猫脓皮症致病菌分离鉴定与药敏试验

-PAGEI--PAGEII-猫脓皮症致病菌分离鉴定与药敏试验摘要为明确引发猫脓皮病的病原菌，本试验从患病猫体表病灶溃烂处分离获得1株致病性的优势菌，通过分离纯化、革兰氏染色镜检、生化鉴定进行细菌种类分析。染色镜检结果显示分离出来的菌落形态为湿润光滑、圆形隆起、形似葡萄串样的阳性菌。生化鉴定为伪中间型葡萄球菌。进行药敏纸片扩散法检测12种抗菌药物的敏感性，药敏试验结果表明，对阿米卡星、庆大霉素、万古霉素、利福平高度敏感，其中以利福平和阿米卡星的抑菌效果最为显著。对头孢唑林、克林霉素、环丙沙星中敏。对氨苄西林、阿莫西林、青霉素、红霉素、多西环素耐药，可用于临床。关键词：猫脓皮病、病原鉴定、药敏试验-PAGEIII-TheSubjectofUndergraduateGraduationProjectAbstractToidentifythepathogenicbacteriacausingfelinepyoderma,adominantpathogenicstrainwasisolatedfromtheulceratedlesionontheskinofanaffectedcatinthisexperiment.Thebacterialspecieswasanalyzedthroughisolationandpurification,Gramstainingmicroscopy,andbiochemicalidentification.Themicroscopicexaminationofthestainedsamplerevealedthattheisolatedcoloniesweremoist,smooth,round,andraised,resemblingastringofgrapes,andwereGram-positive.BiochemicalidentificationconfirmeditasStaphylococcuspseudintermedius.Thesensitivityto12kindsofantibioticswastestedbythediskdiffusionmethod.Theresultsofthedrugsensitivitytestshowedthatitwashighlysensitivetoamikacin,gentamicin,vancomycin,andrifampicin,amongwhichrifampicinandamikacinhadthemostsignificantinhibitoryeffects.Itwasmoderatelysensitivetocefazolin,clindamycin,andciprofloxacin.Itwasresistanttoampicillin,amoxicillin,penicillin,erythromycin,anddoxycycline,whichcanbeusedinclinicalpractice.KeyWords：catpyoderma;pathogenidentification;drugresistance–PAGE6–目录TOC\o"1-3"\h\u14798摘要 I4776Abstract II122051绪论 1268302材料与方法 1143442.1试验材料 163882.1.1试验动物 138622.1.2试剂 151072.1.3设备 1311662.1.4培养基 1114342.2试验方法 1252682.2.1培养基的制备 