专题23 基因工程-2021-2025全国高考生物真题分类汇编

专题23基因工程考点五年考情（2021-2025）命题趋势知识1基因工程的工具及操作程序（5年20考）考点01PCR扩增原理与过程2025·河北2025·北京近五年高考试卷，基因工程考查频繁，主要以简答题形式考查，重点考查PCR扩增原理与过程、基因工程基本操作程序，常结合实际案例进行考查，难度系数较大考点02DNA的粗提取与鉴定2022·山东2021·山东考点03基因工程基本操作程序2025·江苏2025·山东知识2蛋白质工程（5年1考）考点04蛋白质工程的原理及应用2024·江苏考点01PCR扩增原理与过程1．[2025年河北高考真题]X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是()A.该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500B.用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同C.与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变D.利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病2．[2024年湖南高考真题]最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补酸对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧原苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是()A.上述PCR反应体系中只加入一种引物B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢C.5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G3．[2025年北京高考真题]学习以下材料，回答（1）~（4）题。野生动物个体识别的新方法识别野生动物个体有助于野外生态学的研究。近年，人们发现可以从动物粪便中提取该动物的DNA，PCR扩增特定的DNA片段，测定产物的长度或序列，据此可识别个体，在此基础上可以获得野生动物的多种生态学信息。微卫星DNA是一种常用于个体识别的DNA片段，广泛分布于核基因组中。每个微卫星DNA是一段串联重复序列，每个重复单位长度为2~6bp（碱基对），重复数可以达到几十个（图1）。基因组中有很多个微卫星DNA，分布在不同位置。每个位置的微卫星DNA可视为一个“基因”，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星“基因”可以有多个“等位基因”，能组成多种“基因型”。分析多个微卫星“基因”，可得到个体特异的“基因型”组合，由此区分开不同的个体。依据微卫星“基因”两侧的旁邻序列（图1），设计并合成特异性引物，PCR扩增后，检测扩增片段长度，即可得知所测个体的“等位基因”（以片段长度命名），进而获得该个体的“基因型”。例如，图2是对某种哺乳动物个体A和B的一个微卫星“基因”进行扩增后电泳分析的结果示意图，个体A的“基因型”为177/183。有一个远离大陆的孤岛，陆生哺乳动物几乎无法到达，人类活动将食肉动物貉带到该岛上。科学家在岛上采集貉的新鲜粪便，提取DNA，扩增并分析了10个微卫星“基因”，结果在30份样品中成功鉴定出个体（表1）。几个月后再次采集貉的新鲜粪便，进行同样的分析，在40份样品中成功鉴定出个体（表1）。据此，科学家估算出该岛上貉的种群数量。表1两次采样所鉴定出的貉的个体编号第一次采集的30份粪便样品所对应的个体编号N01N02N03N04N05N06N07N08N08N09N10N11N12N12N13N14N14N15N16N17N18N18N19N20N21N22N22N23N24N24第二次采集的40份粪便样品所对应的个体编号N03N04N05N08N09N09N12N14N18N23N24N25N26N26N26N27N28N29N30N30N31N32N32N33N33N33N34N35N36N37N38N39N40N41N42N43N44N44N45N46（1）图2中个体B的“基因型”为______。（2）使用微卫星DNA鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星“基因”的数目和______的数目决定的。（3）科学家根据表1信息，使用了______法的原理来估算这个岛上貉的种群数量，计算过程及结果为______。（4）在上述研究基础上，利用现有DNA样品，设计一个实验方案，了解该岛貉种群的性别比例。4．[2025年湖南高考真题]未成熟豌豆豆荚的绿色和黄色是一对相对性状，科研人员揭示了该相对性状的部分遗传机制。回答下列问题：（1）纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，只有一种表型。自交得到的中，绿色和黄色豆荚植株数量分别为297株和105株，则显性性状为______。（2）进一步分析发现：相对于绿色豆荚植株，黄色豆荚植株中基因H（编码叶绿素合成酶）的上游缺失非编码序列G。为探究G和下游H的关系，研究人员拟将某绿色豆荚植株的基因H突变为h（突变位点如图a所示，h编码的蛋白无功能），然后将获得的Hh植株与黄色豆荚植株杂交，思路如图a：①为筛选Hh植株，根据突变位点两侧序列设计一对引物提取待测植株的DNA进行PCR。若扩增产物电泳结果全为预测的1125bp，则基因H可能未发生突变，或发生了碱基对的______；若H的扩增产物能被酶切为699bp和426bp的片段，而h的酶切位点丧失，则图b（扩增产物酶切后电泳结果）中的______（填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”）对应的是Hh植株。②若图a的中绿色豆荚：黄色豆荚=1：1，则中黄色豆荚植株的基因型为______[书写以图a中亲本黄色豆荚植株的基因型（△G+H）/（△G+H）为例，其中“△G”表示缺失G]。据此推测中黄色豆荚植株产生的遗传分子机制是______。③若图a的中两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，则说明______。5．[2024年湖南高考真题]色盲可分为红色盲、绿色盲和蓝色盲等。红色盲和绿色盲都为伴X染色体隐性遗传，分别由基因L、M突变所致；蓝色盲属常染色体显性遗传，由基因s突变所致。回答下列问题：（1）一绿色盲男性与一红色盲女性婚配，其后代可能的表型及比例为________或________；其表型正常后代与蓝色盲患者（Ss）婚配，其男性后代可能的表型及比例为_______（不考虑突变和基因重组等因素）。（2）1个L与1个或多个M串联在一起，Z是L上游的一段基因间序列，它们在X染色体上的相对位置如图a。为阐明红绿色盲的遗传病因，研究人员将男性红绿色盲患者及对照个体的DNA酶切产物与相应探针杂交，酶切产物Z的结果如图b，酶切产物BL，CL、DL、BM、CM和DM的结果见下表，表中数字表示酶切产物的量。