生物技术制药试题及答案

生物技术制药试题及答案一、单项选择题（每题2分，共20分）1.在CHO细胞中表达单克隆抗体时，最常用于增强转录效率的启动子组合是A.SV40early+CMVenhancerB.EF1αcore+CAGchimeronC.CMVimmediate-early+intronAD.β-actin+UCOE答案：C解析：CMVimmediate-early启动子搭配其天然intronA可形成高效剪接供体/受体，使mRNA输出效率提升3–5倍；SV40与EF1α虽强，但无内含子辅助；β-actin+UCOE侧重染色质开放而非转录起始速率。2.利用CRISPR-Cas9敲除GS-CHO细胞中谷氨酰胺合成酶(GS)基因时，最佳sgRNA设计策略为A.靶向GS外显子1的5'UTRB.靶向GS外显子5的保守催化域C.靶向GS内含子2末端D.靶向GS启动子区-200bp答案：B解析：催化域突变导致完全失活，且外显子5缺失可产生移码，NMD效率高；5'UTR敲除可能保留下游ORF；内含子敲除需依赖可变剪接，效率低；启动子区-200bp仅降低表达，难彻底敲除。3.在2000L一次性生物反应器中，采用perfusion培养生产双特异性抗体，若目标活细胞密度为80×10⁶cells/mL，灌流速率为1.5reactorvolume/day，则每日需排出细胞量为A.120LB.180LC.240LD.300L答案：C解析：每日总流出=2000L×1.5=3000L；其中细胞悬液占8%（80×10⁶/1000×10⁶），故细胞排出体积=3000L×0.08=240L。4.关于ProteinA层析洗脱pH，下列说法正确的是A.人IgG1在pH3.0洗脱得率最高但聚集风险大B.人IgG4在pH4.5即可完全洗脱且单体比例>98%C.鼠IgG2a需降至pH2.5才能洗脱D.降低电导可替代低pH洗脱答案：A解析：IgG1与ProteinA结合力强，需pH3.0以下才能高效洗脱，但低pH诱导Fab区部分去折叠，疏水聚集增加；IgG4虽结合弱，但pH4.5洗脱不完全；鼠IgG2apH3.3即可；电导降低无法破坏ProteinA–Fc氢键网络。5.采用HEK293瞬转生产rAAV2时，若三质粒比为pAAV2-ITR:pHelper:pRC=1:1:1，总DNA1.5μg/10⁶cells，则pRC质粒拷贝数约为A.1.5×10⁵B.3.0×10⁵C.4.5×10⁵D.6.0×10⁵答案：B解析：1.5μgDNA对应9.1×10¹¹bp（按1bp=1.1×10⁻¹⁸g）；三质粒等摩尔，则pRC占1/3，质量0.5μg；pRC约7.5kb，故拷贝数=0.5×10⁻⁶g/(7.5×10³×1.1×10⁻¹⁸)≈3.0×10⁵。6.在E.coliBL21(DE3)中表达含12个半胱氨酸的蝎毒肽，最适氧化还原伴侣质粒为A.pGro7(GroEL-GroES)B.pMJS205(DsbCco-expression)C.pTf16(triggerfactor)D.pRIL(raretRNA)答案：B解析：DsbC为周质二硫键异构酶，可纠正错误二硫键配对，提高含多对二硫键蛋白可溶性；GroEL与triggerfactor主要辅助折叠无二硫键蛋白；raretRNA解决密码子偏好，与二硫键无关。7.采用连续流离心分离包含体后，常用2%脱氧胆酸钠洗涤的目的是A.溶解膜蛋白B.断裂核酸C.去除脂多糖D.溶解包含体答案：A解析：脱氧胆酸钠为离子型去垢剂，可溶解细胞膜碎片及膜蛋白，减少后续纯化杂质；核酸断裂需DNase/RNase；LPS去除需TritonX-114相分离；包含体需变性剂溶解。8.关于mRNA疫苗加帽率测定，下列技术中灵敏度最高的是A.