感染性疾病基因测序技术应用指南（2025年版）

感染性疾病基因测序技术应用指南（2025年版）感染性疾病基因测序技术作为精准医学时代的核心工具之一，其应用已从实验室研究逐步转向临床常规检测。本指南基于当前技术发展水平、临床需求及循证医学证据，系统规范感染性疾病基因测序的全流程操作，涵盖样本管理、技术选择、质量控制、结果解读及临床应用等关键环节，旨在为医疗机构、检验实验室及临床医师提供可操作的技术指导。一、技术原理与适用场景感染性疾病基因测序技术通过检测病原体核酸（DNA或RNA）实现病原体的快速识别与特征分析，主要包括宏基因组测序（mNGS）、靶向测序（TargetedSequencing）及单细胞测序三大技术路径。宏基因组测序（mNGS）无需预设病原体，通过对样本中所有核酸（包括宿主及病原体）进行高通量测序，经生物信息学分析富集病原体序列，适用于以下场景：①疑似感染但传统检测（培养、抗原/抗体检测）阴性的疑难病例；②多重感染（如细菌、真菌、病毒混合感染）的全面筛查；③未知病原体或新发突发传染病（如新型冠状病毒、不明原因肺炎）的溯源；④免疫功能低下患者（如肿瘤放化疗、器官移植受者）的机会性感染检测。靶向测序通过设计特异性引物或探针，富集目标病原体的特定基因（如16SrRNA、ITS、耐药基因），具有灵敏度高、成本低、检测周期短的优势，适用于：①已知病原体的精准分型（如结核分枝杆菌的耐药突变检测）；②流行病学追踪（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的spa分型）；③特定病原体的定量检测（如HIV病毒载量监测）。单细胞测序通过分离单个病原体或感染宿主细胞，分析其基因组或转录组特征，主要用于研究病原体异质性（如耐药亚群的鉴定）及宿主-病原体互作机制，目前临床应用尚处于探索阶段。二、样本管理规范样本质量直接影响测序结果的准确性，需严格遵循以下管理要求：（一）样本采集1.样本类型选择：根据感染部位选择最接近感染灶的样本。血流感染首选静脉血（EDTA抗凝，2-4管，每管5-10mL）；呼吸道感染推荐肺泡灌洗液（BALF）或深部痰液（需指导患者清水漱口后深部咳出，避免口咽定植菌污染）；中枢神经系统感染优先采集脑脊液（CSF，无菌管收集，2-5mL）；组织样本需无菌活检，避免坏死组织污染；怀疑病毒感染时，咽拭子、鼻拭子需用病毒保存液（含RNA酶抑制剂）采集。2.采集时机：抗菌药物使用前采集样本，若已用药需在药物浓度低谷期（如β-内酰胺类药物给药后4-6小时）采集。发热患者建议在体温上升期（寒战期）采集血液样本，提高病原体检出率。3.无菌操作：所有采集过程需严格无菌，避免环境微生物（如空气中的真菌孢子、皮肤定植菌）污染。穿刺类样本（如CSF、关节液）需在消毒皮肤后进行，避免表面菌群混入。（二）样本运输与保存1.运输条件：DNA样本（细菌、真菌）可在4℃保存24小时内运输，长期保存需-20℃；RNA样本（病毒、衣原体）需在采集后2小时内置于-80℃或使用RNA保护液（如AllProtect），运输时采用干冰（-78.5℃）。2.标识与记录：样本管需标注患者姓名、ID、采集时间、样本类型及临床诊断（如“疑似隐球菌脑膜炎”），同时填写检测申请单，注明抗菌药物使用史、免疫状态（如CD4+T细胞计数）及关键临床指标（如C反应蛋白、降钙素原）。（三）样本预处理1.宿主核酸去除（仅mNGS需要）：通过差异裂解（如使用含皂苷的缓冲液裂解宿主细胞，保留病原体）或外切酶消化（如使用核酸外切酶V消化线性宿主DNA，保留环状病原体DNA）减少宿主背景，提高病原体序列占比（目标：病原体序列占比≥0.1%）。2.核酸提取：细菌、真菌选用柱式提取法（如QiagenDNeasy），病毒RNA选用磁珠法（如天隆科技病毒RNA提取试剂），确保核酸浓度≥10ng/μL（DNA）或≥5ng/μL（RNA），A260/A280比值在1.8-2.0（DNA）或1.9-2.1（RNA）之间。3.质量初筛：通过qPCR检测内参基因（如人类β-actin）评估宿主核酸残留量，若宿主DNA占比＞95%，需重新处理样本或增加测序数据量。三、测序与数据分析流程（一）测序平台选择根据检测需求选择测序平台：mNGS推荐IlluminaNovaSeq（短读长，准确性高，适合细菌、真菌）或OxfordNanoporeMinION（长读长，实时分析，适合病毒全基因组组装）；靶向测序推荐IlluminaMiSeq（中通量，成本低）或PCR+一代测序（如Sanger测序，用于耐药突变验证）。