BLCLDLBMCMDM对照15.118.133.645.521.366.1甲00021.910.961.4乙15.018.500033.1丙15.918.033.045.021.064.0丁16.018.533.045.021.065.0①若对照个体在图a所示区域的序列组成为“Z+L+M+M”则患者甲最可能的组成为________（用Z、部分Z，L、部分L，M、部分M表示）。②对患者丙、丁的酶切产物Z测序后，发现缺失Z1或Z2，这两名患者患红绿色盲的原因是_______。③本研究表明：红绿色盲的遗传病因是______。6．[2023年江苏高考真题]为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：（1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______，扩增程序中最主要的不同是______。（2）有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。A.ATGGTGCAACCA B.TGGTTGCACCATC.GACGAGCTGCAG D.CTGCAGCTCGTC（3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______。（4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化（5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。（6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______。7．[2023年河北高考真题]单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。回答下列问题：（1）根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的_________差异获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。（2）超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、________和_________等。本研究中目的基因为_________。（3）PCR扩增时引物通过________原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的_______组，样品2有特异性扩增产物，结果表明_________。（4）利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平均水平明显_______。同时，还需测定__________以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。（5）胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高，__________，最终促进胞内脂质合成。（6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为_________。（答出两点即可）8．[2022年广东高考真题]“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。回答下列问题：（1）研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对________________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。（2）研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是________________，终止子的作用是________________。（3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。（4）这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。9．[2025年江苏高考真题]川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题：（1）川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有______。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有______。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺______获得更多机会。（2）川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成______关系。（3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表：实验目的简要操作步骤释放DNA在去杂后的样本中加入裂解液析出DNA离心后取①______，加入乙醇②______在沉淀物中加入纯水扩增DNA将③______、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR（4）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbcL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基______。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是______。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有______。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用______的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基（5）依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有______（填字母）。a.建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流b.保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物c.需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量d.主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量考点02DNA的粗提取与鉴定10．