1荧光偏振仪。

6.2微量板振荡器。

6.3微量移液器（10µL、20µL、100µL、200µL、1000µL）及配套吸头（无核酸酶）。

6.4冰箱（2℃～8℃和-20℃两种）

6.5温箱：温度范围应满足16℃～26℃。

6被检样品

被检样品为牛的血清样品。在未处理的试管或血清分离管中无菌采集血液。允许血液凝结并分离血

清。避免使用严重溶血或受污染的血清。新鲜血清应用穿刺取得。将血清于2℃～8℃保存7天，或在-20℃

冷冻4个月，避免反复冻融。在试验前，冷冻样品应完全解冻并混合良好

7操作方法

8.1将试剂盒和样品恢复至室温（16℃～26℃）。

8.2将25×浓缩反应缓冲液用蒸馏水作1：25稀释。制备稀释的反应缓冲液应避免有颗粒物，配置后的

溶液放置室温保存，并在1个月内使用。

8.3分别取20µL阴性对照加入微孔板A1、B1、C1孔中，取20µL阳性对照加入微孔板D1孔中。取20µL待

检血清样品加入微孔板内其余相应孔中。向微量板加样或加液体时应避免气泡产生。

8.4取180µL稀释的反应缓冲液加入到微孔板的每个反应孔中，置振荡器上中速振荡2min。

8.5将反应板置室温（16℃～26℃）。孵育3min～5min后，置荧光偏振仪（激发波长485nm，发射波长

528nm）上读取缓冲液和样品的初始值，作为空白偏振值。

8.6取10µL结合物加入到每个反应孔中，置振荡器上中速振荡2min。

8.7将反应板置室温（16℃～26℃）孵育2min～3min，置荧光偏振仪上读取最终偏振值。

8结果判定

对照或样品对的偏振值计算见式（1）：