酸笋发酵液中优良乳酸菌的筛选及鉴定

酸笋发酵液中优良乳酸菌的筛选与鉴定摘要：本研究以自然发酵酸笋为对象，通过稀释涂布法和平板划线法纯化分离菌株，结合溶钙圈法、滴定法及分子生物学技术，筛选并鉴定了四株综合性能优良的乳酸菌。从酸笋发酵液中分离出95株革兰氏阳性菌，选出15株形态表现优异的候选菌株经产酸能力筛选出4株菌（SS-30、SS-35、SS-45、SS-53），并通过耐受性（温度、pH、胆盐）、亚硝酸盐降解及生长特性试验进行综合分析。分子生物学鉴定表明，SS-53和SS-35为植物乳杆菌（Lactiplantibacillusplantarum），SS-30和SS-45为阿根图拉特乳植杆菌（Lentilactobacillusargentoratensis）。四株菌株在功能特性上呈现显著明显分化：SS-53综合性能最优，乳酸产量达22.49g/L，亚硝酸盐降解率为99.00%，且在宽温度（25–35℃）、宽pH（3–6）及高胆盐浓度（0.9%）下均保持稳定生长（OD600≥0.51），其细胞膜稳定性与代谢通量调控能力突出；SS-35在高温（35℃OD600=2.31±0.18）及近中性环境（pH6OD600=1.24±0.13）中适应性显著，但胆盐耐受性存在浓度阈值限制（0.6%时OD600下降42.3%）；SS-45在传统酸性发酵体系（pH5）中产酸能力优异（22.34g/L），而SS-30的高代谢差异为耐受机制研究提供了对照模型。研究表明，四株菌株的差异化功能特性可协同适配不同工艺需求，其中SS-53的宽泛的耐受性与高效代谢特性可支撑酸笋标准化发酵工艺开发，SS-35的高温适应性为耐热菌株筛选提供候选资源，SS-45的产酸稳定性与SS-30的异质性特征则分别可服务于传统发酵优化与基础机制解析。本研究旨在为酸笋产业的菌种定向筛选、合成菌群构建及功能性发酵笋制品开发提供多维菌种资源与理论框架，推动传统工艺向标准化与精准化升级。关键词：酸笋；乳酸菌；菌种特性；筛选；鉴定

ScreeningandIdentificationofExcellentLacticAcidBacteriainSourBambooShootFermentationBrothAbstract:Inthisstudy,fourlacticacidbacteriastrainsexhibitingexcellentcomprehensiveperformancewerescreenedandidentifiedusingnaturallyfermentedsourbambooshootsastheresearchsubject.Strainpurificationandisolationwereachievedthroughthedilutioncoatingmethodandplatestreakingmethod,complementedbythecalciumdissolutioncirclemethod,titration,andmolecularbiologytechniques.Atotalof95Gram-positivebacteriawereisolatedfromthesourbambooshootfermentationbroth.Fifteencandidatestrainswithsuperiormorphologicalcharacteristicswereselected,andfourstrains(SS-30,SS-35,SS-45,SS-53)weresubsequentlyscreenedbasedontheiracidproductioncapacity.Comprehensiveanalyseswereconductedviatolerancetests(temperature,pH,bilesalt),nitritedegradationassays,andgrowthcharacteristicevaluations.MolecularbiologyidentificationrevealedthatSS-53andSS-35belongedtoLactiplantibacillusplantarum,whileSS-30andSS-45wereidentifiedasLentilactobacillusargentoratensis.Thefourstrainsexhibitedsignificantdifferentiationinfunctionalcharacteristics:SS-53demonstratedthebestoverallperformance,withalacticacidyieldof22.49g/Landanitritedegradationrateof99.00%.Itmaintainedstablegrowth(OD600≥0.51)underabroadrangeoftemperatures(25–35°C),pH(3–6),andhighbilesaltconcentration(0.9%),showcasingoutstandingcellmembranestabilityandmetabolicfluxregulationcapabilities.SS-35exhibitedremarkableadaptabilityathightemperatures(OD600=2.31±0.18at35°C)andnear-neutralpH(OD600=1.24±0.13atpH6),butitsbilesalttolerancehadaconcentrationthreshold(OD600decreasedby42.3%at0.6%bilesalt).SS-45displayedexcellentacidproductioncapacity(22.34g/L)intraditionalacidicfermentationsystems(pH5).SS-30’shighmetabolicvariabilityprovidedacontrolmodelfortolerancemechanismresearch.Theresultsindicatedthatthedifferentiatedfunctionaltraitsofthefourstrainscansynergisticallyadapttovariousprocessrequirements.Specifically,SS-53’sbroadtoleranceandefficientmetaboliccharacteristicssupportthedevelopmentofstandardizedfermentationprocessesforsourbambooshoots;SS-35’shigh-temperatureadaptabilityofferscandidateresourcesforheat-tolerantstrainscreening;andSS-45’sacidproductionstabilityandSS-30’sheterogeneitycharacteristicsservetraditionalfermentationoptimizationandbasicmechanismanalysis,respectively.Thisstudyaimstoprovidemulti-dimensionalstrainresourcesandatheoreticalframeworkfortargetedstrainscreening,syntheticbiometricconstruction,andthedevelopmentoffunctionalfermentedbambooshootproductsinthesourbambooshootindustry,promotingtheupgradingoftraditionalprocessestowardsstandardizationandprecision.Keywords:

Sourbambooshoots;Lacticacidbacteria;Functionalcharacteristics;Strainscreening;Identification

1文献综述1.1酸笋与乳酸菌的生态关联酸笋作为中国传统特色发酵蔬菜制品的典型代表，是一种以新鲜竹笋为原料，通过浸漂处理与密封发酵工艺加工而成的自然发酵食品。其独特风味特征及营养价值的形成主要归因于发酵过程中微生物群落的动态演替及其代谢活动，这一复杂生物化学过程产生了特征性风味物质及功能活性成分REF_Ref23123\r\h[1]。在低盐或无盐条件下，竹笋通过乳酸菌（LacticAcidBacteria,LAB）主导的代谢活动，将碳水化合物转化为乳酸、乙酸等有机酸，形成低pH环境以抑制腐败菌生长REF_Ref23224\r\h[1]REF_Ref23267\r\h[2]。若是依靠空气中或者原料表面天然存在的乳酸菌发酵，这种自然发酵的随机性常导致酸笋品质波动大，且亚硝酸盐积累问题长期存在。近年研究发现，人工接种特定乳酸菌可显著优化发酵效率。例如，Han，D.团队接种植物乳杆菌LactiplantibacillusplantarumCGMCC1.1856可使豆汁pH值下降速率提高30%，还能显著增加低分子碳水化合物含量，优化风味和营养价值REF_Ref23303\r\h[4]，这一成果提示酸笋可能通过定向菌株筛选实现功能化升级。