184732.2.2取样、菌种培养 275632.2.3细菌分离与纯化 2137582.2.4革兰氏染色与镜检 2264272.2.5生化鉴定 2154762.2.5动物致病性试验 2143132.2.6药敏试验 2275483结果与分析 4225233.1细菌分离培养与染色观察 4203273.2生化鉴定结果 4314183.3动物致病性试验结果 5118833.4药敏试验结果 5294554讨论 717389结论 831521参考文献 91422致谢 11–PAGE6–1绪论猫脓皮病又称作猫细菌性毛囊炎，是由化脓性病原菌感染引起的皮肤化脓性炎症性疾病，临床以毛囊炎、脓疱形成和表皮脱落为主要病理特征REF_Ref21648\r\h[1]REF_Ref21648\r\h。根据病变的深度，临床上将脓皮症分为浅表性和深部脓皮病两种类型，浅表性脓皮症主要影响表皮和毛囊，而深部脓皮症则可侵及真皮层并造成疖病。患猫表皮会出现脓疱，伴随脱毛、瘙痒、红肿和溃烂等症状REF_Ref13083\r\h[2]，不仅影响了猫的生活质量，而且在严重情况下，致病菌能侵入血液大量增殖导致菌血症的发生，从而对猫的健康构成极大威胁。伪中间型葡萄球菌是猫脓皮症最主要的致病菌。它是2005年由Derieses等发现并命名的革兰氏阳性球菌，直径约0.5~1.5μm，常呈葡萄串状排列，无芽孢、无鞭毛REF_Ref13994\r\h[3]。伪中间型葡萄球菌不仅能引起多种动物的感染，最新研究发现还可由人与动物的接触而造成人的感染。伪中间型葡萄球菌主要定值于动物的皮肤及黏膜表面，为其皮肤的正常菌群成员，但也可作为机会致病菌引发脓皮病REF_Ref14131\r\h[4]。原发性因素较少见，多为免疫力低下，其主要继发性因素包括外伤性皮肤损伤、皮肤不洁、体外寄生虫感染、过敏、内分泌失调等REF_Ref14308\r\h[5]。目前，国内外对猫脓皮症致病机制和诊疗方案的研究正在持续深入中。国内研究多集中于药敏试验和流行病学调查，由张海霞带领的团队通过研究宠物源耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌，提醒如今多重耐药性问题日益突出REF_Ref14605\r\h[6]；由赵红利团队分离的鸭源伪中间型葡萄球菌其宿主范围已扩大至禽类，流行性不容忽视REF_Ref14621\r\h[7]。欧美学者近年来关注新型抗菌材料在发病中的作用，并积极探索噬菌体疗法等新型治疗手段，如BatesGM团队发现使用纳米银颗粒结合载体对耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌有抑菌作用REF_Ref15869\r\h[8]；SáMC团队使用伪中间型葡萄球菌噬菌体成功治疗犬脓皮病REF_Ref15901\r\h[9]。如今，快速诊断技术研发和个体化治疗策略逐渐成为学术界研究热点，为改善疾病预后提供新方向。本研究以患脓皮症猫皮肤化脓物为试验对象，通过对分泌物的致病菌分离鉴定，进行数据分析，得到致病菌的种类，通过药敏试验对头孢菌素类、青霉素类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类等多类药物的敏感程度筛选，获得致病菌最敏感药物。由于目前对猫脓皮症的致病菌研究较少，极易造成盲目用药，致使致病菌耐药性增加。本试验通过对猫脓皮症致病菌进行药敏试验并筛选出敏感药物，获取的数据可为临床用药提供参考。2材料与方法2.1试验材料2.1.1试验动物学校畜牧场1只脓皮症患猫，16只6周龄健康小白鼠。