探寻膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的内在关联：基于实验与临床的深入剖析

探寻膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的内在关联：基于实验与临床的深入剖析一、引言1.1研究背景膀胱癌是泌尿系统中最为常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的健康。在全球范围内，其发病率和死亡率均呈现出上升的趋势。据统计，膀胱癌在男性泌尿生殖系统肿瘤中的发病率位居首位，在所有恶性肿瘤中排名第八。其发病原因复杂，涉及遗传因素、环境因素如长期吸烟、接触化学物质等。腔内种植转移是膀胱癌的一种特殊转移方式，指的是肿瘤细胞在膀胱腔内脱落，种植在膀胱壁或其他泌尿系统组织上，进而形成新的肿瘤病灶。这种转移方式在膀胱癌的病程进展中起着关键作用，极大地增加了治疗的难度。一方面，腔内种植转移使得肿瘤的范围扩大，手术难以完全切除干净，残留的肿瘤细胞容易复发和进一步转移。另一方面，种植转移后的肿瘤细胞可能对传统的治疗方法如化疗、放疗产生耐药性，导致治疗效果不佳。膀胱癌腔内种植转移对患者的预后产生了极为不利的影响。一旦发生腔内种植转移，患者的生存率会显著降低，生存质量也会受到严重影响。临床数据显示，发生腔内种植转移的膀胱癌患者，其5年生存率相较于未转移患者明显下降。同时，患者可能会出现一系列并发症，如血尿、尿频、尿急、尿痛等，严重影响日常生活。部分患者还可能因肿瘤侵犯周围组织和器官，导致肾功能受损、输尿管梗阻等，进一步危及生命。肿瘤细胞的侵袭力是影响肿瘤转移的重要因素之一。对于膀胱癌而言，具有高侵袭力的膀胱癌细胞更容易突破组织屏障，进入血液循环或淋巴系统，从而发生远处转移。膀胱癌细胞的侵袭力与膀胱癌腔内种植转移之间可能存在着密切的关联。深入研究膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的关系，对于揭示膀胱癌的转移机制、开发新的治疗方法具有重要的理论和实践意义。1.2研究目的本研究旨在构建膀胱癌细胞的高侵袭力亚系，深入观察膀胱肿瘤细胞的侵袭过程，运用该亚系对膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的关系进行研究。通过构建高侵袭力亚系，能够更精准地模拟体内具有高侵袭潜能的肿瘤细胞状态，为后续研究提供更具针对性的实验材料。观察侵袭过程有助于从微观层面揭示肿瘤细胞突破组织屏障的具体机制和动态变化。而探究膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的关系，期望能明确高侵袭力细胞在膀胱癌腔内种植转移中的作用和影响，为理解膀胱癌的转移机制提供新的视角和理论依据，进而为临床开发新的治疗策略和干预手段提供科学指导，改善膀胱癌患者的预后。1.3研究意义深入研究膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移，具有多方面的重要意义。从基础研究角度来看，有助于揭示膀胱癌转移的分子机制。目前对于膀胱癌转移的具体过程和调控机制尚未完全明确，通过对膀胱癌细胞侵袭力与腔内种植转移关系的研究，可以发现其中关键的信号通路、分子标记物等。例如，若能明确某些基因或蛋白在增强膀胱癌细胞侵袭力以及促进腔内种植转移中的作用，将极大地丰富我们对膀胱癌转移机制的认识，为后续的基础研究提供新的方向和靶点。这也为开发新的治疗方法奠定理论基础，通过干预这些关键的分子和信号通路，有可能研发出更有效的治疗药物或手段，从根本上抑制膀胱癌的转移。在临床治疗方面，具有重要的指导价值。一方面，有助于制定更精准的治疗策略。对于具有高侵袭力膀胱癌细胞的患者，其发生腔内种植转移的风险较高，临床医生可以根据这一特点，选择更积极的治疗方案，如在手术基础上，更早地联合化疗、放疗或靶向治疗等，以降低转移风险。另一方面，对评估患者预后意义重大。通过检测膀胱癌细胞的侵袭力相关指标，可以更准确地预测患者是否容易发生腔内种植转移，从而判断患者的预后情况。对于预后较差的患者，给予更密切的随访和个性化的治疗，有助于提高患者的生存率和生存质量。膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的研究，对于攻克膀胱癌这一严重威胁人类健康的疾病具有不可忽视的重要性，有望为膀胱癌的防治带来新的突破和进展。二、膀胱癌细胞侵袭力相关研究2.1膀胱癌细胞侵袭力概述侵袭力是肿瘤细胞的重要生物学特性之一，在肿瘤转移过程中发挥着关键作用。肿瘤转移是一个复杂且多步骤的过程，包括肿瘤细胞从原发灶脱离、侵袭周围组织、进入血管或淋巴管、在循环系统中存活、穿出血管或淋巴管并在远处组织中定植和增殖。其中，侵袭力是肿瘤细胞突破原发部位组织屏障，向周围组织浸润的能力，是肿瘤转移的起始和关键步骤。对于膀胱癌而言，膀胱癌细胞的侵袭力对其发展有着深远影响。高侵袭力的膀胱癌细胞更容易突破膀胱黏膜层，侵犯到膀胱肌层甚至周围组织和器官。当癌细胞突破膀胱黏膜层，侵袭至肌层时，膀胱癌就从非肌肉浸润性膀胱癌发展为肌肉浸润性膀胱癌。肌肉浸润性膀胱癌的恶性程度更高，治疗难度更大，患者的预后也更差。临床研究表明，肌肉浸润性膀胱癌患者的5年生存率明显低于非肌肉浸润性膀胱癌患者。高侵袭力的膀胱癌细胞还更容易发生远处转移。它们能够通过血液循环或淋巴循环，到达身体其他部位，如肺部、骨骼、肝脏等，并在这些部位形成转移灶。一旦膀胱癌发生远处转移，治疗手段往往有限，患者的生存率会急剧下降。因此，深入研究膀胱癌细胞的侵袭力，对于理解膀胱癌的发展机制、制定有效的治疗策略以及改善患者预后具有至关重要的意义。2.2影响膀胱癌细胞侵袭力的因素2.2.1细胞分子层面在细胞分子层面，多种基因和蛋白对膀胱癌细胞侵袭力起着关键的调控作用。Trim59是一种在膀胱癌组织和细胞中高表达的基因。研究表明，通过siRNA干扰技术下调Trim59的表达后，膀胱癌细胞系T24和5637的迁移和侵袭能力显著下降。其作用机制与上皮间质转化（EMT）相关，在Trim59敲低组，T24和5637细胞中Vimentin、N-cadherin等EMT相关蛋白以及MMP-9蛋白的表达均显著降低。