基因工程的技术手段拓展学习-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

基因工程的技术手段内容导读基因工程的研究难度往往很大，在高考题目中也常出现难题，原因在于基因工程是分子水平的研究，分子无法通过肉眼或显微镜直接观察，需要通过特殊的技术手段操作或检测，无论是其涉及的分子原理、具体操作的过程以及结果的检测，都有复杂的逻辑和分析过程，这是基因工程难度较大的根本原因。学好基因工程需要掌握各种分子生物学手段，理解其原理和应用，以快速准确地理解高考题目的信息。本讲详细梳理出重要且常考的技术手段，大部分技术手段是拓展性的内容，为解决题目打下基础。⿻核心概要1．DNA操作技术2．基因操作技术

3．检测和标记技术

4．转化技术

5．生物信息技术一、DNA操作技术1、DNA的提取与鉴定（1）原理①提取：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。②鉴定：在沸水浴时，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。一、DNA操作技术1、DNA的提取与鉴定（2）步骤①

称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。②

在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放人烧杯中。③

在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。④

取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。一、DNA操作技术1、DNA的提取与鉴定（3）分析①本实验中使用提取方法简单粗放，杂质较多，仅仅是针对高中生的体验性实验，实际的科学研究中，提取方案更复杂，DNA更纯净，以方便PCR等操作。②二苯胺试剂要现配现用（易氧化），否则会影响鉴定的效果。一、DNA操作技术2、DNA的酶切和连接（1）原理基因工程需要对DNA进行重组，即切割和拼接。有多种不同的酶以DNA作为底物，能够发生对DNA进行切割、连接、去末端磷酸化等反应。利用这些酶可以对DNA进行操作，以获取目的基因、连接不同基因结构等。其中最重要的是利用限制性内切核酸酶切割DNA，及利用DNA连接酶连接DNA。一、DNA操作技术2、DNA的酶切和连接（2）限制性内切核酸酶（简称限制酶）①功能限制性内切核酸酶功能辨析a．核酸酶：切割DNA的酶，体现酶的专一性。b．内切酶：从内部切割，和外切酶（水解酶）作用位置相反。c．限制性：识别特定的序列，能体现其作用的特异性。黏性末端切割与平末端切割一、DNA操作技术2、DNA的酶切和连接（2）限制性内切核酸酶（简称限制酶）黏性末端切割知识延伸①功能a．限制酶首先切割磷酸二酯键，断开骨架结构。b．黏性末端之间的氢键自然断裂，形成单链的黏性末端c．互补黏性末端可断开，又可相互不稳定结合，具有“黏性”。d．黏性末端的结合具有特异性。※由于黏性末端具有特异性，可以保证DNA连接时具有特异性，因此在实验设计中，通常选择黏性末端切割，而避免使用平末端切割。一、DNA操作技术2、DNA的酶切和连接（2）限制性内切核酸酶（简称限制酶）②常考限制酶及识别序列一、DNA操作技术2、DNA的酶切和连接（2）限制性内切核酸酶（简称限制酶）③限制酶拓展限制酶的来源和命名a．来源：主要从原核生物中分离纯化，迄今已从300多种不同的微生物中分离出4000种限制酶，有600种可商业化供应。b．命名：根据来源细菌种类而定（如大肠杆菌Escherichiacoli）。c．作用：用于切割注入的噬菌体DNA思考：为什么细菌的DNA不会被切割？※由于限制酶具有特异性，识别特定的DNA序列，因此宿主细胞不具有相应的序列，或序列被修饰，即可避免细菌DNA被切割一、DNA操作技术2、DNA的酶切和连接（2）限制性内切核酸酶（简称限制酶）③限制酶拓展限制酶识别特异性a．回文序列：识别位点一般是相反的互补序列，切割后获得的黏性末端完全相同。b．碱基数量：识别位点一般是6核苷酸序列，但也有限制酶可识别4核苷酸序列、8核苷酸或其他数量。c．特异性：同一限制酶也可识别多个序列，不同限制酶可识别同一序列（同裂酶）。一、DNA操作技术2、DNA的酶切和连接（2）限制性内切核酸酶（简称限制酶）③限制酶拓展特殊限制酶一、DNA操作技术2、DNA的酶切和连接（3）DNA连接酶①功能a．原理：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，连接形成磷酸二酯键。b．方式：一、DNA操作技术2、DNA的酶切和连接（3）DNA连接酶②应用在实际使用中一般选择黏性末端连接，可以通过互补的黏性末端控制连接位点，避免错误连接。③DNA相关酶总结一、DNA操作技术3、PCR技术（1）原理①基本原理：PCR是聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。一、DNA操作技术3、PCR技术（1）原理②体内DNA复制和PCR的比较一、DNA操作技术3、PCR技术（2）PCR的过程一、DNA操作技术3、PCR技术（2）PCR的过程①为什么PCR不使用解旋酶，而使用高温加热使DNA变性呢？②PCR的温度设置由什么因素决定？③PCR的时间设置由什么因素决定？使用解旋酶无法控制DNA多次连续复制，通过高温控制变性可以多次连续复制。a.变性的温度由GC含量决定，GC含量越高，DNA结构越稳定，则变性温度越高。b.复性温度由引物的长度和GC含量决定，一般复性温度比变性温度低25℃，如果复性温度过低，会导致非特异性结合增加。c.延伸的温度是Taq酶的最适温度，由Taq酶的种类决定，最常见的Taq酶最适温度是72℃。变性的时间（30s）和复性的时间（30s）往往是固定的，延伸的时间由子代DNA的长度决定，DNA越长，则延伸的时间越长。一、DNA操作技术3、PCR技术（3）PCR的结果一、DNA操作技术3、PCR技术（4）PCR技术的拓展①利用引物诱变DNA分子原理：引物会成为子代DNA分子的一部分，如果改变引物的序列，使其能与模板DNA结合，但个别碱基不与模板互补配对，就能获得碱基改变的子代DNA分子。应用：对目的基因进行编辑，改变蛋白质结构和对应性状。一、DNA操作技术3、PCR技术（4）PCR技术的拓展②利用引物添加酶切位点原理：与定点诱变相似，在引物的