[2022年山东高考真题]关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是()A.过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质11．[2021年山东高考真题]粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是()A.加入适量的木瓜蛋白酶B.37～40℃的水浴箱中保温10～15分钟C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精D.加入NaCl调节浓度至2mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14mol/L考点03基因工程基本操作程序12．[2021年湖北高考真题]限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割，双链DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为()A.6 B.250 C.4000 D.2400013．[2023年湖北高考真题]用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是()A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落14．[2021年山东高考真题]利用农杆菌转化法，将含有基因修饰系统的T-DNA插入到水稻细胞M的某条染色体上，在该修饰系统的作用下，一个DNA分子单链上的一个C脱去氨基变为U，脱氨基过程在细胞M中只发生一次。将细胞M培育成植株N。下列说法错误的是()A.N的每一个细胞中都含有T-DNAB.N自交，子一代中含T-DNA的植株占3/4C.M经n（n≥1）次有丝分裂后，脱氨基位点为A—U的细胞占1/2nD.M经3次有丝分裂后，含T-DNA且脱氨基位点为A—T的细胞占1/215．[2025年江苏高考真题]图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有()A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变B.用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同C.用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致D.产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定16．[2025年山东高考真题]种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。（1）Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为________。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和________对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为________bp，则一定为正向重组质粒。（2）为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为________（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段________，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为________（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。（3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，________（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。17．[2025年河北高考真题]为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题：（1）在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是__________和__________。模板与引物在PCR反应的__________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为____________________________________________________________。（2）载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加__________（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成__________键。（3）若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为__________，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量__________，则表明融合蛋白能结合镉离子。（4）将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是________________________。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是____________________。注：镉离子对渗透压的影响忽略不计（5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是__________和__________。（填标号）①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递18．[2024年江苏高考真题]为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：（1）步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是________。（2）步骤②转化时，科研人员常用________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是________。（3）步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是________（从图2的“A~D”中选填）。（4）步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。