反相HPLC-UVB.LC-MS/MSMRMC.放射性α-³²P-GTP掺入D.免疫斑点使用anti-capantibody答案：B解析：LC-MS/MSMRM可检测到0.01%未加帽片段，且可区分Cap0/Cap1；HPLC-UV检测限约2%；放射性法需特殊许可；免疫斑点半定量，灵敏度约1%。9.在双水相体系(ATPS)中提取腺相关病毒，若PEG3350/磷酸钾系统体积比1:1，病毒分配系数K=A.78%B.85%C.89%D.94%答案：C解析：回收率R=10.采用DoE优化细胞培养fed-batch工艺，若研究因素为温度(T)、pH、渗透压(Osm)，响应为滴度(titer)，最适设计为A.全因子2³B.中心复合设计(CCD)C.Box-BehnkenD.D-最优定制答案：B解析：CCD可在三因素下实现二次模型拟合，含中心点与星号点，估计曲率效率高；全因子仅线性；Box-Behnken无角点，可能错过极端条件；D-最优需先验模型。二、配伍题（每空1.5分，共15分）A.亲和层析 B.离子交换 C.疏水层析 D.尺寸排阻 E.羟基磷灰石11.去除rFVIII中分子量大于500kDa的聚集体______12.捕获分泌型VHH抗体，其等电点9.2，培养上清pH7.4______13.从E.coli裂解液中初步捕获带Strep-tagII的重组蛋白______14.在流穿模式下去除宿主细胞DNA，最佳配基为______15.利用钙离子与磷酸基团相互作用纯化腺病毒______答案：11-D 12-B 13-A 14-B 15-E解析：11.SEC按分子量分离；12.VHHpI高，在pH7.4带正电，可用阳离子交换结合；13.Strep-Tactin为亲和配基；14.DNA带负电，在高电导下流穿，阳离子交换结合目标抗体；15.羟基磷灰石Ca²⁺与病毒衣壳磷酸化丝氨酸相互作用。三、名词解释（每题4分，共20分）16.糖基化宏观异质性答案：指同一蛋白在不同表达位点或批次中，N-糖链整体类型（高甘露糖、杂合、复杂）比例发生显著变化，导致药效学差异，如抗体CDC活性降低。17.自剪切肽（P2A）答案：由18个氨基酸组成的短肽，其C端consensusmotif(DxExNPGP)可在核糖体内部诱导“跳跃”机制，实现一条ORF翻译后断裂成两个独立蛋白，用于多基因单载体表达。18.质量源于设计(QbD)中的设计空间答案：经风险评估与DoE验证的多维工艺参数组合区域，在此范围内操作可确保关键质量属性(CQA)符合标准，无需额外监管审批。19.反义寡核苷酸gapmer答案：中央7–10个DNA核苷酸（gap）两侧各3–5个2'-O-Me或LNA修饰核苷酸，可招募RNaseH降解靶mRNA，兼具稳定性与催化活性。20.单域抗体(sdAb)人源化中的“框架区嫁接”答案：将骆驼科VHH的CDR环移植到人VH3-23框架，保留关键Vernier残基（如F42、G49、L50）以维持canonical结构，降低免疫原性。四、简答题（每题8分，共24分）21.简述提高CHO细胞瞬转表达量的三大策略及其机制。答案：(1)载体优化：使用含MARs（matrixattachmentregions）的骨架，如pCHO-MAR1，可在48h内形成开放染色质，使转录活性提升4–6倍。(2)转染试剂升级：采用PEI-Max40kDa与胆固醇共轭物，电荷比(N/P)=3:1时，内吞效率提高至92%，且溶酶体逃逸增加2.3倍。(3)冷休克联合丁酸钠：转染后6h将温度降至32°C并添加3mM丁酸钠，可抑制组蛋白去乙酰化酶，延长mRNA半衰期（t₁/₂由6h增至14h），最终滴度由0.8g/L提升至2.1g/L。22.说明利用LC-MS进行ADC药物DAR值测定的完整流程与数据解析公式。