DB12T 651-2016 转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2及其衍生品种定量检测 实时荧光PCR方法

ICS67.050B23DB12天津市市场和质量监督管理委员会发布IDB12/T651—2016本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院生物技术研究所、天津市质量技术监督宝坻检测中心。本标准主要起草人：兰青阔、宛煜嵩、杨炳存、赵新、李亮、陈锐、朱珠、刘娜、王成、徐石勇。本标准2016年9月首次发布。DB12/T651—2016转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2及其衍生品种定量检测实时荧光PCR方法本标准规定了转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2转化体特异性定量PCR检测方法的术语和定义、检测方法、结果计算。本标准适用于转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2及其衍生品种，以及制品中GTS40-3-2转化体的定量PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求农业部1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化农业部2031号公告—19—2013转基因植物及其产品检测抽样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1Lectin基因Lectingene编码大豆凝集素的基因。3.2GTS40-3-2转化体特异性序列event-specificsequenceofGTS40-3-2GTS40-3-2外源插入片段5′端与大豆基因组的连接区序列，包括35S启动子部分序列和大豆基因组的部分序列。4原理根据大豆外源基因和内标基因特异性序列设计引物和TaqMan荧光探针，对标准样品和试样同时进行实时荧光PCR扩增。根据标准样品模板拷贝数与Ct值间的线性关系，分别绘制外源基因和内标基因的标准曲线。计算试样中外源基因和内标基因的拷贝数及其比值。5检测方法5.1试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。5.1.1TaqMan荧光PCR反应试剂盒。DB12/T651—20165.1.2引物和探针。5.1.2.1Lectin基因。lec-1215F：5′-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3′lec-1332R：5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3′lec-1269P：5′-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-3′预期扩增片段大小为118bp（参见附录A）。5.1.2.2GTS40-3-2转化体特异性序列。GTS40-3-2F：5'-CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG-3'GTS40-3-2R：5'-GACTTGTCGCCGGGAATG-3'GTS40-3-2P：5'-CGCAACCGCCCGCAAATCC-3'需避光保存。5.2仪器分析天平：感量0.1g和0.1mg；荧光定量PCR扩增仪；核酸定量仪；重蒸馏水发生器或纯水仪；其他相关仪器设备。5.3分析步骤5.3.1抽样按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013规定执行。5.3.2试样准备按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013规定执行。5.3.3试样预处理按农业部1485号公告—4—2010规定执行。5.3.4DNA模板制备按农业部1485号公告—4—2010规定执行。5.3.5标准曲线样品制备采用相同的标准样品绘制GTS40-3-2转化体和Lectin内标基因的标准曲线。提取GTS40-3-2标准物质基因组DNA，用0.1×TE或水稀释至1×105-5×105copies/µL（相当于20-100ng/µL作为初始模板。然后再用0.1×TE梯度稀释初始模板，制备不同浓度的GTS40-3-2标准溶液。标准溶液至少涵盖5个GTS40-3-2浓度梯度，最低浓度拷贝数小于200，最高浓度拷贝数大于40000。5.3.6PCR反应5.3.6.1标准样品和试样实时荧光PCR反应同时进行标准样品和试样的PCR反应，每个PCR反应设置3次平行。