（i）20℃时，加入NaCl后实验结果是________________。（ii）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是________________。19．[2024年山东高考真题]研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越_________（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有_________种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-_________-3'和5'-_________-3'。（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素_________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是_________，其中纯合的突变植株是_________（填序号）。（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为_________，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。20．[2024年北京高考真题]学习以下材料，回答下题。筛选组织特异表达的基因筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。（1）在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生___________的过程称为细胞分化，分化是基因___________的结果。（2）对文中“增强子”的理解，错误的是________（单选）。A.增强子是含有特定碱基序列的DNA片段B.增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上C.一个增强子只能作用于一个基本启动子D.很多增强子在不同组织中的活性不同（3）研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测___________。（4）真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称（略）。考点04蛋白质工程的原理及应用21．水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：（1）蛋白质工程流程如图所示，物质a是_______，物质b是_______。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_____________________________________。（2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有___________、__________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是____________________。（3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的______(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是______________________________。（4）若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路：________________________________________。

参考答案与解析考点01PCR扩增原理与过程1．答案：AB解析：与正常男性相比,患病男孩X染色体发生了倒位,即X染色体上的基因排列顺序发生了改变,C正确。利用S1引和S2进行PCR检测,若有扩增产物说明D基因正常,胎儿不患该病；若无扩增产物则说明D基因异常,胎儿患病,故D正确。据题干可知,X染色体上的D基因异常可导致人体患病,某男患者的母亲没有患病,则该病为伴X染色体隐性遗传病,该病患者中男性显著多于女性；又知该病在男性中发病率为1/3500,则该病致病基因的频率为1/3500,所以女性中携带者的占比为2×(1/3500)×(3499/3500),故A错误。母亲不患病,但有与患病男孩(其儿子)一样的电泳条带,推测母亲为该病致病基因携带者。由题干可知,该患病男孩X染色体上的基因D和H内各有一处断裂,且断裂点间的染色体片段发生颠倒重接,则用R1和R2对母亲的DNA进行PCR检测,有目标扩增产物.对患儿的DNA进行PCR检测,无目标扩增产物,B错误。2．答案：AC解析：利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A项正确；电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢。B项错误的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,C项正确，D项错误。3．答案：（1）174/174（2）等位基因（3）标记重捕;根据标记重捕法的计算公式N=（M×n）/m，则该岛上貉的种群数量N=(24×32)/10≈77（只）。（4）从现有DNA样品中，选择Y染色体上特有的微卫星DNA序列，设计特异性引物；对所有DNA样品进行PCR扩增；对扩增产物进行电泳分析，若能扩增出相应条带，则该个体为雄性，若不能扩增出相应条带，则该个体为雌性；统计雄性和雌性个体的数量，从而计算出该岛貉种群的性别比例。解析：（1）从图2中可知，个体B扩增后的电泳条带对应的片段只有长度为174，根据“以片段长度命名”等位基因进而确定基因型的规则，个体B的“基因型”为174/174。（2）根据题干信息“每个位置的微卫星DNA可视为一个‘基因’，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星‘基因’可以有多个‘等位基因’，能组成多种‘基因型’，分析多个微卫星‘基因’，可得到个体特异的‘基因型’组合，由此区分开不同的个体”可知，使用微卫星DNA鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星“基因”的数目和等位基因的数目决定的。因为微卫星“基因”数目越多，等位基因组合的可能性就越多，能区分的个体数也就越多。（3）科学家采用了标记重捕法的原理来估算种群数量。第一次采集30份粪便样品鉴定出24个不同个体（相当于标记数M=24），第二次采集40份粪便样品鉴定出32个不同个体（相当于重捕数n=32），其中两次都有的个体数为10个（相当于重捕中被标记的个体数m=10）。根据标记重捕法的计算公式N=（M×n）/m，则该岛上豹的种群数量N=(24×32)/10≈77（只）。（4）从现有DNA样品中，选择Y染色体上特有的微卫星DNA序列，设计特异性引物。