2026届新高考生物三轮冲刺复习+基因编辑、融合基因与融合蛋白、单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测

2026届新高考生物三轮冲刺复习基因编辑、融合基因与融合蛋白、单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测热点考情CRISPR/Cas9基因编辑2024·新课标卷，35；2023·海南卷，20；2021·海南卷，25单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测2024·河北卷，24；2024·黑吉辽卷，17、25；2024·全国甲卷，38；2024·湖南卷，15；2024·江西卷，12；2024·浙江6月选考，19、20；2023·山东卷，25；2022·福建卷，13融合基因与融合蛋白2023·浙江6月选考，19；2023·辽宁卷，8；2023·江苏卷，22；2023·天津卷，17热点一CRISPR/Cas9基因编辑CRISPR/Cas9是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶。当细菌受到噬菌体的侵染时，它的某段DNA序列被Cas内切核酸酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。热点一CRISPR/Cas9基因编辑热点一CRISPR/Cas9基因编辑细菌发现新的入侵序列，先将新的外源序列整合到CRISPR系统。具体做法：将PAM上游20个碱基作为原间隔序列，对其进行完整切割，并整合到原CRISPR序列上，生成一个新的间隔序列。热点一CRISPR/Cas9基因编辑①当外源DNA入侵时（在此次入侵过）；②

转录出tracrRNA（反式激活crRNA）；③Cas9蛋白被转录翻译，同时Cas1、Cas2、Csn2会附着在Cas9蛋白上；④CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA（Pre-crRNA，crRNA的前体）；⑤pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA，与Cas9蛋白组装成一个复合体，根据入侵者的类型，选取对应的间隔序列RNA，利用RNaseⅢ编辑成为成熟的crRNA（包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区）。⑥成熟的crRNA形成后，与Cas9蛋白、tracrRNA（稳定复合体结构）形成RNP复合体复合体（CRISPR-Cas9系统形成），对外源DNA进行切割，这样就做到了在敌人进一步动作前歼灭。其作用机制大体可以分为三个步骤：热点一CRISPR/Cas9基因编辑(1)Cas内切核酸酶(Cas酶)切割噬菌体获取新的间隔序列。(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA。(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。热点一CRISPR/Cas9基因编辑在实验室应用中，为了简化操作，科学家将crRNA和tracrRNA融合成一条单链RNA，即单链向导RNA（singleguideRNA,sgRNA）。sgRNA既保留了识别目标序列的能力，又能结合Cas9蛋白，构成了基因编辑的核心工具。天然的CRISPR/Cas9系统改造后的CRISPR/Cas9系统热点一CRISPR/Cas9基因编辑1.CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。热点一CRISPR/Cas9基因编辑1.CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理sgRNA的功能：Cas9蛋白的功能：Cas9作用的化学键：磷酸二酯键与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合（即识别作用）。在特定位点切割DNA。热点一CRISPR/Cas9基因编辑1.CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理Cas9-sgRNA复合体在细胞内识别与sgRNA上的间隔序列完全互补的DNA靶点。识别过程依赖于两个关键条件：一是sgRNA与靶DNA序列的碱基互补配对；二是靶DNA序列下游必须存在一个特定的PAM序列（如化脓链球菌Cas9系统中的NGG）。NHEJ是一种易错DNA修复方式，它能快速连接DNA断裂缺口的两端，但其容易导致缺口处发生短片段的缺失或插入，从而造成基因编码区移码（移码突变：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列），使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。HDR则通过引入donor模板进行精确修复，通过提供修复模板，可以在Cas9切割位点附近实现对内源基因的精准修复（点突变、蛋白标签序列或荧光蛋白序列的插入、特定片段的删除等）。热点一CRISPR/Cas9基因编辑1.CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理热点一CRISPR/Cas9基因编辑1.CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理HDR实现基因的插入、敲除和替换。热点一CRISPR/Cas9基因编辑2.CRISPR/Cas9基因编辑技术的优点CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。热点一CRISPR/Cas9基因编辑3.CRISPR/Cas9基因编辑技术的命题要点提醒(1)质粒构建：在一个载体上包含目标DNA片段的特定区域和Cas9内切核酸酶基因。(2)基因编辑用途：定点基因编辑，构建一个质粒即可，基因(部分)切除，需要构建两个质粒，两个质粒转录出的sgRNA分别与基因的两侧碱基配对。(3)脱靶问题：即对基因组非特异性切割。有效解决方法：适当增加sgRNA的长度，设计出特异性较强的sgRNA。练习：CRISPR/Cas9技术在遗传病治疗中展现出巨大潜力。镰刀型细胞贫血症是因β-珠蛋白基因（HBB）发生点突变所致，患者红细胞呈镰刀状。科学家计划利用CRISPR/Cas9技术治疗该疾病，流程大致为：设计靶向突变HBB基因的单链向导RNA（SgRNA），引导Cas9蛋白切割突变序列，同时导入正常HBB基因片段作为修复模板，最终使细胞表达正常β-珠蛋白。下列叙述错误的是（

