2025年pcr上岗考试题及答案

2025年pcr上岗考试题及答案一、单项选择题（每题2分，共30分）1.聚合酶链式反应（PCR）的基本原理模仿的是以下哪种生物学过程？A.DNA损伤修复B.基因转录C.DNA半保留复制D.蛋白质翻译答案：C2.设计PCR引物时，若目标基因GC含量为65%，引物的Tm值宜控制在？A.50-55℃B.55-60℃C.60-65℃D.65-70℃答案：C（引物Tm值通常比模板GC含量低5-10℃，且需保证引物与模板特异性结合）3.TaqDNA聚合酶的最适反应温度是？A.55℃B.72℃C.95℃D.60℃答案：B（Taq酶在72℃时活性最高，此时延伸效率最佳）4.荧光定量PCR扩增曲线的“指数期”对应的是？A.荧光信号刚超过基线的阶段B.荧光信号与模板浓度呈对数关系的阶段C.酶活性开始下降的阶段D.产物积累达到平台的阶段答案：B（指数期是PCR产物呈指数增长的时期，此时荧光信号与初始模板量线性相关）5.以下哪项是PCR实验室最主要的物理污染防控措施？A.使用高压灭菌锅处理废弃物B.设置独立的试剂准备区、样本处理区、扩增区C.定期更换实验服D.采用紫外灯照射工作台答案：B（分区操作是防止不同阶段产物交叉污染的核心措施）6.内参基因在PCR检测中的主要作用是？A.提高目标基因扩增效率B.校正样本处理及扩增过程中的误差C.增加荧光信号强度D.验证引物特异性答案：B（内参基因用于评估样本质量和反应体系的稳定性，减少实验误差）7.熔解曲线分析中，若出现两个峰值，最可能的原因是？A.引物二聚体形成B.模板浓度过高C.退火温度过低D.探针标记错误答案：A（引物二聚体与目标产物的Tm值不同，会导致熔解曲线出现双峰）8.PCR反应中模板变性的典型温度和时间是？A.95℃30秒B.72℃1分钟C.55℃30秒D.60℃1分钟答案：A（双链DNA在95℃下30秒可充分解链为单链）9.以下哪种荧光探针依赖于Taq酶的5'→3'外切酶活性？A.SYBRGreenIB.TaqMan探针C.分子信标D.荧光引物答案：B（TaqMan探针在扩增时被Taq酶切割，释放荧光基团）10.临床PCR检测中，若阳性对照Ct值明显高于预期，最可能的原因是？A.引物浓度过高B.阳性对照模板降解C.退火温度过低D.扩增循环数不足答案：B（模板降解会导致有效模板量减少，Ct值升高）11.进行RNA的RT-PCR时，需特别注意避免以下哪种酶的干扰？A.DNA酶B.蛋白酶C.RNA酶D.连接酶答案：C（RNA酶广泛存在且稳定，易导致RNA模板降解）12.以下哪种情况不属于PCR实验室生物安全范畴？A.样本中含传染性病原体B.扩增产物气溶胶污染C.试剂泄漏后的化学处理D.实验人员未佩戴手套答案：C（化学处理属于实验室安全，但非生物安全核心）13.定量PCR中“基线”的设定通常是？A.前1-3个循环的荧光信号均值B.指数期起始点的荧光信号C.平台期前的荧光信号均值D.前15-20个循环的荧光信号均值答案：D（基线一般取扩增早期未进入指数期的荧光信号均值，通常为前15-20个循环）14.引物设计时，避免3'端互补的主要目的是？A.减少引物二聚体形成B.提高Tm值C.增加与模板的结合力D.降低GC含量答案：A（3'端互补易导致引物相互结合形成二聚体）15.判定PCR结果为“阴性”时，需同时满足？A.无扩增曲线且阴性对照无信号B.扩增曲线Ct值>35且内参Ct值正常C.扩增曲线呈S型且Ct值<30D.熔解曲线单峰且阳性对照Ct值正常答案：B（临床检测中通常设定Ct值>35为阴性，同时需内参正常以排除样本质量问题）二、多项选择题（每题3分，共30分，至少2个正确选项）1.PCR反应体系的基本组成包括？