2.1.2试剂革兰氏染液（杭州微生物试剂有限公司）、细菌微量生化反应管（北京天根生化科技有限公司）、药敏纸片（北京陆桥生物技术有限责任公司）。2.1.3设备电子秤、显微镜、高压灭菌锅、微量移液枪、超净工作台、恒温培养箱、接种环、培养皿等。2.1.4培养基营养肉汤培养基、伊红美蓝培养基、5%绵羊血培养基、BP培养基。2.2试验方法2.2.1培养基的制备营养肉汤培养基：用电子秤精准称取蛋白胨10.0g、牛肉浸粉3.0g、氯化钠5.0g。将上述各部分倒入1000mL蒸馏水中，加热用玻璃棒搅拌直至完全溶解，使用稀盐酸和碳酸氢钠将pH值调到7.2±0.2，分装后在121℃高压灭菌锅灭菌15min。无菌测试后放入4℃冰箱冷藏保存。伊红美蓝培养基：用电子秤精准称取蛋白胨10.0g、乳糖10.0g、磷酸氢二钾2.0g、琼脂25.0g，溶于1000mL蒸馏水中，加热溶解后调节pH值至7.2±0.2，121℃高压灭菌锅灭菌15min后加入灭菌的2%伊红液和0.5%美蓝液13mL，充分混匀，防止产生气泡。待培养基自然冷却至50℃后倒至平板，无菌测试后放入4℃冰箱冷藏保存。5%绵羊血琼脂培养基：用电子秤精准称取蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g。将上述各部分倒入1000mL蒸馏水中，加热并用玻璃棒搅拌至完全溶解，使用1mol/L氢氧化钠和盐酸溶液将pH值调至7.2±0.2，分装后在121℃高压灭菌锅灭菌15min。待培养基自然冷却至50℃时，于无菌操作台中按体积比5%加入无菌脱纤维绵羊血50mL，缓慢摇匀后倾注至灭菌平板。经37℃培养24h后，若平板表面无杂菌污染即判定为合格，置于4℃冰箱避光保存备用。BP培养基：用电子秤精准称量蛋白胨10.0g、牛肉浸粉10g、酵母浸粉10.0g、丙酮酸钠10.0g、甘氨酸12.0g、氯化锂5.0g、琼脂20.0g溶解于950mL蒸馏水中，加热后调节pH值至7.2±0.2，121℃高压灭菌锅灭菌15min后自然冷却至50℃，无菌条件下分装到每95ml加入1%亚碲酸钾溶液1mL和5mL蛋黄增菌液，轻轻摇匀避免气泡产生。倒入无菌培养皿。凝固后放入4℃℃冰箱避光冷藏保存。2.2.2取样、菌种培养用无菌棉签在脓皮症患猫多个病灶处进行采集，将病样放入装有营养肉汤的试管里，置于37℃恒温培养箱中培养24h。2.2.3细菌分离与纯化在超净工作台上，用冷却后的无菌接种环蘸取少量的菌液接种到普通琼脂平板，并做好相应编号标记。接种完毕后放入37℃恒温培养箱培养24h。经过24h后取出观察，用接种环挑取优势单菌落接种至普通琼脂平板纯化，纯化后接种至5%绵羊血琼脂培养基、伊红美蓝培养基、BP培养基进行鉴别。2.2.4革兰氏染色与镜检将经过纯化的致病菌经过涂片、革兰氏染料染色后放在显微镜下观测细菌形态。2.2.5生化鉴定用灭菌接种环挑取纯化后的致病菌加入到含有尿素、精氨酸水解、木糖、木糖醇、蔗糖、乳糖、果糖、甘露糖、甘露醇、V-P(葡萄糖磷酸盐胨水)、蜜二糖、蕈糖、山梨醇、N-乙酰葡胺、麦芽糖、硝酸盐还原的生化反应管中，37℃下培养24h。观察并记录结果。2.2.5动物致病性试验将16只6周龄小鼠随机分成四组，每组4只，试验组为ABC组，对照组为D组。将四组小鼠臀部剃毛后用无菌砂纸轻擦脱毛部位至出现轻微红斑，试验组在该部位皮下注射不同浓度的分离菌液0.2mL，对照组在该部位皮下注射无菌生理盐水0.2mL。放置40%湿度相同的环境下饲喂。持续观察接种部位，4d后处死小鼠，刮取皮肤病料进行增菌培养和染色镜检。2.2.6药敏试验挑取经分离鉴定为伪中间型葡萄球菌的单菌落，接种于5~6mL营养肉汤中，37℃培养24h。培养完成后，采用比浊法测定菌液浓度，参照标准比浊卡调整菌液浓度，可使用灭菌生理盐水或新鲜营养肉汤进行稀释。将调整好浓度的菌液尽快接种至5%绵羊血琼脂培养基上。使用灭菌移液枪头吸取适量菌液滴加于平板表面，使用经火焰灭菌并冷却的涂布棒均匀涂布平板，确保菌液完全覆盖平板。涂布后静置5min，让菌液充分被吸收。用无菌镊子将药敏纸片轻贴于涂布均匀的平板上并轻轻摁压，确保纸片与培养基充分接触。纸片之间的间距不小于2.5cm，每平板贴4个不同的药敏纸片。在平板底部做好标记，倒置于37℃培养箱中培养24h。培养结束后，从平板背面观察抑菌圈的大小。以肉眼未见明显细菌生长的边缘为界限，用细记号笔标记抑菌圈直径（含纸片直径），精确到mm。若抑菌圈内出现离散菌落，需挑取菌落重新鉴定并进行药敏试验复测。判读标准：根据抑菌圈直径进行判读：直径>20mm判为敏感（S）；15mm<直径≤20mm判为中敏（I）；直径≤15mm判为耐药（R）。重复三次测量，最终结果取平均值。

3结果与分析3.1细菌分离培养与染色观察细菌的分离培养：在一般琼脂平板中生长出来的优势菌落为圆形、黄白色、光滑湿润、边缘清楚、表面隆起。直径约为2mm~3mm。细菌形态特征和运动性观察：在显微镜下（图2-1）观察到经过革兰氏染色后的致病菌为革兰氏阳性菌，蓝紫色，其菌体外表特征为球形或卵圆形，呈不规则葡萄串样簇集分布，没有鞭毛，没有荚膜，没有芽孢，没有发现运动。表2-1致病菌在不同培养基上出现的菌落特征培养基菌落特征5%绵羊血培养基黄白色、凸起、光滑湿润、有β-溶血环伊红美蓝培养基不生长BP培养基灰黑色、圆形、表面光滑、无晕圈图2-1显微镜下致病菌的形态3.2生化鉴定结果生化鉴定后结果显示，乳糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、N-乙酰葡胺等为阳性反应；硝酸盐还原、甘露醇、V-P、尿素等为阴性反应。该菌株的生化鉴定结果符合伪中间型葡萄球菌的特征。具体生化试验结果见表2-2。表2-2疑似伪中间型葡萄球菌的生化鉴定结果生化项目结果生化项目结果尿素－蕈糖＋甘露糖＋精氨酸水解＋甘露醇－V-P－乳糖＋木糖－果糖＋木糖醇－麦芽糖＋硝酸盐还原－蜜二糖－N-乙酰葡胺＋山梨醇－蔗糖＋注：＋阳性，－阴性。3.3动物致病性试验结果A、B、C三组小白鼠在12h后依次出现患病现象，其中注射菌液浓度最高的C组最先出现疾病症状。在36h到达病情最高峰。C组小鼠红斑面积最大，结痂变厚有大量鳞屑和出血现象发生；B组小鼠红斑较小，有少量皮屑存在；A组小鼠红斑最小，有微量皮屑；D组小鼠皮肤缓慢愈合，无皮肤病变。4d处死小鼠后去除病变位置的结痂，观察到C组小鼠皮下存在出血的脓肿灶，B组和A组脓肿灶较小，D组皮下无肉眼可见的病变。刮取的病料染色镜检观察情况与原分离菌一致。3.4药敏试验结果将分离鉴定得到的伪中间型葡萄球菌进行药敏试验。结果表明对阿米卡星、庆大霉素、万古霉素、利福平高度敏感，其中以利福平和阿米卡星的抑菌效果最为显著。对头孢唑林、克林霉素、环丙沙星中敏。对氨苄西林、阿莫西林、青霉素、红霉素、多西环素耐药。药敏试验结果见表2-3。表2-3各类抑菌药物在药敏试验中表现情况药物名称抑菌圈直径/mm结果氨苄西林5R阿莫西林10R青霉素7R阿米卡星28S庆大霉素21S头孢唑林18I红霉素6R万古霉素23S多西环素11R利福平29S克林霉素17I环丙沙星19I注：S表示高敏；I表示中敏；R表示耐药。