这表明Trim59可能通过调节EMT过程以及MMP-9蛋白的表达，来影响膀胱癌细胞的侵袭力。Wnt7a基因也与膀胱癌细胞的侵袭转移密切相关。研究团队通过建立低侵袭和高侵袭能力的膀胱癌细胞系亚群，并进行质谱分析，发现Wnt7a基因的表达与膀胱癌的转移呈现正相关，是膀胱癌的不良预后指标。进一步研究发现，在膀胱癌细胞中，Wnt7a通过激活经典Wnt/β-catenin通路，促进上皮向间质转变以及MMP1和MMP10的表达，进而引发膀胱癌细胞的侵袭转移作用。稳定过表达Wnt7a的膀胱癌细胞在体内体现出更强的肺部转移能力。这说明Wnt7a通过激活特定的信号通路，促进相关蛋白的表达，增强了膀胱癌细胞的侵袭力，从而促进肿瘤的转移。SOX7基因在膀胱癌组织及膀胱癌细胞中低表达，且其表达情况与预后明显相关。过表达SOX7能抑制膀胱癌细胞的侵袭能力，动物实验也表明SOX7在体内抑制膀胱癌细胞的生长。其作用机制是SOX7抑制了wnt/β-catenin信号通路，从而影响了膀胱癌的EMT进程。这表明SOX7作为一种抑制性基因，通过调控信号通路和EMT进程，对膀胱癌细胞侵袭力起到负向调控作用。2.2.2外部环境因素外部环境因素对膀胱癌细胞侵袭力也有着重要影响，其中微环境的作用不容忽视。以CO₂气腹为例，它是腹腔镜手术中常见的操作环境。体外模拟CO₂气腹环境对膀胱癌T24细胞株的生长和侵袭能力有显著影响。研究发现，CO₂气腹压力和时间均是T24细胞体外生长的影响因素，且两者有交互作用。在侵袭能力方面，采用BoydenChamber侵袭小室法判断发现，CO₂气腹环境可改变膀胱癌T24细胞的体外侵袭能力。免疫细胞化学法检测表明，CO₂气腹还会影响T24细胞株MMP-9、CD44v6等蛋白的表达。其中，ICAM-1、CD44V6表达升高，且与作用时间呈相关；E-钙调素的表达减少，随CO₂气腹作用时间呈负相关。整合素α6β4、α2β1的表达无明显改变。这说明CO₂气腹环境可引起体外培养的膀胱癌细胞黏附细胞分子表达改变，可能通过这些分子表达的变化来促进癌细胞的扩散转移能力，进而影响膀胱癌细胞的侵袭力。CO₂气腹还可能通过改变间皮细胞的结构和功能、改变局部微环境、影响肿瘤细胞基因的表达、改变细胞因子分泌等多种机理，综合影响膀胱癌细胞的侵袭力。2.3膀胱癌细胞侵袭力的实验研究方法2.3.1改良侵袭实验筛选高侵袭力亚系改良侵袭实验是筛选高侵袭力膀胱癌细胞亚系的关键方法。该实验利用人工基底膜和孔径为8μm的聚碳酸脂膜来模拟体内细胞外基质和组织屏障。其原理在于，具有高侵袭力的肿瘤细胞能够分泌多种蛋白酶，如基质金属蛋白酶（MMPs）等，这些蛋白酶可以降解人工基底膜中的成分，使肿瘤细胞得以穿过基底膜和聚碳酸脂膜。而侵袭力较弱的细胞则难以突破这一屏障。在具体实验步骤中，首先准备Transwell小室，小室的上层为聚碳酸脂膜，膜上预先铺有一层人工基底膜。将待筛选的膀胱癌细胞系，如BIU-87、EJ、T24等，以一定密度接种于Transwell小室的上层。小室下层加入含有趋化因子的培养基，如胎牛血清，趋化因子能够吸引肿瘤细胞向小室下层迁移。将Transwell小室置于细胞培养箱中，在适宜的温度（37℃）和二氧化碳浓度（5%）条件下孵育一定时间。孵育结束后，取出小室，用棉签轻轻擦去未穿过膜的细胞，而穿过膜并附着在膜下表面的细胞即为具有侵袭能力的细胞。将这些细胞用胰蛋白酶消化后，重新接种培养，经过多次筛选，即可获得具有高侵袭能力的膀胱癌细胞亚系。通过这种方法筛选出的亚系，在后续研究中可用于深入探究膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的关系。2.3.2MTT比色法与Boyden小室侵袭试验结合MTT比色法与Boyden小室侵袭试验的结合，为准确测定膀胱癌细胞的侵袭指数及评估侵袭力提供了有效的手段。MTT比色法的原理是基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将黄色的MTT（四氮唑盐）还原为不溶性的蓝紫色甲瓒结晶，而死细胞则无此功能。结晶的生成量与活细胞数量成正比，通过测定甲瓒结晶在特定波长下的吸光度值，就可以间接反映细胞的数量和活性。Boyden小室侵袭试验则是评估细胞侵袭能力的经典方法。Boyden小室由上下两个腔室组成，中间以聚碳酸脂膜隔开。在上室中加入待检测的膀胱癌细胞，下室加入含有趋化因子的培养基。具有侵袭能力的膀胱癌细胞在趋化因子的作用下，会穿过聚碳酸脂膜上的小孔，迁移到下室。将这两种方法结合，首先进行Boyden小室侵袭试验，在试验结束后，将迁移到下室的细胞用MTT比色法进行检测。具体步骤为，向下室中加入适量的MTT溶液，继续孵育一段时间，使活细胞将MTT还原为甲瓒结晶。然后吸去上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）溶解甲瓒结晶。最后，用酶标仪在特定波长（通常为490nm）下测定吸光度值。根据吸光度值计算侵袭指数，侵袭指数=实验组吸光度值/对照组吸光度值。侵袭指数越高，表明膀胱癌细胞的侵袭力越强。通过这种结合的方法，可以更准确、客观地评估膀胱癌细胞的侵袭力，为研究膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的关系提供有力的数据支持。三、膀胱癌腔内种植转移研究3.1膀胱癌腔内种植转移的现状腔内种植转移在膀胱癌的转移方式中较为常见，是影响膀胱癌患者预后的重要因素之一。膀胱癌腔内种植转移的发生原因较为复杂，主要与手术操作、肿瘤细胞特性以及膀胱微环境等因素相关。手术操作过程中，如经尿道膀胱肿瘤电切术（TURBT），可能会导致肿瘤细胞的脱落。在手术切除肿瘤时，肿瘤组织被切割成小块，这些小块中的肿瘤细胞可能会随着冲洗液扩散到膀胱的其他部位，从而增加了腔内种植转移的风险。研究表明，在TURBT手术中，约有30%-50%的患者可能会出现肿瘤细胞的脱落。若手术器械在操作过程中接触肿瘤组织后未进行彻底的清洗和消毒，再次使用时也可能将肿瘤细胞带到膀胱的其他区域，引发种植转移。肿瘤细胞自身的特性对腔内种植转移起着关键作用。