易错点11酶切位点的选择

易错点11酶切位点的选择[名师支招]1.单酶切和双酶切(1)单酶切①过程：先用同一种限制酶切割载体和含目的基因的DNA分子，获得带有相同黏性末端或平末端的片段。再通过DNA连接酶连接平末端或相同的黏性末端，获得重组质粒。②缺点：单酶切时，目的基因和载体的所有接口都是相同的，所以容易出现目的基因反接或自身环化，如下图所示。(2)双酶切①过程：利用两个不同限制酶切割目的基因和载体，使目的基因和载体均具有两个不同的黏性末端，就可以避免反接，并减少自身环化的情况。②方向：插入位置前后分别要有启动子和终止子，保证目的基因的表达。2.酶切位点选择(1)不破坏目的基因和标记基因：若在目的基因、标记基因或其他重要结构上有某酶切位点，为避免这些结构被破坏，要避免使用相关的限制酶。(2)根据T－DNA片段选择限制酶：若对Ti质粒进行操作，则酶切位点应位于T－DNA片段上，才能在农杆菌转化过程中将目的基因导入受体细胞基因组上。(3)同尾酶的使用：同尾酶是指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。比如限制酶MboⅠ(↓GATC)和BamHⅠ(G↓GATCC)就是一对同尾酶，NotⅠ(GC↓GGCCGC)和Bsp120Ⅰ(G↓GGCCC)也是同尾酶。尽管同尾酶切割的黏性末端相同，可以被DNA连接酶连接，但是由于两端的序列不同，连接后的产物失去酶切位点，除非特殊情况，一般不会使用。[典例赏析]1.(2022·天津卷，15)研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物________和________，并在引物的________(填“5′”或“3′”)端引入XhoⅠ酶识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时，引物应包含________(填“EcoRⅠ”“HindⅢ”或“XhoⅠ”)酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有________的平板进行初步筛选。(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为________。A.卡那霉素不敏感、链霉素敏感B.卡那霉素敏感、链霉素不敏感C.卡那霉素和链霉素都敏感D.卡那霉素和链霉素都不敏感(5)可采用________技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。答案(1)145′(2)XhoⅠ(3)卡那霉素(4)B(5)PCR解析(1)据图可知，根据引物箭头方向可知，要想复制KanR(卡那霉素抗性基因)，需要引物1和4，因此为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1和4。PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端自3′端延伸的，因此在引物的5′端引入XhoⅠ酶识别序列。(2)据图可知，载体4中RpsL(链霉素敏感基因)的两侧具有XhoⅠ酶识别序列，载体3中不含XhoⅠ酶识别序列，如果将载体2和载体3连接形成高效筛选载体4时，需要的引物应该含有XhoⅠ酶识别序列。(3)基因表达载体中的标记基因有利于目的基因的初步检测，据题意可知，载体5中含有RpsL(链霉素敏感基因)和KanR(卡那霉素抗性基因)，将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。(4)据题意可知，载体5导入时的受体菌链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感，受体菌中P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失，因此该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感，B正确，A、C、D错误。(5)通过PCR技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA中或目的基因是否转录出了mRNA，因此可采用PCR技术鉴定成功整合P1基因的菌株。2.(2024·河北邯郸模拟节选)植物内生菌是指能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与植物建立共生关系的一类微生物。(1)某酵母菌能分泌一种可高效降解纤维素的酶，这种酶由W基因编码。为在放线菌中表达W基因，需以图中质粒为载体。W基因以乙链为转录模板链，转录时mRNA自身延伸的方向为________。注：图中MfeⅠ与EcoRⅠ切割后产生的黏性末端相同，其余不相同。①很多启动子具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择________(填字母)。A.酵母菌启动子B.芽孢杆菌启动子C.放线菌启动子②应使用限制酶________切割图中质粒，使用限制酶________切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。(2)利用PCR技术对放线菌是否含有W基因进行________水平鉴定，应根据目的基因(W基因)两端的碱基序列来设计________进行扩增。答案(1)5′→3′①C②MfeⅠ、HindⅢEcoRⅠ、HindⅢ(2)分子引物解析(1)转录时，mRNA自身延伸方向为5′→3′。①该基因工程是将酵母菌的W基因导入放线菌，想让W基因在放线菌中成功表达，应当选择放线菌启动子。②按照选择限制酶的原则综合分析，MfeⅠ与EcoRⅠ切割后产生的黏性末端相同，但MfeⅠ会破坏目的基因，所以质粒使用限制酶MfeⅠ、HindⅢ切割，含W基因的DNA片段使用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ切割。