2025年人禽流感病毒及实验室检验技术相关试题及答案

2025年人禽流感病毒及实验室检验技术相关试题及答案一、单项选择题（每题2分，共30分）1.2025年新发现的人感染H10N8禽流感病毒变异株中，HA蛋白受体结合域关键位点由Q226L突变为L226Q，这一突变最可能导致：A.病毒对禽类唾液酸受体（α2,3）亲和力增强B.病毒对人类唾液酸受体（α2,6）亲和力增强C.病毒神经氨酸酶活性显著下降D.病毒包膜糖蛋白抗原性完全丧失答案：B（HA蛋白Q226L突变是禽类病毒适应人类受体的经典标志，反向突变为L226Q可能增强对α2,6受体结合，但需结合其他位点综合判断）2.实验室检测人禽流感病毒时，采用恒温扩增技术（LAMP）的主要优势是：A.可同时检测多种病毒亚型B.对实验室生物安全等级要求低C.检测灵敏度高于实时荧光RT-PCRD.结果判读无需依赖荧光检测设备答案：D（LAMP通过检测反应过程中产生的焦磷酸镁沉淀或显色剂变化判读结果，无需荧光定量PCR仪，适合基层快速检测）3.某实验室在检测疑似人禽流感病例咽拭子样本时，RT-PCR结果显示NP基因阳性但H5亚型特异性引物阴性，最可能的原因是：A.样本中病毒载量低于检测下限B.病毒发生HA基因重排导致亚型变异C.提取RNA时混入DNA污染D.引物设计未覆盖当前流行株变异区域答案：D（NP基因是流感病毒保守基因，若NP阳性而亚型特异性引物阴性，更可能是亚型引物因病毒变异未能匹配，需更换引物或采用测序验证）4.2025年更新的《人禽流感实验室检测技术指南》中，规定对活禽市场环境样本的病毒分离应在：A.BSL-2实验室生物安全柜内进行B.BSL-3实验室生物安全柜内进行C.BSL-2实验室普通操作台面进行D.BSL-3实验室非生物安全柜区域进行答案：B（人禽流感病毒为高致病性病原，环境样本可能含高浓度病毒，需在BSL-3实验室生物安全柜内进行病毒分离）5.关于人禽流感病毒血清学检测，以下说法错误的是：A.急性期血清应在发病后7天内采集B.恢复期血清需间隔2-4周采集C.中和抗体检测特异性高于血凝抑制试验D.单份血清IgM阳性即可确诊答案：D（血清学诊断需急性期与恢复期双份血清抗体滴度4倍以上升高，或单份血清IgM阳性结合临床及其他检测结果综合判断）6.新型人禽流感病毒全基因组测序时，采用三代测序技术（PacBio）的主要目的是：A.降低测序成本B.提高测序读长以解决重复序列C.缩短测序时间至2小时内D.同时检测病毒RNA和宿主DNA答案：B（三代测序技术读长可达数万碱基，能更准确拼接流感病毒8个节段的全长序列，尤其适用于HA、NA等高变异区域的分析）7.某实验室使用快速抗原检测试剂（胶体金法）检测疑似病例样本，结果为阴性，但RT-PCR结果为阳性，最可能的解释是：A.抗原检测灵敏度低于核酸检测B.样本采集时未触及上呼吸道黏膜C.抗原检测试剂过期导致假阴性D.RT-PCR扩增过程中发生交叉污染答案：A（快速抗原检测灵敏度通常为50%-70%，低于RT-PCR的90%以上，病毒载量较低时易漏检）8.人禽流感病毒实验室检测中，内参基因（如人β-actin）的主要作用是：A.验证样本中病毒RNA的完整性B.排除样本采集或运输过程中的降解C.定量计算病毒载量的绝对值D.区分人源RNA与病毒RNA答案：B（内参基因检测人源RNA的完整性，若内参阴性提示样本采集不合格或运输保存不当导致RNA降解）9.2025年新研发的人禽流感病毒检测芯片，可同时检测12种流感病毒亚型，其核心技术是：A.多重PCR结合微流控芯片B.原位杂交技术C.表面等离子共振（SPR）D.酶联免疫斑点试验（ELISPOT）答案：A（通过设计多对特异性引物，在微流控芯片中进行多重PCR扩增，结合荧光标记实现多亚型同步检测）10.对人禽流感死亡病例进行尸检时，采集肺组织样本的最佳处理方式是：A.直接放入-80℃冰箱冻存B.加入RNA保存液（如RNAlater）后4℃保存C.制成10%组织匀浆后离心取上清D.用10%中性福尔马林固定用于病理检查答案：C（肺组织需研磨制成10%匀浆，低速离心去除组织碎片，上清用于病毒分离或核酸提取，兼顾病毒存活和检测效率）11.实验室检测人禽流感病毒时，若样本RNA提取后OD260/OD280比值为1.2，最可能的污染是：A.