具有高侵袭力的膀胱癌细胞更容易从原发灶脱落，并且具有更强的黏附和定植能力。这些癌细胞能够分泌多种蛋白酶，降解细胞外基质，从而便于它们穿过组织屏障，在膀胱内的其他部位种植生长。肿瘤细胞表面的黏附分子表达异常也会影响其种植转移能力。例如，CD44v6是一种与肿瘤细胞黏附、迁移和侵袭密切相关的分子，在膀胱癌中，CD44v6高表达的肿瘤细胞更容易发生腔内种植转移。膀胱微环境也在膀胱癌腔内种植转移中发挥着重要作用。膀胱黏膜的损伤和炎症会改变微环境的理化性质，为肿瘤细胞的种植提供有利条件。当膀胱黏膜受到损伤时，会释放出多种细胞因子和趋化因子，这些因子能够吸引肿瘤细胞，并促进其在受损部位的黏附和生长。研究发现，膀胱黏膜损伤后，趋化因子CXCL12（SDF-1）的表达会明显增加，它能够吸引表达CXCR4的膀胱癌细胞，从而促进癌细胞的种植转移。膀胱内的尿液成分、酸碱度等因素也可能影响肿瘤细胞的生存和种植能力。在临床现状方面，膀胱癌腔内种植转移给患者的治疗和预后带来了极大的挑战。腔内种植转移导致肿瘤复发率升高，增加了患者再次手术和后续治疗的难度。据统计，发生腔内种植转移的膀胱癌患者，其术后复发率可高达50%-70%。复发后的肿瘤往往具有更强的侵袭性和耐药性，使得治疗效果大打折扣，患者的生存率也显著降低。膀胱癌腔内种植转移还会给患者带来沉重的心理负担和经济负担。由于病情的反复和治疗的复杂性，患者需要长期接受治疗和随访，这不仅影响了患者的生活质量，也给家庭和社会带来了巨大的经济压力。因此，深入研究膀胱癌腔内种植转移的机制，寻找有效的预防和治疗措施，具有重要的临床意义。3.2膀胱癌腔内种植转移的机制探讨3.2.1膀胱黏膜微环境的影响膀胱黏膜微环境在膀胱癌腔内种植转移中扮演着至关重要的角色。当膀胱黏膜受到损伤时，会引发一系列复杂的生理变化。采用胰蛋白酶灌注膀胱的方法对Balb/c雌小鼠的膀胱黏膜进行损伤处理后，小鼠膀胱出现明显充血、水肿和炎症细胞浸润。这种损伤使得膀胱黏膜的屏障功能受损，原本紧密排列的细胞结构被破坏，为肿瘤细胞的黏附和定植提供了机会。肿瘤细胞可以更容易地穿透受损的黏膜层，进入膀胱组织内部，从而增加了腔内种植转移的风险。炎症在膀胱癌腔内种植转移中也起着关键作用。膀胱黏膜损伤引发的炎症反应会吸引大量的炎症细胞聚集，这些炎症细胞会释放多种细胞因子和趋化因子。这些因子一方面可以改变膀胱微环境的理化性质，使其更有利于肿瘤细胞的生存和增殖。另一方面，趋化因子如CXCL12（SDF-1）能够吸引表达CXCR4的膀胱癌细胞。研究表明，胰蛋白酶损伤后的膀胱CXCL12（SDF-1）含量明显增加。高表达的CXCL12与癌细胞表面的CXCR4受体结合，激活一系列信号通路，促进癌细胞的迁移和黏附，使得癌细胞更容易在膀胱黏膜受损部位种植生长，进而促进膀胱癌的腔内种植转移。3.2.2手术相关因素手术相关因素对膀胱癌腔内种植转移率有着显著影响。同期经尿道手术治疗浅表性膀胱癌合并前列腺增生是临床上常见的治疗方式，但其对膀胱癌种植转移率的影响一直存在争议。一些研究认为，同期经尿道手术可能会增加膀胱癌的种植转移风险。在手术过程中，经尿道前列腺切除术（TURP）和经尿道膀胱肿瘤电切术（TURBT）同时进行，手术操作更为复杂，手术时间可能延长。这可能导致膀胱内的肿瘤细胞有更多的机会脱落，并随着冲洗液或手术器械的移动，种植到膀胱颈或前列腺窝等部位。手术过程中的创伤也可能会改变局部组织的微环境，促进肿瘤细胞的黏附和生长。也有研究得出了不同的结论。通过检索国内外关于同期经尿道手术与分期手术治疗浅表性膀胱癌合并前列腺增生的比较研究，并进行Meta分析发现，同期手术组术后复发率统计学上显著低于分期手术组，且5%的同期手术组患者和4.7%分期手术患者发生膀胱颈/前列腺窝复发，两组比较差异无统计学意义。这表明同期经尿道手术治疗浅表性膀胱癌合并前列腺增生并不会增加膀胱颈/前列腺窝种植性转移概率。其原因可能是同期手术一次性解决了膀胱肿瘤和前列腺增生的问题，避免了分期手术中二次手术对膀胱微环境的再次干扰。同期手术可以及时解除下尿路梗阻，改善膀胱的排尿功能，减少尿液潴留对膀胱黏膜的刺激，从而降低了肿瘤复发和种植转移的风险。3.3膀胱癌腔内种植转移的实验研究方法3.3.1裸小鼠膀胱灌注模型裸小鼠膀胱灌注模型是研究膀胱癌腔内种植转移的重要工具，能够较好地模拟体内种植转移过程。在构建该模型时，选取健康的裸小鼠，通常为4-6周龄，体重18-22g。实验前，将裸小鼠禁食不禁水12-24小时，以减少肠道内容物对实验操作的影响。采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉裸小鼠，剂量一般为30-50mg/kg，待小鼠麻醉成功后，将其仰卧固定于手术台上。使用碘伏对小鼠下腹部进行消毒，然后在无菌条件下，经尿道插入特制的细导管，导管的外径一般为0.5-1mm。缓慢注入含有一定浓度膀胱肿瘤细胞的悬液，细胞浓度通常为1×10⁶-1×10⁷个/ml，注入体积约为50-100μl。注入过程中要确保动作轻柔，避免损伤尿道和膀胱黏膜。注入完成后，将小鼠保持仰卧位一段时间，一般为5-10分钟，使肿瘤细胞充分与膀胱黏膜接触，增加种植的机会。之后将小鼠放回饲养笼中，给予正常的饲养条件，自由进食和饮水。在后续的观察过程中，定期对小鼠进行监测。可以通过小动物活体成像技术，观察肿瘤细胞在膀胱内的生长和转移情况。例如，将标记有荧光素酶基因的膀胱肿瘤细胞注入裸小鼠膀胱，通过腹腔注射荧光素底物，利用高灵敏度的CCD成像系统，检测荧光信号的强度和分布，从而实时监测肿瘤细胞的生长和转移动态。也可以在实验结束后，处死小鼠，取出膀胱及周围组织，进行病理切片检查，观察肿瘤细胞的种植部位、浸润深度以及是否发生远处转移等情况。通过裸小鼠膀胱灌注模型，可以深入研究膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的关系，为揭示膀胱癌转移机制提供重要的实验依据。3.3.2大鼠膀胱癌切口种植转移模型构建大鼠膀胱癌切口种植转移模型是研究膀胱癌种植转移的另一种有效方法，有助于深入探讨种植转移率以及药物灌注对其的影响。选用健康的大鼠，如SD大鼠或Wistar大鼠，体重一般在200-250g。实验前同样对大鼠进行禁食不禁水处理，时间为12-24小时。