）A．若sgRNA与某正常基因序列存在部分碱基互补，可能导致Cas9错误切割该基因（脱靶效应）B．Cas9切割突变HBB基因后，细胞可利用导入的正常基因片段进行修复，但该过程易受细胞内酶的影响，导致修复片段降解C．构建重组表达载体时，需包含sgRNA基因、Cas9基因和正常HBB基因模板，无需添加启动子，需添加特定的标记基因D．不同患者的HBB基因突变位点可能存在差异，因此需根据患者具体突变序列设计特异性sgRNAC练习：（多选）下图为借助CRISPR/Cas9基因编辑技术插入外源基因的过程图，其中PAM序列是一个短DNA序列，单链向导RNA可引导Cas9内切酶到特定的基因位点进行切割。下列叙述错误的是(

)A．Cas9内切酶能将脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开B．细菌细胞中的限制酶也能起到类似Cas9内切酶的作用C．Cas9内切酶定点切割与向导RNA和目标DNA结合无关D．双链DNA的断裂修复过程需要DNA聚合酶的催化CD练习：（多选）CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD-1基因敲除鼠的流程如图1所示。将体外转录获得的Cas9mRNA和sgRNA导入小鼠的受精卵中，获得了12只基因编辑小鼠。利用PCR鉴定小鼠的基因型，电泳结果如图2所示。已知P1和P2是PCR的引物。下列相关分析错误的是（

）A．敲除2、3、4片段引起的变异属于染色体变异B．敲除前，根据敲除的位置需要设计3个sgRNAC．图2中，4和12个体杂交的子代均为敲除纯合子D．图2中，3、5、7个体的体内均能检测到PD-1ABD练习：(2021·海南卷，25)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。回答下列问题：(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是______________。(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是_____________。(3)过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是______________。随后，Cas9蛋白可切割______________________序列。DNA连接酶Ca2＋处理法碱基互补配对原则目标DNA特定的核苷酸(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是__________________，基因敲除成功的判断依据是________________。DNA分子杂交技术不出现杂交带(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，在特定位点上切割基因组DNA，然后将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中练习：(2024·山东潍坊统考)CRISPR/Cas9系统可对基因组进行定点编辑，其工作原理如图1所示。该系统主要包含单链向导RNA(sgRNA)和Cas9酶两个部分，能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9酶到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。请回答下列问题：(1)图1为CRISPR/Cas9系统作用示意图，该系统能精准识别相关基因的原理是sgRNA与目标DNA发生____________，Cas9酶可催化___________(化学键名称)水解，剪切特定DNA片段。(2)LMNA基因编码的核纤层蛋白与维持细胞核正常形态有关。科研人员利用CRISPR/Cas9技术对体外培养HepG2(人源肺癌细胞)细胞株进行基因编辑，获得了LMNA基因敲除的稳定细胞系。碱基互补配对磷酸二酯键①体外培养HepG2时需要一定比例的O2和CO2，其中CO2的主要作用是______________；培养基除灭菌外还需要通过________________________________________________________来保证无菌无毒环境。②HepG2细胞中没有编码Cas9的基因，需将Cas9基因及sgRNA基因拼接形成拼接基因并与质粒结合导入HepG2细胞，用图2中的质粒以及含Cas9－sgRNA拼接基因的DNA片段构建表达载体时，应选用________进行酶切。维持培养液pH

定期更换培养液(或添加一定量的抗生素，或无菌操作)EcoRⅠ③将构建好的表达载体与用_____________处理的细菌置于适宜反应体系中培养。然后将培养的细菌涂布于含___________的平板培养基上，37℃培养，24h后挑取菌落，提取质粒作为模板，选择图3中引物组合________和________，通过PCR和电泳技术鉴定是否重组成功。④用鉴定成功的工程菌对HepG2细胞进行转染，培养三天后收集HepG2细胞，提取基因组，对其_________序列进行检测，判断Cas9－sgRNA拼接基因是否导入成功。若从细胞水平进行检测，可以检测HepG2细胞数目增长量或___________。Ca2＋(CaCl2)嘌呤霉素ⅡⅢ核苷酸细胞核形态热点二

融合基因与融合蛋白1.融合基因与融合蛋白(1)融合基因：融合基因是指两个基因的部分或全部序列首尾相连，形成受同一套调控序列控制的嵌合基因。启动子基因1基因2基因3终止子(2)融合蛋白：是指融合基因的表达产物。在基因工程技术中常指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套启动子和终止子内部构成的嵌合基因。慢性粒细胞白血病的致病基因BCR-ABL融合基因(3)启动子及其类型启动子是一段具有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。主要包括以下三种类型：①组成型启动子：能够调控基因表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。②组织特异性启动子：其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。如构建乳腺生物反应器时所用的在乳腺中特异表达的基因的启动子。③诱导型启动子：即在某些特定的物理或化学信号刺激后，使目的基因的转录水平有所提高。热点二

