基因操作的主要技术原理

基因操作的主要技术原理第1页

凝胶电泳是一个分析判定重组DNA分子、蛋白质、蛋白质与核酸相互作用主要试验伎俩，同时也是分子生物学研究方法技术基础。

1凝胶电泳第2页凝胶包含复杂孔道网络，DNA分子必须经过这些孔道才能够抵达阳极。小DNA分子，在凝胶中迁移更加快。第3页按凝胶材料分:

聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶电泳(普通和低熔点琼脂糖)按电泳装置分:

水平式/琼脂糖凝胶竖式/聚丙烯酰胺凝胶两种方法比较：分离效果和分离范围;操作难易凝胶电泳种类

第4页基础原理带有负电荷DNA或RNA核苷酸链，依靠稳定无反应活性介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定迁移率从负极移向正极。依据核酸分子大小不一样、构型或形状差异，以及所带电荷不一样，能够经过电泳将其混合物中不一样成份彼此分开。

2核酸电泳第5页凝胶成份和浓度决定能够分离DNA大小琼脂糖凝胶：相对大孔道，分离大一些分子；聚丙烯酰胺凝胶：很小孔道，分离小DNA分子，能够分离仅仅相差一个核苷酸DNA分子。第6页

用途琼脂糖凝胶：用于DNA和RNA常规分析聚丙烯酰胺凝胶：常见于小分子核酸和蛋白质分析凝胶电泳普通程序制胶，点样，电泳，染色，观察第7页取决于核酸分子本身大小和构型分子量较小DNA分子，比分子量较大DNA分子迁移率要快；同等分子量不一样构型核酸分子，构型紧密比涣散型开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快。电泳迁移率第8页

与凝胶类型和密度相关

琼脂糖凝胶分辨力在0.2～50Kb之间;

聚丙烯酰胺分辨力在1～1000bp之间；凝胶电泳分辨力第9页SeparationRangeofAgarose第10页PolyAcrylamideGels(PAGE)第11页琼脂糖：一个从红色海藻中提取出线性多糖聚合物。分为常熔点琼脂糖低熔点（LMP）琼脂糖2琼脂糖凝胶电泳第12页Agarosegelelectrophoresis第13页第14页LMP琼脂糖熔点：62～65℃

熔解后，在37℃可保持液态数小时；在25℃可保持液态约10min

第15页回收DNA分子在65℃下将LMP琼脂糖凝胶熔化；加入过量酚抽提DNA；离心取得含DNA分子上清液；第16页琼脂糖凝胶电泳参数：缓冲液：1×

TAE（TBE,TPE）凝胶含量：依据检测DNA大小加DNA样品：<1μg，指示剂电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间第17页使凝胶中DNA分子可视化染色是最简单方法。溴乙锭(EtBr)能够用来对琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中DNA进行染色。只要在足够DNA存在条件下，经过EtBr染色后，在紫外照射下能以不一样条带显示出来。注意：溴乙锭是非常强致癌物；紫外光也会灼伤。所以，用于把DNA染成蓝色或绿色，又不需要紫外照射就能看见DNA非致癌染料，越来越多地被用于试验室研究中。第18页第19页染色和观察：溴化乙锭（EB）染色，在300nm波长紫外下观察（凝胶成像仪）能看到0.05μg微量DNADNA片断大小与荧光强度成正比第20页DNA分子大小预计怎样确定凝胶电泳中片段大小?最准确方法：利用迁移速度和分子重量间数学关系。相关公式是：

D=a-b(logM)D是迁移距离，M是相对分子质量，a和b是依赖于电泳条件常数。通常使用：一个简单，但相对不太准确预计DNA片段大小方法。第21页方法：利用已知大小DNA片段作标准(marker/ladder),目标DNA片段与之比对、预计。比如：HindⅢ将λDNA切成8个片段，这些片段大小都已经知道，范围从125bp到23kb。试验中片段大小能够经过对比两条泳道中条带位置而加以预计。尽管不十分准确，这种方法进行起来只有5％错误率第22页SampleWell25ng1kbladder0.8%Agarose124681012kbAgaroseGelElectrophoresisEtBrDetectionLimit:~5-10ngDNA第23页第24页依据标准DNA相对迁移距离推测待测定DNA片段大小第25页Agarosegelelectrophoresis第26页对放射性标识DNA进行放射性自显影染色一个缺点是其灵敏性限制，假如每条带中DNA含量少于10ng，则很有可能在染色后依然看不到条带。对于微量DNA就需要愈加灵敏检测伎俩。放射自显影是一个很好方法。电泳前将DNA结合上放射性标识，利用X射线敏感摄影对凝胶进行拍摄就能够肉眼观察到DNA分子。放射性DNA使胶片曝光，显示出DNA条带。第27页第28页聚丙烯酰胺凝胶：丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺（29：1）