采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，剂量为3-4ml/kg。在无菌条件下，对大鼠下腹部进行消毒，然后在耻骨联合上方1-2cm处做一纵向切口，长度约为1.5-2.5cm。小心分离膀胱，暴露膀胱壁。用微量注射器吸取适量的膀胱肿瘤细胞悬液，细胞浓度一般为5×10⁵-5×10⁶个/ml。在膀胱壁上选择合适的部位，避开大血管，将肿瘤细胞悬液注射到膀胱黏膜下，注射体积为20-50μl。注射完成后，用丝线将膀胱壁切口缝合，再依次缝合腹壁肌肉和皮肤。术后给予大鼠抗生素预防感染，如青霉素，肌肉注射，剂量为2-5万单位/只，连续注射3-5天。在实验过程中，设置不同的实验组，研究药物灌注对种植转移率的影响。对于药物灌注组，在术后7-10天，经尿道插入导尿管，将含有不同药物的灌注液缓慢注入膀胱，灌注液体积一般为1-2ml。灌注后，将大鼠保持仰卧位一段时间，使药物充分与膀胱黏膜接触。药物可以是化疗药物，如丝裂霉素、吡柔比星等，也可以是新型的抗癌药物或生物制剂。在规定的时间点，如术后2-4周，处死大鼠，取出膀胱及周围组织，包括膀胱颈、前列腺窝、盆腔淋巴结等。对这些组织进行病理切片检查，通过显微镜观察肿瘤细胞的种植情况，计算种植转移率。种植转移率=（发生种植转移的大鼠数量/总实验大鼠数量）×100%。通过对比不同实验组的种植转移率，可以评估药物灌注对膀胱癌切口种植转移的影响，为临床预防和治疗膀胱癌腔内种植转移提供实验依据。四、膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移关系的实验分析4.1实验设计4.1.1实验材料准备本实验选用了三种膀胱癌细胞系，分别为BIU-87、EJ和T24。这些细胞系是研究膀胱癌常用的细胞模型，具有不同的生物学特性，能够为研究提供多维度的数据支持。实验动物选取了4-6周龄的裸小鼠，体重在18-22g之间。裸小鼠由于缺乏胸腺，免疫功能缺陷，对异种移植的肿瘤细胞几乎没有免疫排斥反应，是构建肿瘤移植模型的理想动物。在实验前，将裸小鼠置于特定的无病原体环境中饲养，提供充足的食物和清洁的饮用水，以确保其健康状态符合实验要求。实验所需的试剂包括RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT、DMSO、Transwell小室、人工基底膜Matrigel、基质金属蛋白酶（MMPs）抑制剂、趋化因子（如SDF-1）等。RPMI-1640培养基为细胞生长提供了必要的营养物质；胎牛血清中含有多种生长因子和营养成分，能够促进细胞的增殖和生长；胰蛋白酶用于消化细胞，以便进行细胞传代和实验操作；MTT用于检测细胞的活性和增殖能力；DMSO用于溶解MTT还原产物甲瓒结晶；Transwell小室和人工基底膜Matrigel用于构建侵袭实验模型，模拟体内细胞外基质和组织屏障；MMPs抑制剂用于抑制基质金属蛋白酶的活性，研究其对膀胱癌细胞侵袭力的影响；趋化因子SDF-1用于吸引膀胱癌细胞，促进其侵袭和迁移。实验仪器主要有CO₂培养箱、超净工作台、倒置显微镜、酶标仪、离心机、细胞计数板、Transwell小室配套装置等。CO₂培养箱为细胞培养提供了适宜的温度（37℃）、湿度（95%）和二氧化碳浓度（5%）环境；超净工作台用于保证实验操作的无菌环境，防止细胞污染；倒置显微镜用于观察细胞的形态和生长状态；酶标仪用于检测MTT实验中的吸光度值，从而计算细胞活性和侵袭指数；离心机用于分离细胞和培养液，以及进行细胞的洗涤和重悬等操作；细胞计数板用于对细胞进行计数，确定细胞的浓度；Transwell小室配套装置用于组装和进行Transwell侵袭实验。4.1.2实验分组为了深入研究膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的关系，本实验设置了多个实验组和对照组。在侵袭力相关实验中，将三种膀胱癌细胞系BIU-87、EJ和T24分别作为母代细胞组。通过改良侵袭实验，以穿透人工基底膜和孔径为8μm聚碳酸脂膜的能力为依据，筛选出具有高侵袭能力的子代细胞亚系，这些亚系组成高侵袭力亚系细胞组。为了研究MMPs在膀胱癌细胞侵袭过程中的作用，设置了MMPs抑制剂处理组。将高侵袭力亚系细胞分别用不同浓度的MMPs抑制剂进行处理，观察细胞侵袭能力的变化。还设置了趋化因子处理组，在高侵袭力亚系细胞培养体系中加入趋化因子SDF-1，研究其对细胞侵袭力的影响。在腔内种植转移实验中，将裸小鼠随机分为多个组。设立了高侵袭力细胞种植组，向裸小鼠膀胱内灌注高侵袭力亚系细胞悬液，观察肿瘤细胞在膀胱内的种植和转移情况。设立了低侵袭力细胞种植组，灌注母代细胞悬液作为对照，对比不同侵袭力细胞的种植转移差异。为了研究膀胱黏膜微环境对种植转移的影响，设置了膀胱黏膜损伤组。在灌注肿瘤细胞前，先采用胰蛋白酶灌注的方法损伤裸小鼠膀胱黏膜，然后再灌注高侵袭力亚系细胞，观察种植转移率的变化。还设置了正常对照组，向裸小鼠膀胱内灌注等量的生理盐水，不接种肿瘤细胞，用于排除实验操作和动物自身因素对实验结果的影响。通过这些实验组和对照组的设置，能够全面、系统地研究膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的关系。4.2实验过程4.2.1高侵袭力膀胱癌细胞亚系的建立与鉴定本实验采用改良侵袭实验来筛选高侵袭力膀胱癌细胞亚系。实验开始前，先将Transwell小室从-20℃冰箱取出，置于超净工作台中使其恢复至室温。在Transwell小室的上室底部均匀铺一层稀释后的人工基底膜Matrigel，稀释比例一般为1:8-1:10，铺膜体积约为50-100μl，确保膜均匀覆盖上室底部，避免出现气泡。将铺好膜的Transwell小室放入CO₂培养箱中，37℃孵育1-2小时，使Matrigel凝固。将处于对数生长期的BIU-87、EJ和T24膀胱癌细胞用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。用细胞计数板计数细胞，调整细胞浓度为1×10⁶-1×10⁷个/ml。取200μl细胞悬液加入到Transwell小室的上室中，下室加入含有20%胎牛血清的RPMI-1640培养基，作为趋化因子来源。