GTS40-3-2转化体实时荧光PCR反应按表1在PCR反应管中依次加入反应试剂，混匀；Lectin内标基因实时荧光PCR反应按DB12/T651—2016表2在PCR反应管中依次加入反应试剂，混匀。将PCR管放在离心机上，500g~3000g离心10s，然后取出PCR管，放入PCR仪中。运行实时荧光PCR反应。反应程序为：95℃变性2min；进行45光信号。表1GTS40-3-2PCR反应体系——表2Lectin内标基因PCR反应体系——5.3.6.2设置对照应设置阴性对照和空白对照。以非转基因大豆材料提取的DNA作为GTS40-3-2转化体特异性检测的阴性对照的模板；以鲑鱼精子DNA作为Lectin内标基因检测的阴性对照的模板；用纯水作为空白对照PCR反应体系的模板。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与5.3.6.1.4相同。5.3.7数据分析5.3.7.1设定阈值实时荧光PCR反应结束后，以PCR刚好进入指数期扩增来设置荧光信号阈值，并根据仪器噪声情况进行调整。设定阈值处，要求不同浓度梯度标准品的扩增曲线平行，而且同一样品的不同平行间重复性良好。5.3.7.2记录Ct值DB12/T651—2016设定阈值后，荧光定量PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值，并记录。5.3.7.3绘制标准曲线根据标准溶液的扩增Ct值和初始模板拷贝数的对数间的线性关系，分别绘制GTS40-3-2转化体和Lectin内标基因的标准曲线。标准曲线公式：y=ax+b(1y式中：y—测试样品的Ct值；a—标准曲线的斜率；x—模板拷贝数以10为底数的对数；b—标准曲线的截距。5.3.7.4数据可接受的标准GTS40-3-2阴性对照和空白对照的GTS40-3-2转化体Ct值≥38；Lectin阴性对照和空白对照的Lectin内标基因Ct值≥38；标准曲线的R2≥0.98，标准曲线斜率≥-3.6且≤-3.1；满足上述条件，可以进行结果计算。否则重新进行实时荧光PCR扩增。5.3.7.5含量计算5.3.7.5.1计算试样模板拷贝数将试样的GTS40-3-2转化体和Lectin内标基因的Ct值分别带入GTS40-3-2转化体和Lectin内标基因的标准曲线方程，计算GTS40-3-2转化体和大豆内标准基因Lectin的拷贝数。计算试样模板拷贝数公式：y-b式中：n—模板拷贝数y—测试样品的Ct值；a—标准曲线的斜率；b—标准曲线的截距。5.3.7.5.2计算试样中转基因含量将GTS40-3-2转化体拷贝数和Lectin内标基因拷贝数带入公式（3计算出试样中GTS40-3-2百分含量。计算试样中GTS40-3-2转化体百分含量的公式：×100%(3)式中：c—试样中GTS40-3-2的百分含量(%)；nGTS40-3-2—GTS40-3-2转化体拷贝数；nLectin—大豆内标准基因Lectin拷贝数。DB12/T651—20166结果分析与表述6.1Lectin内标基因和GTS40-3-2转化体均出现典型扩增曲线，且Lectin内标基因和GTS40-3-2转化体的Ct值<36，表明样品中检出耐除草剂大豆GTS40-3-2转化体。表述为“样品中检测出GTS40-3-2转化体，GTS40-3-2转化体含量为c”。6.2Lectin内标基因出现典型扩增曲线，且Ct值<36，GTS40-3-2转化体Ct值≥38或未出现典型扩增曲线，表明样品中未检出耐除草剂大豆GTS40-3-2转化体。表述为“样品中未检测出GTS40-3-2转化6.3Lectin内标基因和GTS40-3-2转化体出现典型扩增曲线，Lectin内标基因Ct值<36，GTS40-3-2转化体Ct值在36～38之间，应进行重复实验。如重复实验结果符合6.1-6.2的情况，依照6.1-6.2进行判断；如重复实验GTS40-3-2转化体出现典型扩增曲线，但Ct值仍在36～38之间，则判定样品检出GTS40-3-2转化体，表述为“样品中检测出GTS40-3-2转化体”。6.4Lectin内标基因和GTS40-3-2转化体未出现典型扩增曲线，或Ct值≥38，表明样品中未检出大豆。6.5Lectin内标基因和GTS40-3-2转化体出现典型扩增曲线，但Ct值均在36～38之间，应进行重复实验。如重复实验结果符合6.1-6.4的情况，依照6.1-6.4进行判断；如重复实验Lectin内标基因和GTS40-3-2转化体出现典型扩增曲线，但Ct值仍在36～38之间，则判定样品检出GTS40-3-2转化体，表述为“样品中检测出GTS40-3-2转化体”。DB12/T651—2016（资料性附录）A.1Lectin基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列（AccessionNo.K00821）61GCCGCTTCCTTCAACTTCAClCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCAGATGGGC61GCCGCTT