答案：步骤：①用IdeS酶切获得Fc/2与F(ab')2；②还原烷基化后，RPLC分离轻链(L0–L4)与重链(H0–H4)；③高分辨MS采集，提取各组分去卷积质量；④计算加权平均DAR：D其中为负载i药物的轻链MS峰面积；⑤系统适用性：RSD<3%，与UV-HIC结果偏差<5%。23.比较昆虫杆状病毒系统(BEVS)与植物瞬时表达系统生产VLP的优缺点。答案：BEVS优点：①糖基化与人相似度>70%；②可放大至500LWave，滴度达2g/L；③已有FDA批准Flublok疫苗平台。缺点：①需建立病毒种子库，周期8周；②杆状病毒基因组易丢失，导致批次差异；③成本$150/g。植物系统优点：①农杆菌渗透3d即可收获，周期短；②无动物源污染；③放大至1000kg叶片/批次，成本$30/g。缺点：①植物核心α-1,3-岩藻糖与β-1,2-木糖免疫原性高；②叶绿素与酚类残留需额外纯化；③法规路径尚不成熟。五、计算题（共21分）24.（10分）某IgG4抗体在pH5.0、电导8mS/cm条件下进行阳离子交换层析，其氨基酸序列含12个质子化组氨酸(pKa6.0)、2个天冬氨酸(pKa3.9)、5个谷氨酸(pKa4.2)。假设表面可及比例为60%，求该条件下平均净电荷Z；若流速180cm/h，柱高10cm，理论塔板高度H=0.02cm，求理论塔板数N；并预测保留因子（已知∝答案：(1)计算质子化比例：组氨酸：=Asp：=Glu：=(2)净电荷：Z表面可及60%，有效电荷=+(3)塔板数：N(4)保留因子：=25.（11分）某企业拟将抗PD-1单抗从500mg/L瞬转滴度放大至10000L规模，采用ProteinA捕获+低pH病毒灭活+阴离子流穿模式。已知ProteinA动态结合载量(DBC)为35g/L，柱床高度20cm，流速300cm/h，循环时间2.5h。求所需层析柱直径；若病毒灭活体积为柱洗脱体积1.2倍，灭活pH3.6，时间60min，需配制多少体积的3M柠檬酸缓冲液；最终超滤浓缩倍数20倍，回收率92%，求最终原液蛋白质量。答案：(1)总蛋白量：10所需柱体积：=柱直径：D=(2)洗脱体积：按85%回收，洗脱峰约1.5倍柱体积→215L；病毒灭活体积=215×1.2=258L；3M柠檬酸加至pH3.6需体积==(3)超滤前蛋白：5000kg×0.85=4250kg；浓缩20倍后体积500L，质量4250kg×0.92=3910kg。六、综合设计题（共20分）26.设计一个利用CRISPR-Cas12a在基因组安全港位点(AAVS1)定点整合表达GLP-1-Fc融合蛋白的完整方案，包括：①供体模板设计（含启动子、polyA、筛选标记）；②crRNA选择与脱靶评估；③整合后Pool筛选策略；④稳定性考察指标与时间节点；⑤质量分析需检定的CQA与所用方法。答案：①供体模板：5'同源臂800bp（chr19:55765910–55766710）；EF1α-short-HTLVcompositepromoter+GLP-1(A8G)mutant(31aa)+G₄Slinker+humanIgG4Fc(S228P)+SV40latepolyA；下游同向loxp-PuroR-loxp；3'同源臂800bp；总量4.2kb，克隆至pUC57-simple，酶切游离。②crRNA：靶向AAVS1site1：5'-TTTCTGACCCATAGCCACCAT-3'（PAMTTTV）；脱靶分析：Cas-OFFinder允许3错配，预测0个外显子位点；合成crRNA-ATTO550标记，转染效率>85%。③Pool筛选：Day3加1μg/mLpuromycin，持续7d；Day10FACS分选ATTO550⁺/GFP⁺双阳性top5%；Day14qPCR检测整合拷