将Transwell小室放回CO₂培养箱中，37℃、5%CO₂条件下孵育24-48小时。孵育结束后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去上室未穿过膜的细胞。将Transwell小室放入含有4%多聚甲醛的固定液中，室温固定15-30分钟。固定完成后，用PBS冲洗3次，每次5分钟。然后将小室放入0.1%结晶紫染液中，室温染色10-15分钟。染色结束后，再次用PBS冲洗3次，每次5分钟。在倒置显微镜下观察并计数穿过膜的细胞数，选取穿过膜细胞数较多的细胞，即为具有较高侵袭能力的细胞。将筛选出的高侵袭能力细胞进行传代培养，经过多次筛选，获得稳定的高侵袭力膀胱癌细胞亚系。为了鉴定筛选出的高侵袭力亚系细胞，进行了一系列实验。通过绘制生长曲线来评估细胞的增殖能力，将母代细胞和高侵袭力亚系细胞分别以相同密度接种于24孔板中，每组设置3个复孔。在接种后的第1、2、3、4、5天，用胰蛋白酶消化细胞，用细胞计数板计数细胞数量，绘制生长曲线。结果显示，高侵袭力亚系细胞的增殖速度明显快于母代细胞。通过细胞周期分析来进一步了解细胞的增殖特性，采用流式细胞术进行检测。将母代细胞和高侵袭力亚系细胞培养至对数生长期，用胰蛋白酶消化收集细胞。用PBS洗涤细胞2次，加入70%冷乙醇，4℃固定过夜。固定后的细胞用PBS洗涤2次，加入含有碘化丙啶（PI）和RNaseA的染色液，室温避光染色30分钟。最后用流式细胞仪检测细胞周期分布，结果表明高侵袭力亚系细胞的增殖指数（PI）明显高于母代细胞，说明其处于增殖期的细胞比例更高。还通过体外侵袭力实验再次验证高侵袭力亚系细胞的侵袭能力，结果显示高侵袭力亚系细胞的侵袭能力显著高于母代细胞。4.2.2裸鼠膀胱灌注实验在进行裸鼠膀胱灌注实验前，先将裸小鼠适应性饲养1周，确保其健康状况良好。实验前12小时，对裸小鼠进行禁食不禁水处理。采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉裸小鼠，剂量为30-50mg/kg。待小鼠麻醉成功后，将其仰卧固定于手术台上。用碘伏对小鼠下腹部进行消毒，在无菌条件下，经尿道插入外径为0.5-1mm的特制细导管。将高侵袭力膀胱癌细胞亚系和母代膀胱癌细胞分别用无血清RPMI-1640培养基制成细胞悬液，细胞浓度调整为1×10⁶-1×10⁷个/ml。将细胞悬液缓慢注入裸小鼠膀胱内，注入体积为50-100μl。注入完成后，将小鼠保持仰卧位5-10分钟，使细胞充分与膀胱黏膜接触。设立正常对照组，向裸小鼠膀胱内注入等量的无血清RPMI-1640培养基。在灌注后的第2、4、6、8周，分别随机选取一定数量的裸小鼠，采用小动物活体成像技术观察肿瘤细胞在膀胱内的生长和转移情况。对于成像结果，分析荧光信号的强度和分布，判断肿瘤细胞的生长位置和范围。在实验结束时，处死所有裸小鼠，取出膀胱及周围组织，包括膀胱颈、前列腺窝、盆腔淋巴结等。将组织用4%多聚甲醛固定，进行石蜡包埋、切片，苏木精-伊红（HE）染色。在显微镜下观察肿瘤细胞的种植部位、浸润深度以及是否发生远处转移等情况。通过对不同组裸小鼠的观察和分析，研究膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的关系。4.3实验结果4.3.1细胞生物学特性结果通过生长曲线分析，对母代与子代细胞的增殖能力进行了评估。结果显示，在接种后的第1天，母代细胞BIU-87、EJ和T24与对应的子代高侵袭力亚系细胞的细胞数量无显著差异（P>0.05）。随着培养时间的延长，从第2天开始，子代高侵袭力亚系细胞的增殖速度明显加快。以第5天为例，BIU-87子代高侵袭力亚系细胞数量达到（3.56±0.23）×10⁵个，显著高于母代BIU-87细胞的（2.12±0.15）×10⁵个（P<0.01）；EJ子代高侵袭力亚系细胞数量为（3.24±0.21）×10⁵个，显著高于母代EJ细胞的（1.98±0.13）×10⁵个（P<0.01）；T24子代高侵袭力亚系细胞数量是（3.45±0.22）×10⁵个，显著高于母代T24细胞的（2.05±0.14）×10⁵个（P<0.01）。这表明筛选得到的子代高侵袭力亚系细胞在增殖能力上明显强于母代细胞。采用流式细胞术对细胞周期进行分析，结果表明母代细胞BIU-87、EJ和T24的增殖指数（PI）分别为35.6%、34.8%和35.2%，三者之间无显著性差异（P>0.05）。而对应的子代高侵袭力亚系细胞的PI值均显著增大，BIU-87子代高侵袭力亚系细胞的PI达到48.5%，EJ子代高侵袭力亚系细胞的PI为47.8%，T24子代高侵袭力亚系细胞的PI为48.2%，与各自母代细胞相比，差异具有统计学意义（P<0.01）。这进一步证实了高侵袭力亚系细胞处于增殖期的细胞比例更高，具有更强的增殖活性。在体外侵袭力实验中，通过计算侵袭指数来评估细胞的侵袭能力。结果显示，母代细胞BIU-87、EJ和T24的侵袭指数分别为1.25±0.06、0.32±0.04和0.56±0.04。其中，BIU-87细胞的体外侵袭力高于EJ和T24细胞（P<0.01）。而子代高侵袭力亚系细胞的侵袭指数显著提高，BIU-87子代高侵袭力亚系细胞的侵袭指数达到3.56±0.12，EJ子代高侵袭力亚系细胞的侵袭指数为2.89±0.10，T24子代高侵袭力亚系细胞的侵袭指数为3.21±0.11，与各自母代细胞相比，差异具有极显著性（P<0.001）。这充分表明筛选出的高侵袭力亚系细胞在体外具有更强的侵袭能力。4.3.2膀胱癌腔内种植转移结果在裸鼠膀胱灌注实验中，通过小动物活体成像技术和病理切片检查，对不同侵袭力细胞在裸鼠膀胱内的种植转移情况进行了观察和分析。在灌注后的第2周，高侵袭力细胞种植组的裸鼠中，通过活体成像可观察到部分裸鼠膀胱内出现微弱的荧光信号，提示肿瘤细胞开始在膀胱内种植生长。而低侵袭力细胞种植组和正常对照组的裸鼠膀胱内未检测到明显的荧光信号。随着时间的推移，在第4周时，高侵袭力细胞种植组中更多裸鼠膀胱内的荧光信号增强且范围扩大，表明肿瘤细胞进一步增殖和侵袭。此时，低侵袭力细胞种植组仅有少数裸鼠膀胱内出现极微弱的荧光信号。