测序数据量需满足：mNGS≥20Mreads（PE150），靶向测序≥1Mreads（覆盖度≥1000×）。（二）数据分析流程1.原始数据过滤：去除低质量reads（Q值＜20）、接头序列及宿主序列（比对人类基因组GRCh38），保留有效数据。2.物种注释：将有效序列比对至综合数据库（如NCBINT/NT、RefSeq、MegaRes），采用k-mer分析（如Kraken2）结合比对得分（如BLASTne-value＜1e-5）进行物种分类，鉴定至种水平（需≥20条唯一比对reads）或属水平（≥50条）。3.功能基因分析：针对细菌、真菌，检测耐药基因（如CARD数据库）、毒力因子（如VFDB）及致病岛；针对病毒，分析变异位点（如SARS-CoV-2的刺突蛋白突变）及分型（如流感病毒的HA/NA亚型）。4.丰度校正：通过RPKM（ReadsPerKilobaseperMillion）或TPM（TranscriptsPerMillion）校正病原体丰度，结合样本类型（如BALF中病原体丰度＞1000RPKM提示感染，口咽拭子需＞10000RPKM）排除定植菌。（三）质量控制指标1.测序质量：Q30（碱基质量≥30的比例）≥85%，GC含量与预期病原体匹配（如GC%异常需排查污染）。2.分析质量：阳性对照（如已知浓度的金黄色葡萄球菌DNA）检出率≥95%，阴性对照（无核酸水）病原体序列数＜5条（排除环境背景菌）。3.生信流程验证：每季度使用标准品（如ATCC菌株）验证分析流程，确保物种鉴定准确率≥98%，耐药基因检测假阳性率＜1%。四、结果解读与临床应用（一）结果报告规范测序报告需包含以下内容：①检测方法（如“宏基因组测序，IlluminaNovaSeq平台”）；②病原体信息（名称、丰度、耐药/毒力基因）；③关键质量指标（有效数据量、宿主序列占比、阳性/阴性对照结果）；④临床建议（如“检出耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌，建议结合药敏试验调整为多粘菌素+替加环素”）。（二）致病性判断标准1.确定致病：①血液、CSF等无菌部位检出病原体（如血流中检出大肠埃希菌）；②病原体丰度显著高于背景（如BALF中肺炎链球菌RPKM＞5000）；③检测到特异性毒力基因（如金黄色葡萄球菌的PVL毒素基因）；④与临床症状高度相关（如流感季节检出流感病毒A/H3N2）。2.可能致病：①定植部位（如痰液）检出条件致病菌（如铜绿假单胞菌）且丰度升高（RPKM＞5000）；②检出低毒力病原体（如凝固酶阴性葡萄球菌）但临床存在感染征象（如中心静脉导管相关发热）；③检测到耐药基因但表型未确认（如携带blaKPC基因的肺炎克雷伯菌）。3.定植或污染：①口咽拭子检出草绿色链球菌（RPKM＜1000）；②皮肤拭子检出表皮葡萄球菌（无局部感染症状）；③阴性对照中检出相同病原体（如环境中的鲍曼不动杆菌）。（三）多学科协作机制临床医师需与检验技师、生信分析师建立协作：①检验技师在报告中标注“需结合临床”的提示；②生信分析师对罕见病原体（如马尔尼菲篮状菌）提供文献支持（如“该菌多见于HIV感染者，CD4+＜200/μL时致病”）；③临床医师综合血常规、影像学（如肺部CT的磨玻璃影）及其他检测（如G试验、GM试验）进行最终诊断。五、数据管理与伦理要求1.数据存储：原始测序数据（FASTQ文件）需加密存储于符合HIPAA标准的服务器，保存期≥5年；分析结果（BAM、注释文件）备份至离线存储设备（如磁带库），防止数据丢失。2.隐私保护：患者信息（姓名、ID）与测序数据分离存储，仅授权人员（临床医师、检验负责人）可访问完整数据，去标识化数据用于研究需经伦理委员会审批。3.数据共享：参与多中心研究时，需签署数据共享协议，明确数据使用范围（如仅限学术研究）及成果归属；公共数据库提交（如NCBISRA）需去除患者标识，确保符合GDPR要求。六、技术挑战与发展方向当前感染性疾病基因测序仍面临以下挑战：①样本污染（如环境中的人型支原体）导致假阳性；②低丰度病原体（如血流中的分枝杆菌）检出率不足；③生信分析标准化缺失（不同数据库注释结果差异可达30%）；④耐药基因与表型的相关性需进一步验证（如某些blaCTX-M亚型可能不导致头孢他啶耐药）。未来发展方向包括：①开发新型去宿主技术（如CRISPR-Cas9特异性切割宿主DNA）；②优化长读长测序（如PacBioHiFi）提高复杂病原体（如真菌）的组装准确性；③构建基于机器学习的病原体识别模型（如结合丰度、毒力基因及临床特征的预测算法）；④推动便携式测序设备（