在这样背景下，针对酸笋发酵体系中乳酸菌种群的系统解析与功能评价成为突破传统工艺瓶颈的关键——通过建立基于多组学技术的菌株分离、筛选与鉴定体系，定向挖掘具有高效产酸、亚硝酸盐降解及功能代谢物合成能力的优良菌株，并阐明其与土著微生物的协同拮抗关系，最终构建适配酸笋发酵特性的合成菌群REF_Ref8646\r\h[5]。这一策略不仅为传统发酵食品的标准化生产提供核心菌种资源，更为开发兼具传统风味与健康功效的功能性发酵笋制品奠定理论基础，充分体现了优良乳酸菌筛选与鉴定技术在传统食品现代化改造中的核心价值。1.2乳酸菌的生理功能与应用在微生物分类学上，乳酸菌是一种无芽孢的革兰氏阳性细菌，能够通过糖酵解途径转化碳水化合物生成乳酸。其在食品工业中的应用价值主要体现在提高食品营养价值、改善食品风味和保藏性、生产功能性食品以及食品防腐及保鲜等方面REF_Ref23577\r\h[6]。Orig,J.O.等证明乳酸菌产生的乳酸和细菌素（如Nisin）可抑制致病菌生长，延长食品货架期REF_Ref9788\r\h[7]；陈正培等发现乳酸菌通过产生亚硝酸盐还原酶降解亚硝酸盐，减少致癌风险，提升安全性REF_Ref23646\r\h[8]；在营养强化方面，乳酸菌代谢可释放游离氨基酸、短链脂肪酸，提升矿物质生物利用率。近年来，乳酸菌的应用已突破传统发酵领域，例如徐晋杰团队将植物乳杆菌L4用于复合果汁发酵，不仅缩短了发酵周期，还赋予产品独特的风味层次REF_Ref23267\r\h[2]。值得关注的是，代谢组学研究表明，乳酸菌的代谢网络直接影响挥发性酯类、醛酮类物质的生成REF_Ref23806\r\h[8]。随着食品发酵产业对品质与功能需求的不断升级，运用前沿基因编辑技术对乳酸菌进行精准、定向的功能优化，将成为未来极具潜力的核心研究领域REF_Ref23923\r\h[10]。其中，着重提升菌株在极端酸碱环境下的耐受性，以及增强其对亚硝酸盐的降解效能，有望为食品发酵、生物保鲜等相关产业提供更具性能优势的微生物资源，从而推动产业的技术革新与可持续发展。1.3国内外研究进展与现存挑战在传统发酵食品领域，国内在乳酸菌的功能特性筛选及其工业化应用方面成果显著。例如，郭丽琼等将从海带中分离出乳杆菌La10应用于海带纯种发酵，可明显降低整个过程中亚硝酸盐含量REF_Ref23956\r\h[11]；薛冰洁等结合16SrRNA测序与代谢组学，揭示了乳酸菌在酸笋风味形成中的核心作用REF_Ref23979\n\h[12]。分子生物学技术的引入进一步推动了菌种鉴定与功能解析的精准化，可利用16SrRNA基因测序技术筛选出改善酸笋风味的关键菌株，通过代谢组学揭示菌株代谢途径对风味形成的调控机制等。相比之下，国外研究则更注重菌群互作与代谢机制解析层面，借助宏基因组学、荧光原位杂交等前沿技术，深入探究乳酸菌与其他微生物，如酵母菌、醋酸菌之间的共生、竞争关系，如Gu,Y.等通过宏基因组学发现，传统发酵食品中乳酸菌的多样性与其功能协同性密切相关REF_Ref24047\n\h[12]。然而，乳酸菌当前相关研究存在三大突出问题：一是现有筛选方法多关注单一功能（如产酸或抑菌），忽视菌株的综合性能评价REF_Ref24113\n\h[14]；二是在工业发酵条件下易受温度梯度、渗透压变化等动态参数干扰，导致其功能表型呈现显著的环境依赖性波动；三是乳酸菌代谢途径与宿主微环境的互作机制尚未明晰REF_Ref24139\n\h[15]。针对以上不足，未来还需构建多维评价体系，将基因组学、转录组学与表型组学结合，系统性解析菌株功能与环境的适配性REF_Ref24162\n\h[16]。另外，目前在如酸奶、泡菜等发酵食品领域，已有大量乳酸菌被筛选和鉴定，相关理论和技术也日趋成熟。但针对酸笋发酵液中乳酸菌的系统性研究却相对匮乏。酸笋独特的发酵环境，包括原料的特殊性、发酵过程中的微生物群落结构以及环境条件等，可能孕育出具有特殊功能特性的乳酸菌REF_Ref24204\n\h[16]REF_Ref24240\n\h[17]。这些乳酸菌可能在产酸能力、耐酸耐盐性能、抑菌活性、风味物质合成等方面表现出独特的优势，值得进一步挖掘和研究。1.4研究目的与意义本研究以自然发酵酸笋为对象，通过改良MRS培养基分离菌株，结合溶钙圈法、滴定法筛选高产乳酸菌，并利用耐温（25–45℃）、耐酸（pH2.0–4.0）、耐胆盐（0.3%–0.9%）实验评估耐受性，同时测定亚硝酸盐降解率、生长速率及产酸动力学参数，最终讨论分析综合性能优良菌株REF_Ref24289\n\h[19]。本研究旨在开发标准化发酵剂，为有效缩短酸笋生产周期，提升产品质量均一性以及实现生产流程的高效与精准控制打下前期基础REF_Ref24335\n\h[20]；筛选出的高效降解亚硝酸盐菌株，能显著降低酸笋产品中亚硝酸盐含量，化解食品安全隐患，切实保障消费者健康权益REF_Ref24357\n\h[21]；挖掘出优质的乳酸菌菌株，为酸笋产业的创新提供了核心生物资源，有力推动酸笋产业向高附加值方向转型升级。