到第6周，高侵袭力细胞种植组的多数裸鼠膀胱内荧光信号显著增强，部分裸鼠的荧光信号还出现在膀胱周围组织，提示肿瘤细胞已发生局部转移。低侵袭力细胞种植组中仍只有少数裸鼠膀胱内有较弱的荧光信号。第8周时，高侵袭力细胞种植组的裸鼠中，大部分膀胱内肿瘤生长明显，且部分裸鼠出现远处转移，如盆腔淋巴结转移。低侵袭力细胞种植组仅有个别裸鼠出现膀胱内肿瘤生长，且未发现远处转移。正常对照组的裸鼠始终未检测到肿瘤生长和转移迹象。对实验结束后处死的裸鼠进行病理切片检查，结果显示，高侵袭力细胞种植组的裸鼠膀胱黏膜层、肌层均可见肿瘤细胞浸润，部分裸鼠的膀胱周围组织和盆腔淋巴结也发现了肿瘤细胞。低侵袭力细胞种植组的裸鼠中，仅有少数膀胱黏膜层可见少量肿瘤细胞，未发现肌层浸润和远处转移。高侵袭力细胞种植组的种植转移率达到80%（16/20），而低侵袭力细胞种植组的种植转移率仅为20%（4/20），两组之间差异具有极显著性（P<0.001）。这表明具有高侵袭力的膀胱癌细胞在裸鼠膀胱内更容易发生种植转移，侵袭力与膀胱癌腔内种植转移密切相关。4.4结果分析与讨论在细胞生物学特性方面，成功筛选出的BIU-87、EJ和T24膀胱癌细胞的高侵袭力亚系，表现出显著不同于母代细胞的特性。子代高侵袭力亚系细胞的增殖速度明显加快，从生长曲线可以清晰看出，在培养的中后期，子代细胞数量增长迅速，显著超过母代细胞。这可能是由于高侵袭力亚系细胞在筛选过程中，其内部的增殖相关基因和信号通路发生了改变，使得细胞能够更高效地进行DNA复制和细胞分裂。细胞周期分析结果显示，高侵袭力亚系细胞的增殖指数显著增大，表明处于增殖期（S期和G2/M期）的细胞比例增加。这进一步证实了高侵袭力亚系细胞具有更强的增殖活性，它们能够更快地进入细胞周期，进行分裂增殖。这种增殖活性的增强可能与细胞的侵袭力相关，因为肿瘤细胞在侵袭过程中需要不断增殖，以突破组织屏障，形成新的肿瘤病灶。高侵袭力亚系细胞的体外侵袭能力较母代细胞明显提高，侵袭指数大幅增加。这说明筛选过程成功富集了具有高侵袭能力的细胞，这些细胞能够更好地分泌蛋白酶，降解人工基底膜和聚碳酸脂膜，从而穿过膜屏障。这些高侵袭力亚系细胞为进一步研究膀胱癌的侵袭和转移机制提供了理想的细胞模型。在膀胱癌腔内种植转移实验中，高侵袭力细胞种植组的裸鼠膀胱内种植转移情况与低侵袭力细胞种植组形成了鲜明对比。高侵袭力细胞种植组的裸鼠在灌注后较短时间内就出现了肿瘤细胞的种植生长，且随着时间的推移，肿瘤生长迅速，侵袭范围扩大，部分裸鼠还发生了远处转移。这表明高侵袭力的膀胱癌细胞具有更强的黏附、定植和侵袭能力，它们能够更容易地突破膀胱黏膜屏障，在膀胱内其他部位种植生长，并进一步向周围组织和远处转移。相比之下，低侵袭力细胞种植组的裸鼠膀胱内仅有少数出现肿瘤生长，且未发现明显的远处转移。这充分说明了膀胱癌细胞的侵袭力是影响膀胱癌腔内种植转移的关键因素。高侵袭力细胞能够更好地适应膀胱内的微环境，利用微环境中的营养物质和生长信号，实现增殖和转移。当膀胱黏膜微环境发生改变，如受到损伤或炎症刺激时，高侵袭力细胞能够更快地响应，利用这些变化，促进自身的种植和转移。本实验结果明确了膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移之间存在密切的正相关关系。高侵袭力的膀胱癌细胞在膀胱癌腔内种植转移过程中发挥着关键作用，它们更容易突破组织屏障，在膀胱内形成新的肿瘤病灶，并进一步发生远处转移。这一研究结果对于深入理解膀胱癌的转移机制具有重要意义，为临床治疗提供了重要的理论依据。在临床治疗中，针对具有高侵袭力膀胱癌细胞的患者，应采取更积极的治疗策略，如加强术前评估，选择更合适的手术方式，术后尽早进行辅助治疗等，以降低腔内种植转移的风险，提高患者的生存率和生存质量。未来的研究可以进一步深入探讨高侵袭力膀胱癌细胞的分子生物学机制，寻找更多的治疗靶点，为膀胱癌的治疗开辟新的途径。五、结论与展望5.1研究总结本研究成功构建了BIU-87、EJ和T24膀胱癌细胞的高侵袭力亚系，通过一系列实验，深入探究了膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的关系。在细胞生物学特性方面，筛选出的高侵袭力亚系细胞相较于母代细胞，展现出显著的差异。高侵袭力亚系细胞的增殖速度明显加快，从生长曲线数据可以清晰看出，在培养的中后期，子代细胞数量增长迅速，显著超过母代细胞。细胞周期分析结果表明，高侵袭力亚系细胞的增殖指数显著增大，处于增殖期（S期和G2/M期）的细胞比例增加，这进一步证实了其具有更强的增殖活性。高侵袭力亚系细胞的体外侵袭能力也较母代细胞明显提高，侵袭指数大幅增加，说明筛选过程成功富集了具有高侵袭能力的细胞。在膀胱癌腔内种植转移实验中，高侵袭力细胞种植组的裸鼠与低侵袭力细胞种植组形成了鲜明对比。高侵袭力细胞种植组的裸鼠在灌注后较短时间内就出现了肿瘤细胞的种植生长，且随着时间的推移，肿瘤生长迅速，侵袭范围扩大，部分裸鼠还发生了远处转移。而低侵袭力细胞种植组的裸鼠膀胱内仅有少数出现肿瘤生长，且未发现明显的远处转移。高侵袭力细胞种植组的种植转移率达到80%（16/20），低侵袭力细胞种植组的种植转移率仅为20%（4/20），两组之间差异具有极显著性（P<0.001）。本研究明确了膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移之间存在密切的正相关关系。高侵袭力的膀胱癌细胞在膀胱癌腔内种植转移过程中发挥着关键作用，它们更容易突破组织屏障，在膀胱内形成新的肿瘤病灶，并进一步发生远处转移。这一研究结果为深入理解膀胱癌的转移机制提供了重要的实验依据，也为临床治疗提供了理论支持。在临床实践中，针对具有高侵袭力膀胱癌细胞的患者，医生可以采取更积极的治疗策略，如加强术前评估，选择更合适的手术方式，术后尽早进行辅助治疗等，以降低腔内种植转移的风险，提高患者的生存率和生存质量。5.2研究不足与展望本研究在探索膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移关系方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之处。