pcr考试试题及答案

pcr考试试题及答案一、单项选择题（每题2分，共30分）1.以下关于PCR技术的描述，错误的是：A.依赖DNA聚合酶的链式反应B.可在体外快速扩增特定DNA片段C.反应体系需加入RNA引物D.基本步骤包括变性、退火、延伸2.TaqDNA聚合酶的最适反应温度约为：A.55℃B.72℃C.94℃D.37℃3.荧光定量PCR（qPCR）中，SYBRGreenⅠ染料的作用是：A.特异性结合目标DNA的探针B.嵌入双链DNA后发出荧光C.标记引物以追踪扩增过程D.抑制非特异性扩增4.设计PCR引物时，引物长度通常建议为：A.5-10个核苷酸B.15-30个核苷酸C.35-50个核苷酸D.50-100个核苷酸5.PCR反应体系中，dNTP的主要作用是：A.提供反应所需能量B.作为DNA合成的原料C.维持反应体系pH值D.稳定酶的活性6.以下哪种情况可能导致PCR扩增产物出现smeared（弥散条带）？A.引物浓度过低B.退火温度过高C.循环次数过多D.dNTP浓度不足7.内参基因（HousekeepingGene）在PCR实验中的主要作用是：A.提高目标基因的扩增效率B.校正样本间加样量或RNA质量差异C.作为阳性对照验证实验体系D.减少非特异性扩增8.逆转录PCR（RT-PCR）的关键步骤是：A.将RNA逆转录为cDNAB.设计跨外显子引物C.控制退火温度D.优化dNTP浓度9.实时荧光定量PCR中，Ct值（CycleThreshold）的定义是：A.荧光信号达到设定阈值时的循环数B.扩增产物浓度达到最大值的循环数C.引物与模板完全结合的循环数D.酶活性最高的循环数10.PCR实验中，为避免交叉污染，以下操作错误的是：A.实验前用紫外线照射工作台30分钟B.试剂分装后多次冻融使用C.使用带滤芯的移液器吸头D.分区操作（试剂准备区、样本处理区、扩增区）11.以下关于TouchdownPCR的描述，正确的是：A.退火温度随循环次数增加逐渐升高B.用于提高扩增特异性C.仅适用于长片段扩增D.无需设置延伸步骤12.扩增人基因组DNA中某段500bp的目标片段时，延伸时间通常建议为：A.10秒B.30秒C.2分钟D.5分钟13.以下哪种物质会抑制Taq酶活性？A.镁离子（Mg²+）B.肝素C.dNTPD.引物14.多重PCR（MultiplexPCR）的核心要求是：A.所有引物的退火温度一致B.目标片段长度差异显著C.仅使用一种Taq酶D.反应体系中dNTP浓度加倍15.琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物时，若出现“引物二聚体”条带，可能的原因是：A.模板DNA浓度过高B.引物之间存在互补序列C.退火温度过低D.延伸时间不足二、填空题（每空1分，共20分）1.PCR技术的全称是________，其基本原理是模拟________过程。2.标准PCR反应体系的主要成分包括________、________、________、________、________和缓冲液。3.引物设计的基本原则包括避免________、________、________，GC含量建议为________，引物3’端应避免________。4.荧光定量PCR的两种主要方法是________（基于染料）和________（基于探针），其中________方法需要设计特异性探针。5.PCR扩增曲线通常分为________、________和________三个阶段，其中________阶段用于Ct值的确定。6.常见的PCR污染类型包括________污染、________污染和________污染，预防措施包括________、________和________。三、简答题（每题8分，共40分）1.简述PCR反应的三个基本步骤及其温度范围和作用。2.引物设计是PCR实验的关键环节，列举5项引物设计的核心注意事项，并说明原因。3.某实验室进行PCR实验时，出现“无扩增产物”的结果，可能的原因有哪些？请从模板、引物、酶、反应条件四个方面分析，并提出对应的解决措施。4.荧光定量PCR（qPCR）与常规PCR相比有哪些优势？简述其定量原理（绝对定量和相对定量）。5.简述PCR实验中“假阳性”结果的可能原因及预防措施。四、案例分析题（共10分）某实验室开展新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸检测，使用qPCR方法，检测靶标为N基因和ORF1ab基因。某次实验中，阳性对照（PC）的Ct值为28（正常范围25-30），阴性对照（NC）无荧光信号，内参基因（RnaseP）的Ct值为30（正常范围28-32），但部分临床样本的N基因和ORF1ab基因Ct值均为“Undetermined”（未检测到），而内参基因Ct值正常（29-31）。