5'末端添加一段额外的酶切序列，尽管其不能和模板链互补结合，但可以作为子代DNA的一部分，从而使子代DNA出现额外的酶切位点。应用：可以根据需要修改目的基因末端的酶切位点，方便酶切操作。一、DNA操作技术3、PCR技术（4）PCR技术的拓展③利用PCR检测目的基因原理：引物与目的基因的结合具有特异性，利用特定引物与可能含目的基因的DNA混合进行PCR。如果DNA含有目的基因，则可通过PCR扩增获得目的基因。如果DNA不含目的基因，则引物不会和目的基因结合，或结合非特异性片段，不会扩增获得目的基因。应用：可在基因工程中检测特定DNA分子。一、DNA操作技术3、PCR技术（5）PCR的种类①重叠延伸PCR原理：拼接两个或多个DNA序列，可以使用末端可以连接的特殊引物。设计引物使一个DNA分子的5'端重复序列与另一个DNA分子的3'端有同源互补序列，从而使子代DNA获得其他DNA的同源序列。在后续循环延伸的过程中，具有同源序列的两个DNA单链末端互补桥接，DNA聚合酶会沿着桥接上的长DNA单链补全碱基，从而形成完整的拼接后DNA双链。用途：可以将几段较小的DNA按照顺序连接形成较大的DNA，且不需要限制酶。一、DNA操作技术3、PCR技术（5）PCR的种类②不对称PCR原理：不对称PCR的基本原理是采用不等量的一对引物，经若干次循环后，低浓度的引物被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物，结果产生大量的单链DNA。用途：产生单链DNA，用于做测序模板、杂交探针等一、DNA操作技术3、PCR技术（5）PCR的种类③反转录PCR（RT-PCR）原理：利用RNA