对所有DNA样品进行PCR扩增。对扩增产物进行电泳分析，若能扩增出相应条带，则该个体为雄性；若不能扩增出相应条带，则该个体为雌性。统计雄性和雌性个体的数量，从而计算出该岛豹种群的性别比例。4．答案：(1)绿色(2)替换;Ⅱ(G+h)/(△G+H);黄色亲本植株中缺失G序列,导致基因H表达量降低(或不表达),不能合成叶绿素(或叶绿素含量少),豆荚表现为黄色；G序列对H基因的表达没有影响(或影响很小)解析：(1)纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交,F1只有一种表型,说明F1表现的性状为显性性状。F1自交得到F2,绿色和黄色豆荚植株数量比约为297:105=3:1,符合孟德尔分离定律中杂合子自交后代显性性状与隐性性状的分离比。所以显性性状为绿色。(2)①若扩增产物电泳结果全为预测的1125p,基因H可能未发生突变,若发生突变且产物长度不变,则可能是发生了碱基对的替换。H的扩增产物能被酶切为699bp和426bp的片段,h的酶切位点丧失。Hh植株会产生两种类型的扩增产物,一种是H经酶切后的699bp和426bp片段,一种是h未被酶切的1125bp片段,所以图b中的Ⅱ对应的是Hh植株。②Hh植株与黄色豆荚植株(△G+H)/(△G+H)杂交,若F1中绿色豆荚:黄色豆荚=1:1,说明Hh植株产生了两种配子G+H和G+h,且黄色豆荚植株只能产生含△G+H的配子,所以F1中黄色豆荚植株的基因型为(G+h)/(△G+H),产生的遗传分子机制是:黄色亲本植株中缺失G序列,导致基因H表达量降低(或不表达),不能合成叶绿素(或叶绿素含量少),豆荚表现为黄色。③若图的F1中两种基因型植株的数量无差异,但豆荚全为绿色,说明虽然黄色亲本中基因H上游缺失G,但H基因仍能正常表达(或表达量足够)合成叶绿素,使豆荚表现为绿色,即G序列对H基因的表达没有影响(或影响很小)。5．答案：（1）正常女性∶红色盲男性=1∶1；正常女性∶绿色盲女性∶红色盲男性∶红绿色盲男性=1∶1∶1∶1；红蓝色盲∶绿蓝色盲∶红色盲∶绿色盲=1∶1∶1∶1（2）部分Z+M+部分M；Z发生突变，导致L、M基因无法表达；L、M基因的共用调控序列发生突变或L、M基因发生基因突变解析：（1）根据题意分析，绿色盲男性的基因型为XLmY，红色盲女性的基因型为XLmXLm或XLmMXLm，若该女性的基因型为XImXIm，则后代的基因型及比例为XLmXIM：XIMY=1：1；表型及比例为正常女性：红色盲男性=1：1；若该女性的基因型为XIMXIM，则后代的基因型及比例为XlmXlm：XlmXlm：XLmY：XlmY=1：1：1：1；表型及比例为正常女性：绿色盲女性：红色盲男性：红绿色盲男性=1：1：1：1。无论哪种情况，后代的正常个体只有女性，且基因型为XLmXlm，若同时考虑蓝色盲，其基因型为aaXLmXLm，而蓝色盲男性的基因型为SxXLmY，两者婚配，其男性后代的基因型及比例为SsXLmY：SxXLMY：ssXLmY=1：1：1：1，表型及比例为绿蓝色盲：红蓝色盲：绿色盲：红色盲=1：1：1：1。（2）根据对照组的实验结果可知，对照组的序列组成为Z+L+M+M，患者甲的Z序列的电泳结果和对照组不同，且电泳距离更远，因此片段较小，只具有部分Z片段：患者甲BL、CL和DL均缺失，因此不含L片段；对照组含有两个M片段，其BM、CM和DM的量分别为45.5、21.3和66.1，而患者甲BM、CM和DM的量分别为21.9、10.9和61.4，其BM、CM的量为对照组的一半，而DM的量和对照组相差不大，因此患者甲含有一个完整的M片段和第二个M片段的DM区，因此其序列组成表示为部分Z+M+部分M。患者丙和患者丁的L和M片段的相关结果和对照组无差异，但缺失乙Z1或Z2，说明Z1和Z2的缺失会影响L和M基因的表达，从而使机体患病，因此其患病的原因是Z发生突变，导致L、M基因无法表达。分析甲、乙、丙和丁的检测结果可知，红绿色盲的遗传病因是L、M基因的共用调控序列发生突变或L、M基因发生基因突变。6．答案：（1）模板（片段F1、片段F2）、引物；引物（2）CD（3）限制性核酸内切酶（限制酶）（4）ABC（5）P3、P4（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列解析：（1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。（2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'GACGAG-3'能与AnBl中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C.D选项中5'CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。故选、CD。（3）传统重组质粒构建需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）。（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误；B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误;C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发育为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。故选ABC。（5）EGFP为720bp,AnBl为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。7．答案：（1）溶解度（2）启动子；终止子（答案“启动子”和“终止子”不分顺序）；苹果酸酶基因（或“ME基因”）（3）碱基互补配对；对照；引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”）（4）增加；细胞数量（5）有氧呼吸生成的ATP增多（6）节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”）解析：（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。因此，根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到的粗提DNA可以作为PCR扩增目的基因的模板。（2）基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有特殊序列结构的DNA片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果酸酶（ME）基因。（3）PCR是一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组DNA作为PCR模板，而在实验组中以转ME基因的硅藻细胞基因组DNA作为模板。如此比较两个实验扩增结果可以判定引物间的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测ME基因序列是否整合到硅藻细胞基因组中。