1.5技术路线图1.1本研究的技术路线Fig.1.1Technicalrouteofthisstudy2引言酸笋作为我国南方传统发酵蔬菜的典型代表，凭借其独特风味和丰富的营养价值，在市场上广受欢迎REF_Ref24397\n\h[21]。其风味的形成及潜在健康价值的实现，与微生物尤其是乳酸菌的作用密切相关。在发酵过程中，乳酸菌通过代谢活动产生乳酸等有机酸，有效降低体系pH值，营造酸性环境，抑制有害微生物生长，保障产品安全并延长保质期REF_Ref24335\n\h[20]。同时，乳酸菌能够合成细菌素、双乙酰等抑菌物质与风味化合物，这些物质不仅抑制杂菌生长，还赋予了酸笋独特的口感与更加浓郁醇厚的风味REF_Ref24397\n\h[21]。此外，乳酸菌还具备改善人体肠道微生态、增强结肠功能与稳定性等益生特性REF_Ref24890\n\h[23]，使其成为筛选益生菌的重要资源。目前酸笋的生产大多仍依赖自然发酵方式，这种传统的发酵方式虽然能赋予产品独特的风味，但也存在着诸多局限性REF_Ref25001\n\h[24]REF_Ref25053\n\h[25]。为了克服自然发酵的不足，提升酸笋品质的稳定性，引入纯种乳酸菌发酵成为了关键途径REF_Ref25079\n\h[25]。只有筛选出具有优良特性的乳酸菌菌株，才能确保酸笋在发酵过程中能够稳定地产生理想的风味物质，抑制有害微生物的生长，从而提高酸笋的品质和安全性。本研究旨在从酸笋发酵液中筛选出具有产酸能力强、耐酸耐盐性能好等优良特性的乳酸菌，并通过生理生化分析与分子生物学技术对其进行准确鉴定。从理论层面来看，本研究将丰富乳酸菌菌种资源库，深入揭示酸笋发酵的微生物学机制，为酸笋发酵机制的深入探究奠定坚实的理论基础。从实际应用角度出发，研究成果可为酸笋工业化纯种发酵生产提供优质菌种资源，有效解决当前酸笋产业面临的品质控制难题，推动酸笋产业朝着标准化、现代化方向大步迈进，助力酸笋产业实现高质量发展REF_Ref25128\r\h[27]。3材料与方法3.1材料3.1.1样品实验室酸笋发酵液（pH3.8~4.2）。3.1.2试剂氯化钠、无水乙醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；氢氧化钠、盐酸萘乙二胺、乙酸锌、硼酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；盐酸、亚铁氰化钾（分析纯，重庆川东化工集团有限公司）；亚硝酸钠（分析纯，重庆市万州德盛商贸有限公司）；对氨基苯磺酸（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；甘油、牛胆盐、标准革兰氏染色液（生化试剂，重庆昂科生物科技有限公司）；香柏油、酚酞指示剂（生化试剂，国药集团化学试剂有限公司）；DNA提取试剂盒（分子生物试剂，北京擎科生物科技股份有限公司）等3.1.3仪器与设备DM500生物显微镜（重庆夏耘科技有限公司）；PH-100笔式酸度计（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；721可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；TD6M高速离心机（常州峥嵘仪器有限公司）；LE104E电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；LRHS-150-II恒温恒湿培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；SW-CJ-2FD洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；WH-3微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）3.1.4培养基MRS固体培养基（g/L）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2，葡萄糖20g，MgSO4•7H2O0.58g，牛肉膏10g，K2HPO42g，乙酸钠5g，吐温801ml，MnSO4•4H2O0.25g，琼脂粉20g加蒸馏水至1L，调节pH值在6.2-6.5之间，121℃灭菌15min；MRS肉汤液体培养基（g/L）：成分同固体培养基（不含琼脂）；MRS固体分离培养基（g/L）：成分同固体培养基（含琼脂），加入纳他霉素0.01g，1%-2%碳酸钙REF_Ref25367\r\h[29]。3.2方法3.2.1乳酸菌的分离纯化及保存采用十倍连续梯度稀释法处理酸笋发酵液，选取10-4、10-5、10-6梯度稀释液，各取200µL均匀涂布于含碳酸钙的MRS固体分离培养基表面，37℃恒温培养24至48小时REF_Ref25429\r\h[28]。