4讨论本试验从患猫病灶中成功分离出疑似伪中间型葡萄球菌的致病菌，其经革兰氏染色后为革兰氏阳性菌，为葡萄串状簇状分布。本次试验选用的培养基为伊红美蓝培养基、5%绵羊血琼脂培养基和BP平板培养基。伊红美蓝培养基主要用于分离鉴别革兰氏阴性菌，该致病菌在此培养基不生长，可知是一种革兰氏阳性菌，与彭华团队结果一致REF_Ref17390\r\h[10]。在5%绵羊血培养基生长出黄白色、具有透明β-溶血环的结构，并无金黄色素，与徐彬团队结果一致REF_Ref17570\r\h[11]。BP培养基是一种选择鉴别葡萄球菌尤其是金黄色葡萄球菌的培养基，致病菌在此培养基正常生长但菌落较小，卵磷脂酶阴性反应，并没有产生卵磷脂酶晕圈，不符合金黄色葡萄球菌的生长特点，证明不是金黄色葡萄球菌。该菌生化鉴定结果显示乳糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、N-乙酰葡胺等为阳性反应；硝酸盐还原、甘露醇、V-P、尿素等为阴性反应，与丁巧玲团队的生化试验结果一致，确定该菌株为伪中间型葡萄球菌REF_Ref17723\r\h[12]。在动物试验中，该分离菌株可导致试验组小鼠皮肤出现的病理性变化与张宇豪团队的动物试验相似，并且在被处死的试验组小鼠体内检测到了与该分离菌株高度相似的病原菌，据此可推断出本次试验中从患猫体表分离出的菌株为具有致病性的伪中间型葡萄球菌REF_Ref17955\r\h[13]。由于猫脓皮病的发生与环境有重大关系，所以应保持饲养环境干燥通风，定期消毒以避免潮湿滋生细菌。其他预防措施包括通过补充维生素及优质蛋白来强化免疫系统；适度洗澡以清洁皮肤并彻底吹干毛发；每月使用体外驱虫药并定期梳毛以清除寄生虫；排查食物及环境过敏原，监测激素水平，必要时通过益生菌或药物调节内分泌功能等措施REF_Ref18034\r\h[14]。药敏试验结果表明，对阿米卡星、庆大霉素、万古霉素、利福平高度敏感，其中以利福平和阿米卡星的抑菌效果最为显著。对头孢唑林、克林霉素、环丙沙星中敏。对氨苄西林、阿莫西林、青霉素、红霉素、多西环素耐药。多重耐药性一般定义为同时对3类及3类以上的抗生素耐药，这提示了分离出的伪中间型葡萄球菌存在多重耐药性现象REF_Ref18177\r\h[15]，因此在治疗猫脓皮病时，药物方面应该优先选择阿米卡星和利福平，二者对伪中间型葡萄球菌的抗菌效果强，也可联合使用以求达到更好的治疗效果。

结论从学校畜牧场采集到的患猫病料经过病原分离鉴定分析，确定病原为伪中间型葡萄球菌，并通过药敏试验测得对阿米卡星、庆大霉素、万古霉素、利福平高度敏感，其中以利福平和阿米卡星的抑菌效果最为显著。对头孢唑林、克林霉素、环丙沙星中敏。对氨苄西林、阿莫西林、青霉素、红霉素、多西环素耐药。

参考文献曾玉淇,李德均,官琼珍,等.犬猫皮肤病的研究进展[J].今日畜牧兽医,2021,37(03):62-65.张宇豪.犬脓皮病病原菌分离及葡萄球菌致小鼠皮肤感染模型建立[D].西北农林科技大学,2021.安妮.宠物源伪中间型葡萄球菌的耐药性调查研究[J].新农业,2021,(23):67-68.李磊.犬脓皮病调查及其病原鉴定和耐药性分析[D].华中农业大学,2022.肖连.犬皮肤源葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析[D].西南民族大学,2022.张海霞,雷蕾,张振彪,等.猫源伪中间葡萄球菌耐药性调查[J].中国兽医杂志,2022,58(07):9-13.杨军.鸭源葡萄球菌分离鉴定、毒力基因检测及与致病性相关性研究[D].华中农