（4）硅藻细胞内的脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图3分析可知，相对于非转基因硅藻细胞品系A，转基因硅藻细胞品系B的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系A与B的硅藻细胞数量，从而可筛选获得高产生物柴油的优良硅藻细胞品系。（5）细胞内脂质的合成需要大量ATP。苹果酸酶（ME）可催化苹果酸生成NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析可知，ME基因的超表达导致线粒体中的NADH水平升高，NADH进一步通过有氧呼吸产生大量ATP，最终促进细胞内脂质的合成。（6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为：能够通过发酵大量生产、不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。8.（1）答案：引物解析：本题考查基因工程的相关知识。利用PCR技术扩增目标酶基因的前提是根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物。（2）答案：作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞；终止转录，使转录在需要的地方停下来解析：在基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在所需要的地方停下来。（3）答案：CO2等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长解析：由题图可知，重组梭菌大量表达题述酶蛋白时，CO2等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致重组梭菌生长迟缓。（4）答案：废物的资源化；不仅不排放CO2，而且还可以消耗工业废气中的CO2解析：由题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的CO2等一碳温室气体为原料生产丙酮，实现了废物的资源化，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放CO2，而且还可以消耗工业废气中的CO2，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。9．答案：(1)捕食和种内竞争;物理信息、化学信息和行为信息;食物和栖息空间等(2)互利共生(3)①上清液②溶解DNA③TaqDNA聚合酶、dNTP(4)互补配对;丁;丙、丁;甲、乙(5)ab解析：(1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能,这说明生物之间的关系有捕食关系和种内竞争。生态系统中的信息类型有物理信息、化学信息和行为信息,川金丝猴根据这些信息及时作出反应,一方面可以降低被捕食风险,另一方面为争夺食物和栖息空间等资源获得更多机会。(2)川金丝猴消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化,这些微生物与川金丝猴构成互利共生关系(3)①根据“DNA的粗提取与鉴定”实验,可以确定为析出DNA,需离心后取上清液,加入乙醇。②DNA析出后,取沉淀物(粗提取的DNA)加纯水的目的是溶解DNA。③根据PCR反应体系的成分,可以确定还需要加入TaqDNA聚合酶、dNTP。(4)为分析川金丝猴摄食的植物种类,研究者设计一对引物F和R,能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbcL,基因片段,是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基互补配对。因为植物甲,乙,丙的相关DNA长度一样,所以根据电泳条带分析能检出的样本是植物丁。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序,得到的序列有图中的3种序列,因为甲、乙序列相同,故不确定川金丝猴摄食植物甲、乙的其中哪一种还是两种均摄食,只可确定川金丝猴摄食的植物有丙、丁。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物,参照叶绿体基因库,还需选用甲、乙基因中的保守序列设计引物,对川金丝猴粪便DNA进行扩增,测序分析。(5)因为川金丝猴是濒危物种,所以不宜用标记重捕法进行种群数量的调查,b不合理。川金丝猴的保护以就地保护为主,迁地保护为辅,d不合理。建立生态廊道、保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物均能对川金丝猴提供有效保护,a、b合理。考点02DNA的粗提取与鉴定10．答案：B解析：A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；B、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；C、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；D、细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。故选B。11．答案：A解析：木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A项正确；37~40℃的水浴箱中保温10~15分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温10~15分钟，使蛋白质变性析出，B项错误；向滤液中加入等体积、体积分数为95%冷却的酒精，此时DNA会析出，不会进入滤液中，C项错误；DNA在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度小，DNA会析出，不会进入滤液中，D项错误。考点03基因工程基本操作程序12．答案：C解析：据图可知，EcoRⅠ的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4096，即4096个碱基对可能出现一个限制酶EcoRⅠ的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为4000，故选C。13．答案：D解析：若用HindⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet（四环素）培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用SphⅠ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，不能在含Tet（四环素）的培养基中形成菌落，D错误。