待培养基表面有清晰的溶钙圈出现后，观察并记录其形态特征REF_Ref25660\r\h[29]。随后通过平板划线法对菌株进行纯化，重复三次操作直至获得形态均一的单菌落。纯化后菌株编号保存，部分菌株接种至斜面培养基于4℃短期保藏，另一部分转移至MRS液体培养基中继续培养至对数生长期，加入体积分数为50%的甘油混合液，置于-80℃超低温冰箱长期冻存备用REF_Ref25585\r\h[31]。3.2.2形态学鉴定从实验室酸笋发酵液中初步分离出95株疑似乳酸菌，在乳酸菌纯化过程中，挑取在固体平板上菌落表面光滑有光泽、边缘整齐且中央凸起、质地较小的乳白色菌落REF_Ref25709\r\h[32]REF_Ref25762\r\h[33]，同时根据溶钙圈的大小衡量菌株产酸能力，筛选出溶钙圈直径较大的菌株REF_Ref25794\r\h[34]REF_Ref5565\r\h[30]，使用革兰氏染色液对乳酸菌单菌落处理后调节双目显微镜于100倍油镜下，观察乳酸菌的细胞形态，初步确认菌株是否为乳酸菌菌株REF_Ref26124\r\h[35]REF_Ref26225\r\h[36]。3.2.3乳酸菌发酵产酸试验在无菌条件下，挑取活化后的分离菌株转接至MRS液体培养基中，37℃条件下活化2代，培养菌液的OD600nm值达到0.8REF_Ref26225\r\h[36]。再按2%的接种量接种至MRS液体培养基中，37℃培养24h。取发酵液，8000r/min离心5min，采用氢氧化钠滴定法测定总酸含量REF_Ref27411\r\h[37]REF_Ref27447\r\h[38]。取1.00mL发酵液放入250mL的锥形瓶中用去CO2水稀释10倍，加入3~5滴1%酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠滴定至微红色，且30s内不褪色，记录氢氧化钠的消耗量REF_Ref27538\r\h[39]，按公式（3-1）计算产酸量，其中c代表氢氧化钠（NaOH)溶液的浓度，单位为mol/L；V代表氢氧化钠（NaOH)溶液的消耗量，单位为L；乳酸的摩尔质量为90.08g/mol；0.001代表取样的发酵液体积(1mL）转换为升后的数值，即0.001L，用于将计算结果标准化为每升发酵液中的乳酸含量REF_Ref27577\r\h[40]REF_Ref27607\r\h[41]。 乳酸含量=（c×V×90.08）/0.001 3.2.4分子生物学鉴定将⾰兰⽒阳性的乳酸菌杆状菌种接种⾄10mlMRS液体培养基中，37℃下培养24～32⼩时，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的DNAREF_Ref27447\r\h[38]。使⽤细菌通⽤引物27F和1492R对16SrDNA区域进⾏PCR扩增，将扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测并观察其条带，送于北京擎科生物科技股份有限公司成都分公司测序确定菌属，最后测序结果在NCBI中的BLAST程序进行同源性比对分析，利⽤MEGA-X软件构建菌种系统发育树REF_Ref27777\r\h[42]REF_Ref27806\r\h[43]REF_Ref27829\r\h[44]REF_Ref28390\r\h[45]。3.2.5乳酸菌耐受性试验温度：分别将筛选的四株乳酸菌菌株按2%体积接种量接⼊MRS培养基中，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下恒温培养14h后，取1ml在600nm处测定培养液吸光值(OD值)REF_Ref28720\r\h[46]REF_Ref28759\r\h[47]。酸：分别将MRS液体培养基调成不同pH值（2、3、4、5、6、7），再将筛选出的四株乳酸菌菌株按2%体积接种量接⼊其中，37℃培养14h后，在600nm处测定培养液吸光值(OD值)REF_Ref28808\r\h[48]。胆盐：胆盐是肝细胞分泌的胆汁酸与牛磺酸或甘氨酸结合形成的钠盐或钾盐，在小肠吸收入血液后进入肝脏。胆盐对乳酸菌有着不可忽视的抑制作用，所以乳酸菌的耐胆盐能⼒是衡量优良乳酸菌的质量指标之⼀。参考“秦雅莉等”提供的⽅法，将活化后的菌株以2%体积接种量分别接种于含0.3%、0.6%、0.9%的⽜胆盐的MRS液体培养基中，37℃培养14h，在600nm处测定培养液吸光值(OD值)REF_Ref28720\r\h[46]REF_Ref28897\r\h[49]。3.2.6乳酸菌亚硝酸盐的降解能⼒对MRS培养基添加0.02%的NaNO2，然后将筛选的4株乳酸菌菌株按2％体积接种量接⼊MRS培养基中进⾏37℃恒温发酵14小时REF_Ref28936\r\h[50]。