为模板链，通过逆转录获得互补DNA（cDNA），再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。用途：可用于检测RNA（如病毒的RNA），或检测基因的表达情况。也可以利用mRNA作为基因来源获得目的基因，这样的基因没有内含子，方便在不同细胞中的表达。一、DNA操作技术3、PCR技术（5）PCR的种类④实时定量荧光PCR（qPCR）原理：指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。用途：可用于监测DNA复制的数量，qPCR可以与RT-PCR结合，对病毒核酸进行检测。一、DNA操作技术3、PCR技术（5）PCR的种类⑤反向PCR原理：反向PCR(inverse-PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，与常规PCR相比，反向PCR扩增的方向相反，且扩增的DNA序列是未知的。用途：可以对未知DNA片段进行扩增，以研究其基因序列等信息一、DNA操作技术3、PCR技术（6）PCR考点总结PCR的引物选择和设计①定义：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。②作用：引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。因为引物作为子代DNA复制的起点，所以引物也是子代DNA的末端。③引物的设计a．引物需要与目的基因两端对应序列特异性互补配对结合，长度通常为20~30个碱基，太短会导致结合特异性低，容易结合非特异性片段。b．引物内部不能配对形成双链结构（发卡结构），两个引物间不能配对结合。c．可以根据题目要求，修改引物序列，如定点诱变、5'端添加酶切位点、添加多重PCR的同源序列等。引物的作用①起始DNA复制②标定复制起点③DNA序列鉴定④添加酶切位点一、DNA操作技术4、DNA测序技术（1）原理DNA测序指的是分析未知DNA的碱基排列顺序，以了解基因的基本信息，用于研究基因的结构和功能等。DNA测序技术有两代，第一代测序技术为生物化学家桑格（FrederickSanger）发明的双脱氧链终止法，也称桑格测序法（Sangermethod）；第二代是测序技术现有多种不同方法，特点是可以更大规模、更高效率的测序。（2）双脱氧链终止法测序①原理：dNTP（脱氧核苷酸）是DNA复制的原料，可以正常延伸DNA分子，ddNTP（双脱氧核苷酸）由于在3号碳位置脱氧，无法用于延伸DNA分子，会使DNA复制终止。通过在PCR中同时提供dNTP和ddNTP做原料，随机终止DNA的复制，可以获得长度相差一个核苷酸的若干子代DNA分子，通过电泳技术分离长度不同的DNA分子，即可读取DNA的序列信息。一、DNA操作技术4、DNA测序技术（2）双脱氧链终止法测序一、DNA操作技术4、DNA测序技术（2）双脱氧链终止法测序③优点和缺点a．优点：桑格测序法准确度很高，可以测量最多700~900个碱基的序列，可以用于重要序列或突变位点的确认。b．缺点：桑格测序法一次只能测量一个DNA序列，流程较复杂，无法处理大量的DNA数据。（3）第二代测序技术①原理：第二代测序技术是高通量测序技术，可以一次对数十万条以上的DNA分子进行测序，提高了测序的效率，降低了单碱基的测序成本。其基本原理是将DNA分子打断成短的DNA片段（100~800bp），然后借助不同原理和大型仪器同时对每个短DNA同时进行测序，获得大量短DNA序列数据，最后利用生物信息学方法对数据进行比对和分析，得到总的DNA序列。一、DNA操作技术4、DNA测序技术（3）第二代测序技术③优点和缺点a．优点：第二代测序的主要优点是高通量、速度快，可以在短时间内处理大量的数据，完成全基因组测序。b．缺点：第二代测序技术错误率相对较高，需要处理的数据较多，往往需要已有数据库比对，技术比较复杂。一、DNA操作技术5、电泳分离DNA技术（1）原理①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。②在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。一、DNA操作技术5、电泳分离DNA技术（2）步骤①将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器（如移液枪）将混合液缓慢注入凝胶（凝胶中含核酸染料）的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。②接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。③取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。一、DNA操作技术5、电泳分离DNA技术（3）分析①DNA标准参照物：一种用于确定目的DNA片段大小的标准参照物，具有特定的DNA分子大小，一般置于第一个点样孔中，标识样品的DNA大小。②核酸染料和指示剂a．指示剂是一种有颜色的标记物，相当于一个较小的DNA分子，但不与DNA结合，在电泳时移动较快并可被肉眼观察到，用于指示样品的迁移过程，常用指示剂包括溴酚兰（蓝紫色）和二甲苯青（蓝色）。b．核酸染料是一类能够与DNA或RNA分子结合，并在特定条件下显示颜色或荧光的化学物质，用于电泳后检测核酸的位置。一、DNA操作技术6、人工合成DNA（了解）（1）原理获取目的基因的方式有两类，一类是从生物体内的DNA或mRNA中获取目的基因，并进行扩增、改造、表达等。另一类就是利用化学方法，人工合成DNA片段，例如固相亚磷酸铵三酯法，目前已可合成10kb以上的DNA片段。（2）优点可以根据需求合成DNA片段，不受天然DNA的限制。二、基因操作技术1、基因的复制与表达（1）原理基因在细胞的稳定复制需要有复制原点，基因的表达则需要启动子和终止子，在研究中一般通过各种载体，提供不同的结构，从而促进基因的复制和表达，其中最常用的载体是质粒。噬菌体、动植物病毒等也可作为载体使用。二、基因操作技术1、基因的复制与表达（2）质粒①概念：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA

之外，并且具有自我复制能力的很小的双链环状DNA

分子。②来源：来自细菌或酵母菌，天然质粒需要人工改造。③种类：根据功能可以将质粒分为克隆载体和表达载体两种常用载体，此外有些载体还能起到基因编辑、基因敲除的功能，这里我们学习最常用的表达载体。④结构二、基因操作技术1、基因的复制与表达（2）质粒⑤原理：将目的基因插入质粒中，导入受体细胞，可以在受体细胞内稳定传递和表达。⑥拓展：表达载体既能稳定复制，也能促进目的基因的表达，但克隆载体只需要促进基因在宿主细胞内的复制，不用表达，因此与表达载体相比，克隆载体的目的基因不需要启动子和终止子的结构。⑦表达载体构建的问题二、基因操作技术1、基因的复制与表达（3）病毒载体（了解）①腺病毒载体腺病毒是一种DNA病毒。它通过内吞进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。可以利用其DNA进行转基因、基因编辑、基因沉默等操作。二、基因操作技术1、基因的复制与表达（3）病毒载体（了解）②慢病毒载体慢病毒是一种RNA逆转录病毒，可以将目的基因导入宿主细胞基因组DNA上，从而实现稳定的遗传。二、基因操作技术1、基因的复制与表达（3）病毒载体（了解）③λ噬菌体载体λ噬菌体是一种温和噬菌体，可以将基因整合到宿主细胞基因组DNA上，经过改造的λ噬菌体可以不裂解宿主细胞，从而作为基因载体。二、基因操作技术2、基因编辑技术（1）定义基因编辑也叫基因组编辑，是指在活体基因组中进行DNA插入、删除、修改或替换的一项技术，从而对活的生物的遗传特性进行定向改造。基因编辑技术有很多手段，如锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）和CRISPR-Cas9等，目前CRISPR-Cas9是应用最为广泛的技术，其发明者获得了2020年诺贝尔生理学和医学奖，也常作为题目的考点。二、基因操作技术2、基因编辑技术（2）CRISPR-Cas9基因编辑技术①分子组成：CRISPR-Cas9系统由两种关键分子组成，分别是