A.模板DNAB.引物C.dNTPD.TaqDNA聚合酶E.荧光染料答案：ABCD（荧光染料为定量PCR额外添加，非基本体系必需）2.引物设计的基本原则包括？A.长度18-25bpB.GC含量40-60%C.3'端避免连续G/CD.引物间避免互补E.必须包含限制性酶切位点答案：ABCD（限制性酶切位点非必需，仅克隆实验需要）3.PCR实验室可能的污染来源有？A.扩增产物气溶胶B.样本间交叉污染C.试剂中残留的DNAD.实验人员体表携带的DNAE.实验室空调系统气流答案：ABCDE（所有可能导致外源DNA进入反应体系的途径均为污染来源）4.荧光定量PCR的质量控制指标包括？A.阳性对照Ct值范围B.阴性对照无扩增C.标准曲线斜率（-3.1~-3.6）D.内参基因Ct值变异系数E.扩增效率（90%-110%）答案：ABCDE（以上均为评估实验可靠性的关键指标）5.以下哪些情况会导致PCR产物电泳条带弱或无条带？A.模板浓度过低B.引物退火温度过高C.Taq酶失活D.dNTP浓度过高E.循环数不足答案：ABCE（dNTP浓度过高可能抑制反应，但通常不会导致条带完全消失）6.荧光定量PCR可应用于？A.病原体载量检测B.基因表达差异分析C.基因突变检测D.蛋白质浓度测定E.染色体核型分析答案：ABC（定量PCR用于核酸检测，无法直接检测蛋白质或染色体形态）7.提取RNA作为PCR模板时，需采取的措施有？A.使用DEPC水处理实验器材B.在冰上操作C.添加RNA酶抑制剂D.延长变性时间至5分钟E.用75%乙醇洗涤沉淀答案：ABCE（RNA提取需严格抑制RNA酶，变性时间通常为1-2分钟，过长可能导致降解）8.PCR实验室分区应满足？A.试剂准备区→样本处理区→扩增区单向流动B.各区物品严格专用C.样本处理区需生物安全柜D.扩增区可使用紫外灯消毒E.各区压力梯度为正压→常压→负压答案：ABCD（压力梯度通常为试剂准备区正压，样本处理区常压，扩增区负压，防止气溶胶扩散）9.TaqMan探针的特点包括？A.5'端标记报告荧光基团B.3'端标记淬灭基团C.与模板完全互补D.扩增时被引物替代E.荧光信号随扩增循环递增答案：ABCE（TaqMan探针与模板特异性结合，扩增时被Taq酶切割，报告基团与淬灭基团分离，荧光信号累积）10.PCR扩增失败的可能原因有？A.模板中含有PCR抑制物（如血红蛋白）B.引物与模板错配C.Mg²+浓度过低D.热循环仪温度不准确E.反应体积过大答案：ABCDE（以上均可能导致扩增效率降低或完全失败）三、判断题（每题1分，共10分，正确填“√”，错误填“×”）1.PCR产物电泳出现多条非特异性条带，一定是引物设计不当导致的。（）答案：×（可能原因包括退火温度过低、模板不纯、酶量过高等）2.UNG酶（尿嘧啶糖基化酶）可降解含dUTP的PCR产物，但不能降解天然DNA。（）答案：√（UNG酶特异性识别尿嘧啶，用于防止扩增产物污染）3.荧光定量PCR无需电泳即可对产物进行定性和定量分析。（）答案：√（通过荧光信号和Ct值可直接判断结果）4.内参基因只需在实验样本中表达，无需在所有组织中稳定表达。（）答案：×（内参基因需在不同样本中稳定表达，用于校正误差）5.PCR变性温度越高（如100℃），模板解链越彻底，扩增效率越高。（）答案：×（过高温度会导致Taq酶失活，影响扩增）6.实验室出现污染后，只需更换新的PCR试剂即可消除污染。（）答案：×（需同时进行环境消毒、设备清洁及流程排查）7.RNA提取时，使用普通蒸馏水不会影响实验结果。（）答案：×（普通蒸馏水含RNA酶，会降解RNA模板）8.