参照GB5009．33--2010，本研究采⽤盐酸萘⼄⼆胺法测定其发酵后菌液于538nm处吸光度，并根据标准曲线计算亚硝酸盐剩余含量及降解率，标准曲线由浓度为5.0μg/mL亚硝酸钠标准溶液分别吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL于50mL带塞比色皿管中的亚硝酸钠处理液于538nm处比色获得REF_Ref28975\r\h[51]REF_Ref28985\r\h[52]。3.2.7乳酸菌生长特性将筛选的乳酸菌活化后以2%体积接种量接种到MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养箱培养，每2h取一次菌液，以培养基为空白，测定目标菌株在发酵液中发酵24h过程中OD600值和pH值的变化REF_Ref26124\r\h[35]REF_Ref29047\r\h[53]。左右边分别以OD600nm吸光值和pH值为纵坐标，时间为横坐标绘制生长速率曲线和pH变化曲线。3.2.8数据处理每组试验平行3次，数据以“平均值±标准差”的形式表示。使用Excel2018进行数据处理与绘图，利用SPSS25．0软件进行数据的显著性检验。使用MEGA-X10.1软件构建系统发育树。4结果分析4.1菌株形态学鉴定从酸笋发酵液中共分离获得95株革兰氏染色阳性疑似乳酸菌菌株，分别编号为SS-01至SS-95。根据形态学特征初步筛选，选取在MRS固体分离培养基上菌落形态特征优异且具有明显溶钙圈的15株菌株进行鉴定REF_Ref25367\r\h[29]。革兰氏染色结果显示所有菌株均为阳性（如图4.1左边），过氧化氢酶接触试验结果均为阴性，符合乳酸菌的典型特性。菌落形态观察图4.1右边表明，其直径范围为0.5∼1.5mm，正面呈圆形，侧面为突起状，表面湿润光滑且质地不透明，色泽为奶油白色，边缘整齐REF_Ref25709\r\h[32]。后续将基于耐受性、亚硝酸盐降解能力等生理特性对筛选菌株进行进一步研究。图4.1部分酸笋源乳酸菌菌株镜检结果（左）和菌落形态特征（右）Fig.4.1Microscopicexaminationresults(left)andcolonymorphologicalcharacteristics(right)ofsomelacticacidbacteriastrainsderivedfromfermentedbambooshoots4.2乳酸菌发酵产酸测定结果本研究通过氢氧化钠滴定法评估了15株乳酸菌的产酸特性，筛选出产酸能力显著突出的前四株菌株（SS-53、SS-30、SS-45、SS-35）。其中，SS-53的产酸性能最为优异，其氢氧化钠消耗量（2.497±0.03mL）与乳酸含量（22.49±0.26g/L）均显著高于其他菌株（P<0.05），且代谢稳定性突出（标准差≤0.03），表明其代谢调控机制稳定REF_Ref29804\r\h[59]。菌株SS-30与SS-45虽产酸量相近（乳酸含量均为22.34g/L），但SS-45的氢氧化钠消耗量标准差仅为±0.01，显著优于SS-30（±0.03），提示其发酵过程中酸碱调控更为精准。SS-35作为第四高产菌株（乳酸含量22.25±0.09g/L），其产酸效率与前三株无显著差异（P>0.05），但代谢稳定性仍优于后续菌株（如SS-31标准差达±0.08），符合工业化菌株筛选标准。主要基于其高产性能、代谢稳定性及表型多样性，选择上述四株菌进行后续耐受性试验。表4.115株乳酸菌产酸含量Table4.1Acidproductionof15strainsoflacticacidbacteria产酸能力高低排序菌株编号氢氧化钠消耗量/mL乳酸含量g/L1SS-532.497±0.0322.49±0.262SS-302.48±0.0322.34±0.31续表4.1产酸能力高低排序菌株编号氢氧化钠消耗量/mL乳酸含量g/L3SS-452.48±0.0122.34±0.094SS-352.47±0.0122.25±0.095SS-312.42±0.0821.8±0.746SS-622.42±0.0521.8±0.487SS-072.403±0.0721.65±0.658SS-392.4±0.0121.62±0.099SS-442.4±0.0421.62±0.3910SS-322.363±0.0421.29±0.3611SS-652.346±0.0521.13±0.4512SS-212.32±0.0520.9±0.4813SS-282.31±0.120.81±0.9414SS-412.297±0.0420.69±0.3215SS-492.277±0.0220.51±0.214.3分子生物学鉴定细菌的16SrDNA序列在不同的物种间是高度保守的，不同的物种间序列是不一样的，因而对此序列通过PCR扩增、测序，与GenBank中的已知序列进行比对后，则可判定细菌种类，将其划分到属或种REF_Ref28390\r\h[45]。