Cas9

和向导RNA（guideRNA，简称

gRNA）。a．Cas9是一种核酸内切酶，可以在基因组DNA的特定位置切断两条DNA链，这样就可以添加或移除DNA片段。b．向导RNA（gRNA）是一小段特定序列的RNA序列，约20个碱基长，能与具有互补序列的DNA结合。预先设计好gRNA序列，可以与目的DNA片段特异性结合，引导Cas9在对应的正确位置进行切割。二、基因操作技术2、基因编辑技术（2）CRISPR-Cas9基因编辑技术②作用原理a．向导RNA序列经人工设计，可以特异性识别和结合基因组中目标DNA序列。b．Cas9与向导RNA形成复合体，跟随引导RNA到达DNA序列中的相同位置，并切割DNA的双链，产生断裂。c．细胞识别出已受损的DNA并进行修复，过程中引入突变，从而实现基因的敲除、插入或替换。d．科学家可以利用DNA修复机制对目标细胞基因组中的一个或多个基因进行定向诱变。二、基因操作技术2、基因编辑技术（2）CRISPR-Cas9基因编辑技术②作用原理二、基因操作技术2、基因编辑技术（2）CRISPR-Cas9基因编辑技术④应用和优缺点a．应用：通过基因编辑可以对任何生物在活细胞内原位进行基因编辑，具有广泛的应用前景，如遗传病治疗、疾病预防、性状改造等。b．缺点：gRNA可能会出现非特异性结合导致脱靶效应，导致编辑失败甚至错误编辑。二、基因操作技术2、基因编辑技术（2）CRISPR-Cas9基因编辑技术③作用过程：可以通过质粒构建CRISPR-Cas9基因编辑系统a．构建包含Cas9蛋白和gRNA编码序列的重组质粒b．导入受体细胞c．基因表达相关物质并形成复合体d．gRNA引导的Cas9靶向DNA切割e．对目标基因进行基因编辑二、基因操作技术3、基因沉默技术（※）（1）定义与基因“表达”相反，基因“沉默”指的是细胞的基因表达受到抑制，即基因存在于细胞内，但是不表达或表达量降低。根据来源不同，基因沉默可分为细胞调控的基因沉默和人为操作的基因沉默。在生物体内，基因的表达受到严格调控，而基因沉默就是一种重要的基因表达调控方式，自然发生的基因沉默可通过多种因素实现，如