14．答案：D解析：植株N是由细胞M形成的，在形成过程中没有DNA的丢失，由于T-DNA插入到水稻细胞M的某条染色体上，所以细胞M含有T-DNA，因此植株N的每一个细胞中都含有T-DNA，A项正确。植株N的一条染色体中含有T-DNA，可以记为+，因此植株N的基因型记为+-，若自交，则子代中相关的基因型为++：+-：--=1:2:1，有3/4的植株含T-DNA，B项正确。细胞M中只有1个DNA分子的单链上的一个C脱去氨基变为U，所以复制n次后，产生的子细胞有2n个，但脱氨基位点为A—U的细胞的只有1个，所以这种细胞的比例为1/2n，C项正确。细胞M经3次有丝分裂后，形成的子细胞有8个，由于细胞M的DNA分子单链上的一个C脱去氨基变为U，所以是G和U配对，复制3次后，有4个细胞脱氨基位点为C—G，3个细胞脱氨基位点为A—T，1个细胞脱氨基位点为U—A，因此含T-DNA且脱氨基位点为A—T的细胞占3/8，D项错误。15．答案：BD解析：HindⅢ切割后形成的是黏性末端AluI切割后形成的是平末端,故B正确。正常的基因A用HindⅢ酶切后产生4个片段,突变后的基因a用HndⅢ酶切后产生3个片段,故D正确。由图可知,基因A突变为基因a,是由于T-A替换成了G-C,属于碱基对的替换,A错误。突变后的基因a中间片段不存在HindⅢ的切割位点,存在AluI的切割位点,基因a分别用HindⅢ和AluI酶切后产生的片段大小不一致,C错误。16．答案：（1）复制原点；XbaI；DNA聚合酶；SmaI和SpeI；550bp（2）4；环化；测序和序列比对（3）不能解析：（1）质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点，复制原点是DNA复制的起始位点，启动复制。切割质粒时，选择限制酶BamHI会破坏终止子，选择限制酶PstI会导致形成的黏性末端无法补平，只能选择SmaI和XbaI对Ti质粒进行完全酶切。将产生的黏性末端补平时使用的酶是DNA聚合酶。如果目的基因正向插入，靠近启动子一侧原先被XbaI切割后连接起来的部位不能被SmaI切开，靠近终止子一侧原先被SmaI切割后连接起来的部位仍然能被SmaI切开。选用限制酶SpeI和SmaI进行完全酶切并电泳检测。（2）识别序列为4个碱基对的限制酶，在DNA分子中切割位点较多，切割后可以获得更小的DNA片段，便于后续PCR扩增。根据图乙可知，将该片段环化，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。电泳只能判断DNA片段大小，不能确定DNA的碱基序列，不能判断两个同样大小的DNA片段是否为同一基因。要判断2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为测序和序列比对。（3）转基因生物中检测到野生型基因，但由于野生型基因不一定能够表达，或者表达的产物不一定有生物活性，所以不能确定该植株的表型为野生型。17．答案：(1)引物；脱氧核苷酸；复性；PCR过程中变性和延伸需要的温度均较高,一般的DNA聚合酶在高温下会变性失活(2)SmaI、EcoRI；磷酸二酯(3)发出黄色荧光；高(4)转基因衣藻细胞壁上的镉离子结合蛋白可以吸附培养液中的镉离子,减少镉离子对衣藻细胞的毒害；镉离子浓度过高,转基因衣藻细胞壁上的CADR数量和吸附能力有限,镉离子进入细胞对转基因衣藻和野生型衣藻均造成了较严重的毒害(5)①；③解析：(1)PCR反应过程包括①变性:温度超过90℃时,双链DNA解聚为单链:②复性:温度下降到50℃左右时两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合:③延伸:温度上升到72℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。PCR过程中变性和延伸需要的温度均较高,一般的DNA聚合酶在高温下会变性失活,只有耐高温的DNA聚合酶在这种温度条件下可以正常发挥作用。(2)分析图示中几种限制酶可知,NheI与XbaI酶切后产生的黏性末端相同,为了防止载体和目的基因出现自身环化和二者之间反向连接,不能同时在目的基因两端添加这两种酶的识别序列。根据题图中几种基因和限制酶的顺序可得出目的基因与对应酶切位点的位置关系,如图所示,即GP1基因两端应分别添加SmaI和EcoRI的识别序列。DNA连接酶催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键,完成DNA片段的连接。(3)根据题干信息可知,该转基因衣藻中转入的融合表达载体中含有黄色荧光蛋白YFP的编码序列,若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻发出黄色荧光,说明YFP基因表达成功,初步表明融合蛋白表达成功。构建成功的转基因衣藻中含有镉离子结合蛋白CADR、分泌信号肽SP7和定位于细胞壁的蛋白GP1的编码序列,可大量合成CADR,并定位于细胞壁;若转基因衣藻细胞壁的镉离子含量高于野生型衣藻,则说明融合蛋白可结合镉离子。(4)由图2可知,不同镉离子浓度的培养液处理下,转基因衣藻的细胞密度相对值均大于野生型衣藻,原因可能是转基因衣藻细胞壁上的镉离子结合蛋白可以吸附培养液中的镉离子,减少镉离子对衣藻细胞的毒害。240μmol·L-1镉离子浓度下,转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制,原因可能是培养液中的镉离子浓度过高,转基因衣藻细胞壁上的CADR数量和吸附能力有限,镉离子对转基因衣藻和野生型衣藻均造成了较严重的毒害。(5)与施加化学药物相比,转基因衣藻在环境治理上的优势体现在衣藻作为生物材料在水体中可进行自我繁殖,而化学药物可能需要多次施加,成本高且操作麻烦；同时衣藻可吸收水体中的N、P等元素,能在一定程度上减轻水体的富营养化。18．答案：（1）EcoRI、HindⅢ（2）CaCl2；卡那霉素；S-F和P-R（3）启动子；C（4）SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多；高温使蛋白变性解析：（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoRI、HindⅢ。（2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于感受态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，选引物S-F和E-R可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增。（3）RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。（4）（i）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。（ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。19．答案：