问题：（1）分析该实验结果的合理性；（2）推测样本检测结果为“Undetermined”的可能原因；（3）提出下一步验证或改进措施。答案一、单项选择题1.C（PCR使用DNA引物，而非RNA引物）2.B（Taq酶最适温度约72℃，与DNA延伸步骤匹配）3.B（SYBRGreenⅠ嵌入双链DNA后荧光增强，非特异性结合）4.B（引物长度通常15-30nt，过短特异性差，过长扩增效率低）5.B（dNTP为dATP、dTTP、dCTP、dGTP，作为DNA合成原料）6.C（循环次数过多会导致产物降解，出现弥散条带）7.B（内参基因用于校正样本量或RNA质量差异，如GAPDH、β-actin）8.A（RT-PCR需先将RNA逆转录为cDNA，后续进行PCR扩增）9.A（Ct值是荧光信号达到阈值时的循环数，与初始模板量负相关）10.B（试剂应避免多次冻融，分装后单次使用以减少污染）11.B（TouchdownPCR通过逐步降低退火温度提高特异性）12.B（Taq酶延伸速率约1kb/分钟，500bp建议30秒）13.B（肝素是血液中的抗凝剂，会抑制Taq酶活性）14.A（多重PCR要求引物退火温度一致，确保同时扩增）15.B（引物二聚体由引物3’端互补配对导致）二、填空题1.聚合酶链式反应；DNA体内复制2.模板DNA；引物；TaqDNA聚合酶；dNTP；Mg²+（镁离子）3.引物二聚体；发夹结构；错配；40%-60%；连续GC（或GC富集）4.SYBRGreen法；TaqMan探针法；TaqMan5.基线期；指数增长期；平台期；指数增长期6.气溶胶；交叉（或样本间）；阳性对照；分区操作；使用带滤芯吸头；紫外线照射（或dUTP-UNG系统）三、简答题1.PCR反应的三个基本步骤及作用：（1）变性（94-98℃）：高温使双链DNA解链为单链，破坏氢键；（2）退火（50-65℃）：引物与单链模板特异性结合（碱基互补配对）；（3）延伸（72℃）：Taq酶以dNTP为原料，从引物3’端延伸合成新的DNA链。2.引物设计核心注意事项（任选5项）：（1）长度15-30nt：过短特异性差，过长扩增效率低；（2）GC含量40%-60%：避免GC或AT富集导致退火温度异常；（3）避免引物二聚体：引物3’端不能互补（如3’端前3个碱基互补易形成二聚体）；（4）避免发夹结构：引物自身不能形成茎环结构（影响与模板结合）；（5）引物3’端为A/T：避免3’端为G/C（易非特异性结合）；（6）特异性：引物序列应与目标基因唯一匹配（通过BLAST验证）。3.无扩增产物的可能原因及解决措施：（1）模板：模板降解（如RNA样本未加RNase抑制剂）或浓度过低（低于检测限）；解决措施：检测模板浓度（如紫外分光光度法），重新提取高质量模板。（2）引物：引物设计错误（如结合位点突变）或浓度过低；解决措施：通过BLAST验证引物特异性，优化引物浓度（通常0.2-1μM）。（3）酶：Taq酶失活（如反复冻融）或质量差；解决措施：更换新酶，分装保存避免反复冻融。（4）反应条件：退火温度过高（引物无法结合）或延伸时间过短（长片段未完成合成）；解决措施：梯度PCR优化退火温度，延长延伸时间（1kb/分钟）。4.qPCR的优势及定量原理：优势：实时监测扩增过程、灵敏度高（可检测单拷贝）、无需电泳、定量准确。定量原理：（1）绝对定量：通过已知浓度的标准品（如质粒）绘制标准曲线，根据样本Ct值计算初始模板量（单位：拷贝数/μL）；（2）相对定量：以管家基因（如GAPDH）为内参，计算目标基因与内参基因的表达差异（常用2^-ΔΔCt法）。5.假阳性的可能原因及预防：原因：（1）气溶胶污染（PCR产物形成的微小颗粒扩散）；（2）交叉污染（样本间移液器或耗材未更换）；（3）阳性对照污染（操作时样本与阳性对照接触）。预防措施：（1）分区操作（试剂准备区、样本处理区、扩增区、产物分析区）；（2）使用带滤芯吸头（防止气溶胶进入移液器）；（3）实验前用紫外线照射工作台（破坏DNA）；（4）设置dUTP-UNG系统（UNG酶降解含dUTP的旧产物）。四、案例分析题（1）实验结果合理性分析：阳性对照（PC）Ct值在正常范围（25-30），说明反应体系和仪器正常；阴性对照（NC）无信号，排除试剂污染；内参基因（RnaseP）Ct值正常（28-32），说明样本核酸提取质量良好（无抑制物）。因此，实验体系可靠，样本检测结果“Undetermined”为真实结果。（2）可能原因：①样本中病毒载量低于检测限（如处于感染早期或恢复期）；②样本采集或保存不当（如咽拭子未接触到感染部位，或保存液失效导致病毒核酸降解）；③引物/探针与病毒变异株不匹配（如