(2)PCR技术是DNA分子的体外复制技术，属于分子水平。利用PCR技术扩增，应根据目的基因两端的碱基序列设计引物，使引物与模板链能特异性结合。3.(2024·河北邢台模拟)二十碳五烯酸(EPA)能促进体内饱和脂肪酸代谢，具有降低血液黏稠度、预防心脑血管疾病的功效。研究人员利用转基因技术从海洋生物中提取了EPA合成途径的关键基因pfaB，并将其导入酵母菌内，通过酵母菌发酵生产EPA。图1和图2分别是转基因过程中使用的含目的基因的DNA片段和质粒。回答下列问题：(1)根据图1分析，利用PCR扩增pfaB基因时，所选用的引物是________。在PCR仪中进行n次循环，需要消耗________个引物。(2)构建基因表达载体时，应选择______________这两种限制酶分别切割含目的基因的DNA和质粒，采用双酶切方法进行切割的目的是__________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)据图2分析，将基因表达载体导入酵母菌后，可用添加了____________的培养基对目的基因成功导入并表达的酵母菌进行筛选。(4)采用PCR等技术可检测pfaB基因是否插入酵母菌染色体中，得到的PCR产物一般通过_____________来鉴定，DNA分子的迁移速率与________________有关。答案(1)引物5和引物42n＋1－2(2)BamHⅠ和HindⅢ避免目的基因和质粒自身环化，防止目的基因与质粒反向连接(3)氨苄青霉素(4)琼脂糖凝胶电泳凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等解析(1)利用PCR扩增目的基因时，子链的延伸方向是5′端→3′端，扩增产物应该包含酶切位点序列，所以选用的引物为引物5和引物4。一个DNA分子经过n次复制形成2n个DNA，共含有2n＋1条链，除两条亲代的模板链外，剩下的每一条链的形成都需要消耗引物，所以需要消耗2n＋1－2个引物。(2)图示分析：结合图示分析可知，应选择限制酶BamHⅠ和HindⅢ分别切割含目的基因的DNA和质粒。采用双酶切的方法对含目的基因的DNA和质粒进行切割，可以避免目的基因和质粒的自身环化，防止目的基因与质粒的反向连接。(3)由图2可知，四环素抗性基因会被限制酶破坏，因此筛选目的基因成功导入并表达的酵母菌时，可用添加氨苄青霉素的培养基培养酵母菌。(4)采用PCR等技术检测pfaB基因是否插入酵母菌染色体中时，得到的PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。4.(2021·山东等级考试，25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测BCL11A蛋白结合位点位于________________________________________________________________________________________________________，理由是__________________________________________________________________________________________________________________________。答案(1)SalⅠEcoRⅠ6(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达(3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上根据有无荧光情况判断F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上解析(1)从题干中给的几种限制酶识别的序列和切割位点来看，可以发现MunⅠ和EcoRⅠ产生的末端相同，可以用DNA连接酶连接起来，XhoⅠ和SalⅠ产生的末端相同，可以用DNA连接酶连接起来。因为需要将扩增产物定向插入到载体，指导荧光蛋白的表达，而荧光蛋白基因要表达必须在其上游(右侧)有启动子，这样才能从右向左转录，直到终止子。而启动子可能存在于扩增产物中，因为启动子在γ基因的上游(左侧)，它调控的转录是从左向右的，调控两个基因表达的启动子方向相反，需将扩增产物左右反转后接入载体中。而要将扩增产物插入到荧光蛋白基因的右侧，其右侧有MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ的切割位点，但由于EcoRⅠ还有一个切割位点在荧光蛋白基因内部，会将该基因破坏，所以在构建基因表达载体时，不能选择EcoRⅠ。因为需要在扩增产物两端加上相应的限制酶识别序列，而在γ基因上游的调控序列和启动子部分有MunⅠ和XhoⅠ的识别序列，为防止任意切割，所以在处理扩增产物时，这两种酶不能用，但为了将扩增产物定向插入载体，所以需要扩增产物两端有与MunⅠ和XhoⅠ切割产生的相同的末端，所以可以选择在扩增产物左侧(F1～F7)加上SalⅠ的识别序列，在插入载体时，就可以定向连接到XhoⅠ切割的末端，而右侧(R)加上EcoRⅠ的识别序列，可以定向连接到MunⅠ切割的末端。该实验过程中要用到的酶有TaqDNA聚合酶(PCR扩增时)、MunⅠ和XhoⅠ(切割载体时)、EcoRⅠ和SalⅠ(处理扩增产物时)、DNA连接酶(连接扩增产物和载体)，共6种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，说明荧光蛋白基因表达了，即插入的含F1～F6与R的扩增产物中含有启动子，能起始转录；含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光说明该区域不含完整的启动子，荧光蛋白基因未表达。(3)P序列是雌激素诱导下发挥作用的启动子，向培养液中加入雌激素，诱导P发挥作用，从而表达BCL11A蛋