引物二聚体的存在会导致定量PCR的Ct值偏低（提前出现）。（）答案：√（二聚体扩增会消耗dNTP和引物，导致目标产物Ct值异常）9.熔解曲线呈单峰，说明PCR产物为单一特异性片段。（）答案：×（可能存在不同片段但Tm值相近的情况，需结合电泳验证）10.临床PCR结果判读时，只需观察样本的Ct值即可，无需关注阴阳性对照。（）答案：×（必须通过对照验证实验体系的有效性）四、简答题（每题6分，共30分）1.简述PCR反应体系的主要成分及其作用。答案：主要成分包括：①模板DNA/RNA（提供扩增的起始序列）；②引物（引导DNA聚合酶结合，决定扩增特异性）；③dNTP（脱氧核苷酸，作为合成新链的原料）；④TaqDNA聚合酶（催化dNTP沿模板链延伸）；⑤缓冲液（维持反应体系pH，含Mg²+作为酶激活剂）；⑥Mg²+（影响酶活性和引物退火效率）。2.引物设计的基本原则有哪些？答案：①长度18-25bp（过短特异性差，过长扩增效率低）；②GC含量40-60%（避免过高导致非特异性结合或过低导致Tm值不足）；③Tm值55-65℃（上下游引物Tm值差异≤2℃）；④3'端避免连续G/C（防止错配）及互补（防止二聚体）；⑤避免内部二级结构（如发夹结构）；⑥特异性（通过BLAST比对确保无同源序列）。3.列举PCR实验室常见的污染来源及预防措施。答案：污染来源：①扩增产物气溶胶（最主要）；②样本间交叉污染（如加样时飞溅）；③试剂污染（如水、dNTP中残留DNA）；④实验人员携带（如皮肤脱落细胞）。预防措施：①分区操作（试剂准备区、样本处理区、扩增区严格分开）；②使用专用器材（各区物品不混用）；③设置阳性对照和阴性对照；④使用UNG酶+dUTP体系（降解前次扩增产物）；⑤定期紫外消毒（30分钟以上）；⑥规范操作（如使用带滤芯枪头，避免反复开盖）。4.荧光定量PCR中Ct值的定义是什么？其临床意义有哪些？答案：Ct值（循环阈值）是指荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。临床意义：①定量依据（Ct值与初始模板量的对数呈反比，通过标准曲线可计算模板浓度）；②判断阴阳性（设定Ct值cutoff值，如Ct>35为阴性）；③评估样本质量（若内参Ct值异常，提示样本降解或抑制物存在）；④监测疗效（如抗病毒治疗中病原体载量的动态变化）。5.扩增曲线出现“平台期不明显”的异常现象，可能的原因及处理方法有哪些？答案：可能原因：①模板浓度过低（扩增未达到平台期）；②dNTP或引物耗尽（浓度不足）；③Taq酶活性下降（保存不当或反应时间过长）；④热循环仪温度不准确（延伸温度过低导致合成效率低）；⑤反应体积过大（热量传递不均）。处理方法：①增加模板量或浓缩样本；②优化反应体系（提高dNTP/引物浓度）；③更换新鲜酶或调整酶量；④校准热循环仪温度；⑤减少反应体积（如20μl改为15μl）。五、案例分析题（20分）某医院PCR实验室检测新冠病毒核酸时，出现以下情况：阳性对照Ct=28（预期25±2）阴性对照无扩增曲线3份临床样本中，2份Ct=32，1份无扩增曲线但内参Ct=24（正常范围22-26）问题：1.阳性对照Ct值偏高的可能原因是什么？2.无扩增曲线的样本是否可直接判为阴性？为什么？3.针对上述情况，应采取哪些改进措施？答案：1.阳性对照Ct值偏高的可能原因：①阳性对照模板降解（保存不当或反复冻融）；②加样误差（实际加入的模板量少于标准量）；③反应体系成分失效（如Taq酶活性下降、引物/探针降解）；④热循环仪温度偏差（退火/延伸温度过高导致扩增效率降低）。2.不可直接判为阴性。该样本内参Ct值正