TEMED

过硫酸铵（10％）缓冲液：TBE3聚丙烯酰胺凝胶电泳第29页链分离凝胶-SSCP用于单链分离,能够进行SNP检测。PAGE原理：SNP:DNA长度相同，仅一个碱基不一样；加热后解链后电泳，迁移速度不一样。第30页能够分离1bp差异用途：测序、AFLP、为防止局部区域产生二级结构，可采取各种变性办法，如煮沸样品，提升电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）核酸测序凝胶第31页传统凝胶电泳中，电场是沿着凝胶长度走向定位，DNA分子是沿着直线向正极迁移。不一样大小DNA分子在凝胶网状孔道中迁移时候，迁移速率不一样，从而被分离开。只有一定大小范围内分子能够经过这种方法分离，因为对于大分子来说，分子越大，迁移速率差异越小。实际操作中，普通凝胶电泳不能有效地分离大于50kbDNA分子。4经过凝胶电泳分离染色体第32页第33页1984年，D.R.Cantor创造，分离超大分子量DNA分子。在脉冲电泳中，电场方向是周期改变，头一个脉冲电场方向与核酸移动方向成45℃角，下一个脉冲电场方向与核酸移动方向在另一侧成45℃角，因为加在琼脂糖凝胶电泳上电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动方向，来适应凝胶孔隙无规则改变。脉冲电场凝胶电泳（PFGE）第34页第35页脉冲场凝胶电泳原理图

北

南

脉冲场电泳常规电泳

两组电极，排列不均匀;一组电极，电场方向不变，电极排列均匀，定时改变电场方向，DNA分子净DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳移动方向与两电场呈45o，在电泳过过程保持电压稳定。常规方法制备DNA程中，电压有时可随时间增加而样品增加，制备DNA样品与常规方法不一样第36页脉冲场凝胶电泳PFGE工作假说1)

DNA松弛时间：大分子DNA改变形状和重新定向所需时间。这个时间与DNA分子量呈正相关（Tr）2)

DNA移动时间：DNA分子向前移动时间（Tm）3)

电场脉冲时间：其电场方向所连续时间（Tp）第37页与分子量小DNA分子相比，分子量大DNA分子需要较多次数来更换其构型和方位，使之能够按新方向游动，所以迁移率就慢，从而到达了分离大分子量DNA分子目标。第38页能够分离几千kbDNA分子。这个长度范围包含许多真核生物染色体分子，包含酵母、许多主要丝状真菌和原生动物，如疟疾新生虫。所以，能够得到这些生物体染色体凝胶图谱。

第39页PFGEcanresolvelargeDNAfragments第40页第41页染色体DNA电泳用途

1.测定染色体数目：尤其适合于低等真核生物

2.

测定基因连锁关系：结合DNA杂交技术，可适合各种生物

3.

染色体DNA重排分析

1）酵母细胞经X-射线照射，染色体发生断裂，可得弥散型。但让其修复后，又可形成带，但有发生了重排，造成带型改变

2）非洲锥虫：变异表面糖蛋白基因表示

4.

疾病诊疗引发某种皮肤病原生动物Leishmania,含有其特征性染色体。PFG便可用于诊疗。第42页

方法：不一样RNA电泳方法是依据使RNA分子变性所采取方法。这些方法不但要使RNA分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。1.

乙二醛/二甲基亚砜法原理：乙二醛能够与核酸、核苷酸及碱基发生反应，尤其是鸟苷形成一个稳定附加环，从而阻止GC碱基互补作用发生。步骤：RNA+10mM羟甲基醛和50%DMSO混合50℃、1h变性点样电泳染色观察

5RNA凝胶电泳第43页2.羟甲基汞法原理：羟甲基汞可与RNA分子嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键亚氨基处。步骤：RNA+10mM羟甲基醛，点样在含4mM羟甲基醛琼脂糖凝胶上，电泳，染色观察第44页

3.

甲醛法步骤：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺，点样在含2.2M甲醛琼脂糖凝胶上，MOPS缓冲液电泳，染色观察其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于RNA电泳.4.

三种方法比较第一个方法安全，但因为反应是不可逆，由此回收RNA样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法反应可逆，回收RNA样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂有毒。第45页6蛋白质电泳方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为SDS。差异：有没有变性剂用途：非变性凝胶可用于蛋白质分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色改变）SDS可用于蛋白质分子量、亚基组成测定。mRNA翻译产物，基因表示产物测定等。

第46页用于DNA、RNA以及蛋白质回收方法

1)

电洗脱法:利用电泳方法将凝胶中特定核酸分子洗脱到其它介质中；

2)滤纸法—核酸凝胶染色，长波紫外光确定位置，在分离带前方切一口子并插入滤纸条(其后面覆盖透析袋膜)，电泳至DNA带全部进入滤纸条，洗脱DNA，纯化、沉淀

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