融合基因与融合蛋白热点二

融合基因与融合蛋白2.获得融合基因的方法(1)传统酶切法构建融合基因热点二

融合基因与融合蛋白2.获得融合基因的方法(1)传统酶切法构建融合基因EGFP基因序列：5'ATGGTGAGCAAGGGC……GACGAGCTGTACAAG-3'a.5'-CTCGAGATGGTGAGCAAGCGC-3'b.5'-GAATTCATGGTGAGCAAGCGC-3'c.5'-CTCGAGGACGAGCTGTACAAG-3'd.5'-GAATTCCTTGTACAGCTCGTC-3'扩增EGFP基因时应选用的一对引物为__________。a、d热点二

融合基因与融合蛋白2.获得融合基因的方法(2)重叠延伸PCR技术构建融合基因以融合基因M和基因N为例，步骤是：①设计4种引物：引物1和引物4为普通引物。引物2的3′端含有基因M的序列，5′端含有基因N的序列；引物3的3′端含有基因N的序列，5′端含有基因M的序列；引物2和引物3完全互补配对。②PCR扩增：利用引物1和引物2扩增基因M，2轮循环可得到M′型DNA分子；利用引物3和引物4扩增基因N，2轮循环可得到N′型DNA分子。③获得融合基因M＋N：将M′型DNA分子和N′型DNA分子放在同一个PCR管里，变性、复性、延伸后，就得到了拼接好的融合基因M＋N。热点二

融合基因与融合蛋白2.获得融合基因的方法热点二

融合基因与融合蛋白2.获得融合基因的方法(3)无缝克隆技术构建融合基因无缝克隆是一种显著区别于传统酶切连接方法的新技术，该技术是依赖于同源序列的基因克隆技术，具有简单、快速、高效的特点。通过重组酶的作用，能够将任意含有载体末端重叠区域的DNA片段重组至线性化载体上，不受酶切位点限制，载体自连背景极低。T5核酸外切酶于50℃降解5′末端热点二

融合基因与融合蛋白2.获得融合基因的方法(3)无缝克隆技术构建融合基因热点二

融合基因与融合蛋白2.获得融合基因的方法(3)无缝克隆技术构建融合基因质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。练习：野生枯草芽孢杆菌中，淀粉酶基因AmyS编码的酶最适温度为70℃，但易被钙离子抑制;基因AmyK编码的酶耐钙离子，但最适温度仅50℃。研究人员构建了如下图所示的AmyS与AmyK融合基因，获得的融合酶AmyS-AmyK在70℃含钙离子环境下的活性显著高于双酶混合体系。下列有关说法错误的是（）A．酶都是由含氮的单体构成的生物大分子B．融合酶发挥作用后不会失活，可反复利用C．构建融合基因时，需保留二者的终止子D．融合基因转录时的模板链是β链C练习：(2023·浙江6月选考，19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是(

)A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子B练习：(2023·江苏卷，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有_____________，扩增程序中最主要的不同是_____________。模板、引物复性温度(2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用________。EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC－GACGAGCTGTACAAG3′AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG－CCAAAACCACAACCA3′A.ATGGTG——CAACCAB.TGGTTG——CACCATC.GACGAG——CTGCAGD.CTGCAG——CTCGTC图2CD练习：(2023·江苏卷，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有______________________。(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化限制酶和DNA连接酶ABC(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。P3、P4(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_________________________________________________________________________________。电泳只能显示扩增片段的大致长度，不能显示精准的DNA碱基数量，也不能呈现DNA碱基序列热点三

单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测1.利用单酶切法和双酶切法构建基因表达载体（1）利用单酶切法构建基因表达载体质粒抗生素抗性基因SmaⅠBamH

ⅠHind

ⅢEcoR

ⅠEcoR

ⅠEcoR

Ⅰ目的基因BamH

ⅠHind

Ⅲ外源DNA质粒自身环化目的基因自身环化质粒和质粒连接目的基因和目的基因连接正向连接反向连接热点三

单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测1.利用单酶切法和双酶切法构建基因表达载体（2）利用双酶切法构建基因表达载体质粒抗生素抗性基因SmaⅠBamH

ⅠHind

ⅢEcoR

ⅠEcoR

ⅠEcoR

Ⅰ目的基因BamH

ⅠHind

Ⅲ外源DNA用

BamHⅠ和

HindⅢ两种限制酶切割。正向连接热点三

单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测2.单酶切法中正向连接与反向连接的检测方法一：利用PCR进行检测如图3中，选用引物a、b可扩增出1100bp长度的产物，用引物a、c无法扩增出产物，则为正向连接；如图4，选用引物a、b无法扩增出产物，用引物a、c可扩增出1000bp长度的产物，则为反向连接。方法二：利用电泳进行检测如图中，用BglⅡ和HindⅠ进行双酶切，电泳后若出现1100bp条带，则为正向连接；电泳后若出现1000bp条带，则为反向连接。练习：转基因抗虫棉的B