蛋白质污染B.基因组DNA污染C.酚类物质残留D.盐离子残留答案：A（OD260/OD280比值正常范围1.8-2.0，低于1.6提示蛋白质污染，可能因裂解不充分或纯化步骤遗漏）12.某实验室开展人禽流感病毒中和试验时，选用的细胞系应为：A.Vero细胞（猴肾细胞）B.MDCK细胞（犬肾细胞）C.293T细胞（人胚肾细胞）D.Hela细胞（人宫颈癌细胞）答案：B（MDCK细胞对流感病毒敏感，是中和试验的标准细胞系，Vero细胞主要用于登革病毒等检测）13.2025年某地区出现人感染H9N2禽流感聚集性病例，实验室检测发现病毒NA基因携带H275Y突变，这一突变最可能导致：A.对奥司他韦耐药B.对扎那米韦耐药C.病毒复制能力增强D.抗原性显著改变答案：A（H275Y是神经氨酸酶抑制剂（如奥司他韦）的经典耐药突变，扎那米韦耐药通常与E119V等突变相关）14.实验室进行人禽流感病毒核酸检测时，设置的阴性质控样本应为：A.无RNA酶的去离子水B.已知阴性的人咽拭子样本C.灭活的季节性流感病毒样本D.含内参基因的人工合成RNA答案：B（阴性质控需使用与检测样本同类型的阴性临床样本，排除样本基质干扰，去离子水仅作为扩增阴性对照）15.关于人禽流感病毒实验室生物安全，以下操作错误的是：A.处理活病毒的实验人员需穿戴正压防护面罩B.实验废弃物经121℃高压蒸汽灭菌30分钟后处理C.病毒培养物转移时使用双层防漏容器D.样本灭活（如56℃30分钟）后可在BSL-2实验室进行核酸提取答案：A（BSL-3实验室操作时，人员需穿戴符合要求的防护服，正压防护面罩通常用于BSL-4实验室或高风险操作）二、简答题（每题8分，共40分）1.简述2025年人禽流感病毒实验室检测流程的关键环节及质量控制要点。答案：关键环节包括样本采集与运输（需采集发病3天内的呼吸道样本，使用病毒保存液，4℃运输≤48小时，-70℃长期保存）、样本前处理（灭活处理：56℃30分钟或紫外线照射30分钟，需验证灭活效果）、核酸提取（选择柱提法或磁珠法，确保RNA得率和纯度，OD260/OD280≥1.8）、扩增检测（使用国家批准的试剂，设置阴/阳性对照、内参基因，避免交叉污染）、结果判读（Ct值≤37为阳性，需复核；Ct值37-40需重复检测）、病毒分离（仅在BSL-3实验室进行，使用MDCK细胞，观察细胞病变效应CPE）、基因测序（全基因组测序分析变异位点，如HA受体结合域、NA耐药位点）。质量控制要点：每批检测需包含弱阳性对照（病毒载量10³拷贝/μL）验证灵敏度，内参基因阳性率≥95%确保样本有效性，定期进行设备校准（如荧光定量PCR仪温度校准），实验人员需经BSL-3操作培训并考核合格。2.比较实时荧光RT-PCR与数字PCR（dPCR）在人禽流感病毒检测中的优缺点。答案：实时荧光RT-PCR优点：检测速度快（1-2小时），成本较低，可定量（通过Ct值相对定量），广泛应用于临床实验室；缺点：依赖标准曲线，低拷贝数样本易受抑制影响，无法绝对定量。dPCR优点：通过微滴分割实现单分子扩增，可绝对定量（拷贝数/μL），灵敏度更高（检测下限5拷贝/反应），对抑制物耐受性强；缺点：检测时间长（3-4小时），设备成本高（需微滴提供仪和读取仪），无法同时检测多个靶标（多重检测难度大）。2025年dPCR主要用于病毒载量精确监测（如重症病例病程评估）和低病毒载量样本（如环境表面擦拭样本）的确认检测。3.阐述人禽流感病毒HA基因测序在疫情防控中的应用价值。答案：HA基因测序可分析病毒受体结合特性（如Q226L、G228S等关键位点），判断其跨种传播能力；通过分子进化树分析确定病毒来源（如与禽类流行株的同源性），追踪传播链；监测抗原漂移（HA1区氨基酸突变），指导疫苗株的选择（如2025年H5N6疫苗株需匹配当前流行的clade2.3.4.4h分支）；识别插入突变（如H5亚型HA裂解位点多碱性氨基酸插入，与高致病性相关），评估病毒致病力；结合其他基因节段（如PB2E627K、D701N）分析宿主适应性，预测人传人风险。例如，2025年某地区人感染H7N9病例HA基因出现A138S突变，经测序确认该突变增强了病毒与人类上呼吸道细胞的结合能力，提示需加强监测。4.列举三种新型人禽流感病毒检测技术（2020年后研发）及其技术原理。