DNA甲基化（表观遗传）、异染色质形成（如巴氏小体）、转录后基因沉默（RNA干扰）等。而在科研中，也可以通过多种技术手段实现人工的基因沉默，以研究基因的功能。较为常用的基因沉默技术是RNA干扰技术，以下为RNA干扰技术的介绍。二、基因操作技术3、基因沉默技术（※）（2）RNA干扰沉默基因①原理：通过小干扰RNA（siRNA）分子与目的基因的mRNA结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），降解单链的靶mRNA，达到沉默基因的目的，这是最用的基因沉默技术。二、基因操作技术3、基因沉默技术（※）（2）RNA干扰沉默基因②操作a．设计RNA：根据目标基因的序列，设计并合成能与目标基因特异结合的RNA。b．合成和转化：合成沉默用的RNA分子，转入目的细胞中。c．沉默目的基因：转录后形成的siRNA在细胞内与目标基因结合，抑制目标基因的表达。d．验证效果：通过RT-PCR、抗原-抗体杂交等技术检测目标基因的表达水平，评估基因沉默效果。二、基因操作技术4、基因敲除技术（1）定义与基因沉默不同，基因敲除通过生物技术手段，将细胞内的目的基因完全失活，用于研究基因功能。有多种技术可以实现基因敲除，例如通过CRISPR-Cas9基因编辑技术特异性破坏目的基因的部分碱基序列就可以实现基因敲除，也可以通过同源重组技术实现。以下介绍同源重组（Cre-lox系统）在基因敲除中的作用。二、基因操作技术4、基因敲除技术（2）通过Cre-lox系统进行基因敲除①系统组成a．LoxP位点：一段可以被识别的特定DNA序列，具有方向性（用一般用►和◄表示其方向），其特征结构为：ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。两边反向互补的13个碱基为可被Cre重组酶识别的回文序列，中间的碱基决定了Lox的方向，也是重组发生位置。b．Cre重组酶：Cre重组酶来源于P1噬菌体，能特异性地识别LoxP位点，并催化DNA分子在LoxP位点之间的重组。②作用原理Cre重组酶催化两个loxP位点之间的序列特异性重组，这两个位点可以位于同一或不同的DNA片段上。单个loxP位点上的序列被Cre蛋白识别和结合，然后两个loxP位点以平行方向排列，每个loxP位点的核心间隔区内发生双链DNA断裂，两条链之间连接在一起，导致相互交叉事件。二、基因操作技术4、基因敲除技术（2）通过Cre-lox系统进行基因敲除③结果：根据loxP位点的位置和方向，该过程一般有三种结果：a．倒位：如果loxP位点位于同一DNA链上且方向相反，loxP位点间的序列会发生翻转，会导致染色体倒位。b．删除：如果loxP位点位于同一DNA链上且方向相同，loxP位点之间的序列将被切除，切下的序列为环状DNA（并且不会保留）。c．易位：如果loxP位点位于不同的DNA分子上，则loxP位点之间的DNA片段会发生交换或染色体易位。三、检测和标记技术1、标记基因及检测（1）定义标记基因（markergene）是一种能够起特异性标记作用的基因。通常用来检验重组DNA载体转化成功与否，或者检测目的基因在植物细胞或组织中的定位。（2）类型常用的标记基因有三种分别是抗性基因、荧光基因和营养物质合成基因。三、检测和标记技术1、标记基因及检测（2）类型①抗性基因：抗性基因是最常用的标记基因，包括用于微生物的抗生素抗性基因，及植物常用的抗除草剂基因。将抗性基因其导入敏感型的宿主细胞中，并添加抗生素或除草剂，可以淘汰转化失败的细胞，筛选出转化成功的细胞。在题目中最常出现的抗性基因有：氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）及卡那霉素抗性基因（kanr）等三、检测和标记技术1、标记基因及检测（2）类型②荧光基因：荧光基因可以表达出荧光蛋白，荧光蛋白可被激发出荧光，从而被观察到。将荧光基因作为标记基因转入各类细胞中，都可以通过荧光检测转入是否成功。③营养物质合成基因：用营养缺陷型的微生物作为转基因的宿主时，可以使用营养物质合成基因作为标记基因，例如与野生型相比，亮氨酸合成缺陷型酵母菌在不含亮氨酸的培养基中不能生存，将亮氨酸合成基因作为标记基因导入亮氨酸合成缺陷型酵母菌，转入成功的酵母菌可以形成菌落，转入失败的酵母菌不能生存。三、检测和标记技术1、标记基因及检测（3）双标记分析①原理：目的基因与标记基因是两个不同的基因，通过标记基因检测成功只能说明标记基因进入受体细胞并表达，目的基因未必进入受体细胞，比如可以是转入空载体的情况。为了证明目的基因正常转入，一般会增加一个标记基因，在构建表达载体时保留一个标记基因的同时，而破坏另一个标记基因，以证明目的基因转入。常用的技术手段有双标记技术、蓝白斑筛选技术。三、检测和标记技术1、标记基因及检测（3）双标记分析双标记及影印平板法双标记技术用两个抗性基因做标记基因，通过破坏一个抗性基因证明目的基因正确转入，即转入成功的细胞具有一种抗性而失去另一种抗性，此时需要通过平板影印法证明其抗性，原理如下：三、检测和标记技术1、标记基因及检测（3）双标记分析蓝白斑筛选蓝白斑筛选利用β-葡萄糖苷酸酶基因作为第二个标记基因，β-葡萄糖苷酸酶基因（lacZ）编码β-半乳糖苷酶，在培养基中存在IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的情况下，β-半乳糖苷酶可以催化X-gal（显色底物）产生蓝色的产物，使菌落呈现蓝色。如