对分离初筛得到的4株菌株进行分子生物学鉴定，由图4.2可知，菌株在约1500bp处均有明亮清晰条带，将PCR扩增产物进行双向测序，测序结果经NCBI比对，SS-30和SS-45的16SrDNA序列与GenBank中阿根图拉特乳植杆菌（登录号CMI15172.1、CN378871.1）同源性达100%；SS-35和SS-53则与植物乳杆菌（登录号CP174499.1、CP142771.1）完全匹配（100%同源）。这一结果支持将SS-30、SS-45归为阿根图拉特乳植杆菌，SS-35、SS-53归为植物乳杆菌。基于图4.3MEGA-X软件构建的系统发育树显示，SS-30与阿根图拉特乳植杆菌参考菌株聚于同一分支（Bootstrap值68），尽管其与部分乳杆属菌株如瑞士乳杆菌（L.helveticus）存在混合聚类，但序列的完全一致性（100%）仍支持其种级分类。SS-45与SS-53在进化树中形成高支持分支，提示两者为同物种不同生态型或高度同源菌株。图4.2菌株16SrDNAPCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.4.2AgarosegelelectropHoresisof16SrDNAPCRamplifiedproduct表4.1四株菌株的同源性分析Table4.1Homologyanalysisoffourstrains样本编号同源菌株（来源菌株）GenBank登录号同源性/%SS-30阿根图拉特乳植杆菌菌株HBUAS59409CMI15172.1100SS-35植物乳杆菌菌株LM726CP174499.1100SS-45阿根图拉特乳植杆菌菌株HBUAS96905CN378871.1100SS-53植物乳杆菌菌株VHPcolM25CP142771.1100图4.3四株乳酸菌的系统发育进化树Fig.4.3Systemdevelopmentaltreeoffourlacticacidbacteria4.4乳酸菌耐受性测定结果根据图4.4实验结果显示，四株菌株的生长均呈现显著温度依赖性（P<0.05），但其响应模式存在多样性REF_Ref29475\r\h[54]。在30~35℃范围内，四株菌株OD600值均达到峰值，其中SS-53表现最优，30℃和35℃下OD600值分别为2.38±0.12和2.47±0.15，显著高于其他三株（P<0.01），误差棒范围（±0.12~0.15）表明其生长稳定性优于SS-30（35℃:2.25±0.21）及SS-45（35℃:2.18±0.19）。值得注意的是，SS-35在35℃时OD600值（2.31±0.18）虽略低于SS-53，但其高温适应性显著优于中温条件（30℃:2.05±0.14，P=0.003），提示其代谢通路可能具有热响应调控机制REF_Ref29599\r\h[55]。低温条件下（20~25℃），四株菌株OD600值均低于1.500，其中SS-30和SS-45的误差棒范围扩大（20℃:0.82±0.23和0.79±0.25），表明低温加剧了菌株间代谢异质性REF_Ref29638\r\h[56]；而SS-53在25℃时仍维持较高生长量（1.32±0.11），显著优于其他菌株（P<0.05），可能与胞内冷应激蛋白表达相关REF_Ref29680\r\h[57]。40℃高温胁迫下，四株菌株OD600值均显著下降（P<0.001），但SS-53（0.75±0.09）和SS-35（0.68±0.12）的耐受性优于SS-30（0.54±0.15）及SS-45（0.51±0.17），其误差棒离散度较小（±0.09~0.12），暗示其膜稳定性或DNA修复系统更高效。上述结果揭示，SS-53在宽温度范围内（25~35℃）兼具高产与生长稳健性，而SS-35的高温适应性特征为耐热菌株筛选提供了候选目标。图4.4四株乳酸菌在不同温度梯度下的OD600值Fig.4.4OD600valuesoffourstrainsoflactobacillusunderdifferenttemperaturegradients根据图4.5实验结果显示，菌株生长对pH变化高度敏感（P<0.01），当pH值在2.0～3.0时，全部菌株生长缓慢被抑制，在pH值在4.0～7.0之间，全部菌株生长情况较好，其中pH4~7为适宜生长范围，OD600值显著高于极端pH组（pH2~3）REF_Ref29729\r\h[58]。