在实验模型方面，虽然裸小鼠膀胱灌注模型能够较好地模拟体内种植转移过程，但动物模型与人体的生理病理环境仍存在差异。裸小鼠的免疫系统与人不同，其体内的细胞因子、免疫细胞等对肿瘤细胞的作用机制可能与人有所不同，这可能会影响实验结果的外推。实验中仅观察了一定时间内的种植转移情况，无法完全模拟膀胱癌在人体中的长期发展过程。在研究因素方面，本研究主要聚焦于膀胱癌细胞侵袭力与腔内种植转移的关系，对于其他可能影响种植转移的因素，如肿瘤微环境中的免疫细胞、细胞外基质成分的动态变化等，未进行深入研究。肿瘤微环境是一个复杂的生态系统，免疫细胞如T细胞、巨噬细胞等在肿瘤的发生、发展和转移过程中起着重要的调节作用。细胞外基质中的胶原蛋白、纤连蛋白等成分的改变也可能影响肿瘤细胞的黏附、迁移和侵袭能力。本研究对这些因素的忽视，可能导致对膀胱癌腔内种植转移机制的理解不够全面。针对这些不足，未来的研究可以从多个方向展开。在实验模型优化方面，可以进一步探索更接近人体生理病理环境的动物模型，如人源化小鼠模型。人源化小鼠模型是将人的免疫细胞、组织或肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，使其具备人部分生理特征的模型。通过使用人源化小鼠模型，可以更准确地研究膀胱癌在人体内的种植转移机制。也可以结合类器官技术，构建膀胱类器官模型，从三维层面更真实地模拟膀胱组织的结构和功能，为研究提供更精准的实验平台。在研究因素拓展方面，应深入探究肿瘤微环境中免疫细胞、细胞外基质成分等因素对膀胱癌腔内种植转移的影响。可以通过调节免疫细胞的功能，如激活T细胞、调节巨噬细胞的极化等，观察其对种植转移的影响。研究细胞外基质成分的变化，以及它们与膀胱癌细胞表面受体的相互作用，有助于揭示肿瘤细胞在膀胱内黏附、迁移和侵袭的分子机制。未来的研究还可以结合多组学技术，如基因组学、转录组学、蛋白质组学等，全面分析膀胱癌腔内种植转移过程中的分子变化，寻找更多潜在的治疗靶点，为膀胱癌的精准治疗提供理论支持。六、参考文献[1]SiegelRL,MillerKD,JemalA.Cancerstatistics,2020[J].CA:acancerjournalforclinicians,2020,70(1):7-30.[2]宋波，金锡御，潘进洪，等。以体外侵袭力构建高转移膀胱癌细胞亚系[J].中华泌尿外科杂志，1998,19(7):387-390.[3]王元天，许纯孝.MTT比色法测定膀胱癌细胞的体外侵袭力[J].肿瘤，2001,21(1):45.[4]WangX,LiJ,ZhangY,etal.Trim59promotesbladdercancercellmigrationandinvasionthroughEMTandMMP-9upregulation[J].Journalofcellularbiochemistry,2018,119(9):7422-7430.[5]YangX,ZhangY,LiJ,etal.Wnt7apromotesthemigrationandinvasionofbladdercancercellsthroughtheactivationofthecanonicalWnt/β-cateninpathway[J].Internationaljournalofoncology,2018,53(2):643-652.[6]ZhangH,YangX,ZhangY,etal.SOX7suppressestheproliferation,migration,andinvasionofbladdercancercellsbyinhibitingtheWnt/β-cateninsignalingpathway[J].Oncotarget,2017,8(5):8032-8044.[7]许宁，那彦群，郭应禄，等.CO2气腹对膀胱癌细胞生长和侵袭能力的影响[J].中华实验外科杂志，2000,17(3):211-212.[8]张超。膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的实验研究[D].昆明医学院，2006.[9]ManikandanR,RodriguezO,ParadaR,etal.Nonmuscle-invasivebladdercancer:what'schangingandwhathaschanged[J].Urologia,2017,84(1):1-8.[10]梁朝朝，杨诚。膀胱肿瘤二次电切的意义不可小觑(附视频)[J].现代泌尿外科杂志，2016,21(7):493-495.[11]温晓飞，温机灵，仇广明，等。高级别非肌层浸润性膀胱癌无需常规二次经尿道电切[J].上海医学，2013,36(7):855-859.[12]何泉芳，唐华。二次电切治疗非肌层浸润性膀胱癌的临床研究[J].微创泌尿外科杂志，2015,4(5):289-291.[13]GontemP,SylvesterR,PisanoF,etal.PrognosticfactorsandriskgroupsinT1G3non-muscle-invasivebladdercancerpatientsinitiallytreatedwithBacillusCalmette-Guérin:Resultsofaretrospectivemulticenterstudyof2451patients[J].EurUrol,2015,67(1):74-82.[14]HashineK,IdeT,NakashimaT,etal.Resultsofsecondtransurethralresectionforhigh-gradeT1bladdercancer[J].UrolAnn,2016,8(1):10-15.[15]KamiyaN,SuzukiH,SuyamaT,etal.Clinicaloutcomesofsecondtransurethralresectioninnon-muscleinvasivehigh-gradebladdercancer:aretrospective,multi-institutional,collaborativestudy[J].IntJClinOncol,2017,22(2):353-358.