答案：（1）CRISPR-Cas13a检测系统：利用Cas13a蛋白识别病毒RNA靶标后激活其RNA酶活性，切割报告分子（如荧光标记的RNA探针），通过荧光信号判读结果，具有高特异性（可区分单个碱基差异）和无需扩增（等温条件下检测）的特点。（2）纳米孔测序即时检测（ONT-COVID类似平台）：通过纳米孔对病毒RNA逆转录的cDNA进行单分子测序，实时输出序列数据，30分钟内可完成全基因组测序，适合现场快速溯源。（3）表面增强拉曼散射（SERS）传感器：基于金纳米颗粒修饰的特异性抗体，与病毒抗原结合后产生特征性拉曼信号，通过便携式拉曼光谱仪读取，检测时间<15分钟，灵敏度达10²拷贝/mL。5.说明人禽流感病毒实验室检测中“假阴性”结果的常见原因及解决措施。答案：常见原因：（1）样本采集不当（如咽拭子未触及扁桃体或后壁，仅采集唾液）；（2）样本运输保存不当（4℃超过48小时或反复冻融导致RNA降解）；（3）病毒载量低（如病程后期或轻症病例）；（4）引物/探针与病毒变异株不匹配（如HA基因高变区突变）；（5）检测抑制物存在（如样本中的黏液、血红蛋白抑制PCR反应）。解决措施：（1）规范采样操作（使用植绒拭子，深入咽后壁旋转3次）；（2）样本采集后2小时内4℃保存，超48小时需-70℃冻存；（3）对临床高度疑似但初检阴性样本，重复采样并使用两种不同检测方法（如RT-PCR+dPCR）；（4）定期更新引物/探针序列（参考WHO全球流感监测网络公布的流行株序列）；（5）添加内参基因（如人RPL13A）监测抑制物，若内参Ct值>30，需用柱提法重新提取RNA或稀释样本。三、案例分析题（每题15分，共30分）案例1：2025年3月，某省报告1例55岁男性重症肺炎病例，有活禽市场暴露史（发病前3天曾购买活鸡）。入院时体温39.5℃，氧合指数180mmHg，胸部CT显示双肺弥漫性磨玻璃影。临床怀疑人禽流感，送当地疾控中心实验室检测。问题1：实验室应如何选择检测样本并进行前处理？答案：样本选择：优先采集下呼吸道样本（如气管吸取物、肺泡灌洗液），因重症病例上呼吸道病毒载量可能下降，下呼吸道样本阳性率更高；同时采集急性期血清（发病7天内）。前处理：（1）病毒灭活：56℃水浴30分钟（需验证灭活效果，如灭活后接种MDCK细胞无CPE）；（2）核酸提取：使用磁珠法自动提取仪（如KingFisher），减少人工操作误差；（3）血清处理：56℃灭活30分钟破坏补体，避免影响中和试验。问题2：若RT-PCR检测显示NP基因（Ct=25）、H7亚型基因（Ct=28）阳性，下一步应开展哪些实验室检测？答案：（1）全基因组测序：提取RNA进行逆转录，使用覆盖8个基因节段的引物扩增，通过IlluminaMiSeq或PacBio测序，分析HA（如R220G、G186V位点）、NA（如H275Y耐药突变）、PB2（如E627K宿主适应性突变）等关键区域；（2）病毒分离：将灭活前的原始样本接种MDCK细胞，35℃培养3-5天，观察CPE，收获上清进行血凝试验确认；（3）血清学检测：检测急性期血清IgM（酶联免疫法），并采集恢复期血清（发病后21天）检测HI抗体，观察滴度是否4倍升高；（4）耐药性分析：通过基因测序或表型试验（如神经氨酸酶抑制试验）确认是否对奥司他韦耐药；（5）生物信息学分析：将序列上传GISAID数据库，比对全球流行株，确定病毒进化分支及变异特征。案例2：某实验室在检测一批活禽市场环境样本（鸡笼擦拭物）时，发现1份样本RT-PCR显示NP基因阳性（Ct=32），但H5、H7、H9亚型引物均阴性。问题1：可能的原因有哪些？答案：（1）病毒为新型未监测亚型（如H10、H11等）；（2）病毒发生重排，HA基因来自其他禽流感病毒（如H5N1与H9N2重排为H5N9）；（3）引物/探针因病毒变异未能覆盖（如HA基因高变区突变导致引物结合位点改变）；（4）样本中存在其他流感病毒（如禽流感病毒与猪流感病毒重排的“类人”病毒）；（5）交叉污染（如实验室操作中样本间污染，但NP基因阳性提示为真实阳性）。问题2：实验室应采取哪些验证措施？答案：（1）更换通用引物：使用覆盖所有甲型流感病毒的M基因引物（如WHO推荐的M1-F/M1-R）进行复检，确认是否为甲型流感病毒；（2）高通