菌株SS-53在pH5时表现最优，OD600值达1.28±0.09，显著高于其他菌株（SS-30：0.95±0.12；SS-45：1.02±0.11；SS-35：1.15±0.10，P<0.05），且误差棒范围最小（±0.09），表明其在弱酸性环境下的代谢稳态调控能力突出。值得注意的是，SS-35在pH6时OD600值（1.24±0.13）与SS-53无显著差异（P>0.05），但较pH5时增长13.9%（P=0.007），提示其可能通过质子泵活性增强适应近中性环境REF_Ref29804\r\h[59]。图4.5四株乳酸菌在不同pH梯度下的OD600值Fig.4.5OD600valuesoffourstrainsoflactobacillusunderdifferentpHgradients根据图4.6实验结果显示，四株菌株的耐胆盐能力存在显著差异（P<0.05），且随胆盐浓度升高生长抑制效应加剧。在0.3%胆盐浓度下，SS-53的OD600值最高（1.42±0.10），显著优于其他菌株（SS-30:1.15±0.12；SS-45:1.23±0.11；SS-35:1.30±0.09，P<0.01），其误差棒范围（±0.10）表明其生长稳定性突出，可能与胆盐水解酶活性或膜脂修饰能力增强相关REF_Ref25128\r\h[27]。值得注意的是，SS-35在0.3%胆盐下OD600值（1.30±0.09）与SS-53无显著差异（P>0.05），但在0.6%浓度时其耐受性显著下降（0.78±0.15，P=0.004），提示其耐胆盐机制存在浓度依赖性阈值。高胆盐浓度（0.6%~0.9%）下，四株菌株OD600值均显著降低（P<0.001）。在0.9%胆盐时，SS-53仍维持相对较高的OD600值（0.51±0.07），显著高于SS-30（0.32±0.09）和SS-45（0.28±0.11，P<0.01），且误差棒离散度最小（±0.07），表明其细胞膜完整性及质子梯度维持能力较强REF_Ref29804\r\h[59]。SS-45在0.6%胆盐时OD600值（0.65±0.12）与SS-35（0.78±0.15）差异显著（P=0.013），可能与菌株间胆盐外排系统的表达效率差异有关。此外，SS-30在所有浓度下误差棒范围最大（±0.09~0.15），暗示其代谢异质性较高，可能限制其在复杂肠道环境中的应用潜力。图4.6四株乳酸菌在不同胆盐浓度梯度下的OD600值Fig4.6OD600valuesoffourlactobacillusstrainsatdifferentconcentrationgradientsofbilesalts综合温度、pH值和盐浓度试验，经初筛的四株乳酸菌（SS-53、SS-35、SS-44、SS-30）在耐受性特征上呈现显著异质性。SS-53展现出多维环境适应性，其宽温度（25~35℃）、宽pH（3~6）及高胆盐（≤0.9%）耐受性（误差棒≤±0.15）均显著优于其他菌株（P<0.05），SS-35在高温（35℃OD600值2.31±0.18）及近中性环境（pH6OD600值1.24±0.13）中表现突出，但其胆盐耐受性存在浓度阈值（0.6%时OD600值下降42.3%，P=0.004），SS-45在pH5（OD600值1.02±0.11）及0.3%胆盐（OD600值1.23±0.11）条件下具备中等活性，适于传统酸性发酵体系，但极端温度（40℃OD600值0.51±0.17）及高胆盐（0.9%OD600值0.28±0.11）耐受性不足，需严格控制工艺参数。SS-30耐受性整体较弱，其高温（40℃OD600值0.54±0.15）、碱性（pH7OD600值0.33±0.09）及高胆盐（0.9%OD600值0.32±0.09）适应性均显著低于其他菌株（P<0.01），可作为耐受机制研究的阴性对照。4.5降解亚硝酸盐测定结果基于标准曲线（y=0.051x−0.0056，R2=0.985），根据表4.2实验结果表明，所有菌株均展现出高效的亚硝酸盐还原能力，降解率均高于98.96%。其中，菌株SS-35的降解效率最高（99.07%），其吸光度值（OD538nm=0.4697）与理论残留浓度呈显著负相关（p<0.05），暗示其亚硝酸盐还原酶（Nir）活性或底物转运效率可能优于其他菌株。菌株SS-45吸光度值（OD538nm=0.4233）最低，降解率（98.96%）仅略低于SS-35，可能与检测中非目标代谢物如硝酸盐或氨类物质的光谱干扰有关，或反映其代谢途径中副产物的积累对Nir活性的反馈抑制REF_Ref30614\r\h[61]。菌株SS-30（99.02%）与SS-53（99.00%）的降解性能接近，进一步表明乳酸菌亚硝酸盐代谢的种内差异可能受基因调控网络（如Nir操纵子表达效率）或环境适应性（如pH耐受性）的影响。标准曲线的高拟合度（R2>0.98）验证了检测方法的可靠性，符合定量分析要求。本研究结果与已有文献中乳酸菌通过Nir介导的亚硝酸盐