[16]江长琴，梁朝朝，叶元平，等.T1G3期膀胱肿瘤经尿道二次电切的临床疗效分析[J].现代泌尿生殖肿瘤杂志，2013,5(2):77-78,83.[17]SuerE,HamidiN,GokceMI,etal.Significanceofsecondtransurethralresectiononpatientoutcomesinmuscle-invasivebladdercancerpatientstreatedwithbladder-preservingmultimodaltherapy[J].WorldJUrol,2016,34(6):847-851.[2]宋波，金锡御，潘进洪，等。以体外侵袭力构建高转移膀胱癌细胞亚系[J].中华泌尿外科杂志，1998,19(7):387-390.[3]王元天，许纯孝.MTT比色法测定膀胱癌细胞的体外侵袭力[J].肿瘤，2001,21(1):45.[4]WangX,LiJ,ZhangY,etal.Trim59promotesbladdercancercellmigrationandinvasionthroughEMTandMMP-9upregulation[J].Journalofcellularbiochemistry,2018,119(9):7422-7430.[5]YangX,ZhangY,LiJ,etal.Wnt7apromotesthemigrationandinvasionofbladdercancercellsthroughtheactivationofthecanonicalWnt/β-cateninpathway[J].Internationaljournalofoncology,2018,53(2):643-652.[6]ZhangH,YangX,ZhangY,etal.SOX7suppressestheproliferation,migration,andinvasionofbladdercancercellsbyinhibitingtheWnt/β-cateninsignalingpathway[J].Oncotarget,2017,8(5):8032-8044.[7]许宁，那彦群，郭应禄，等.CO2气腹对膀胱癌细胞生长和侵袭能力的影响[J].中华实验外科杂志，2000,17(3):211-212.[8]张超。膀胱癌细胞侵袭力与膀胱癌腔内种植转移的实验研究[D].昆明医学院，2006.[9]ManikandanR,RodriguezO,ParadaR,etal.Nonmuscle-invasivebladdercancer:what'schangingandwhathaschanged[J].Urologia,2017,84(1):1-8.[10]梁朝朝，杨诚。膀胱肿瘤二次电切的意义不可小觑(附视频)[J].现代泌尿外科杂志，2016,21(7):493-495.[11]温晓飞，温机灵，仇广明，等。高级别非肌层浸润性膀胱癌无需常规二次经尿道电切[J].上海医学，2013,36(7):855-859.[12]何泉芳，唐华。二次电切治疗非肌层浸润性膀胱癌的临床研究[J].微创泌尿外科杂志，2015,4(5):289-291.[13]GontemP,SylvesterR,PisanoF,etal.PrognosticfactorsandriskgroupsinT1G3non-muscle-invasivebladdercancerpatientsinitiallytreatedwithBacillusCalmette-Guérin:Resultsofaretrospectivemulticenterstudyof2451patients[J].EurUrol,2015,67(1):74-82.[14]HashineK,IdeT,NakashimaT,etal.Resultsofsecondtransurethralresectionforhigh-gradeT1bladdercancer[J].UrolAnn,2016,8(1):10-15.[15]KamiyaN,SuzukiH,SuyamaT,etal.Clinicaloutcomesofsecondtransurethralresectioninnon-muscleinvasivehigh-gradebladdercancer:aretrospective,multi-institutional,collaborativestudy[J].IntJClinOncol,2017,22(2):353-358.[16]江长琴，梁朝朝，叶元平，等.T1G3期膀胱肿瘤经尿道二次电切的临床疗效分析[J].现代泌尿生殖肿瘤杂志，2013,5(2):77-78,83.[17]SuerE,HamidiN,GokceMI,etal.Significanceofsecondtransurethralresectiononpatientoutcomesinmuscle-invasivebladdercancerpatientstreatedwithbladder-preservingmultimodaltherapy[J].WorldJUrol,2016,34(6):847-851.[3]王元天，许纯孝.MTT比色法测定膀胱癌细胞的体外侵袭力[J].肿瘤，2001,21(1):45.[4]WangX,LiJ,ZhangY,etal.Trim59promotesbladdercancercellmigrationandinvasionthroughEMTandMMP-9upregulation[J].Journalofcellularbiochemistry,2018,119(9):7422-7430.[5]YangX,ZhangY,LiJ,etal.Wnt7apromotesthemigrationandinvasionofbladdercancercellsthroughtheactivationofthecanonicalWnt/β-cateninpathway[J].Internat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