错配修复蛋白（MMR）免疫组化检测规范

1错配修复蛋白(MMR)免疫组化检测规范本文件规定了错配修复蛋白免疫组化检测的基本要求、前处理、操作流程及质量控制等要求。本文件适用于实验室开展错配修复蛋白免疫组化检测，相关质控中心在进行免疫组化染色评价时可参考使用。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1克隆号用于跟踪和识别不同的抗体克隆，以区分其特定性能和功能的唯一编号。3.2组织固定在组织离体后使用各种方法（通常是10%中性缓冲福尔马林溶液使其细胞内的物质尽可能接近其在体状态时的形态结构和位置的过程。3.3包埋应用模具，将经过固定、脱水、透明、浸蜡的组织埋入熔蜡中，使组织和液态石蜡相熔一体并迅速冷却，形成组织蜡块。3.4免疫组化利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记在抗体上的显色物质（荧光素、酶、金属离子、同位素、色原体）显色来检测组织细胞抗原，对其进行定位、定性及半定量检测的技术。4缩略语下列缩略语适用于本文件。MMR：错配修复（MismatchRepairMLH1：MutL蛋白同源物1（MutLProteinHomolog1）；MSH2：MutS蛋白同源物2（MutSProteinHomolog2）；MSH6：MutS蛋白同源物6（MutSProteinHomolog6）；2PMS2：减数分裂后分离增强蛋白2（PostmeioticSegregationIncreased2）；5基本要求5.1人员要求相关专业人员应经过考核或培训获得免疫组化操作资质，遵循标准化操作文件的规定，独立开展并完成免疫组化和免疫细胞化学相关试验,及时完成原始记录和复核；并能解决实验过程中的常见问题。5.2设备要求所有免疫组化检测相关设备，包括自动化染色仪器、切片机、烤箱、摊片机、试剂保存冰箱、pH计等均有完善的使用以及维护保养记录，并定期进行参数校准。针对自动化染色仪器，应定期进行结果比对。5.3试剂要求免疫组化试剂应在效期内使用，新购买的试剂应按照试剂要求分别存放。其中抗体类试剂，应符合法规的要求，并做好存储环境的温度定期记录。试剂在启用前应按照质量控制要求进行验证并记录，通过后方可使用。5.4实验室质控管理实验室应建立免疫组化实验所需仪器、试剂及操作相关质量控制文件，包括制片规范和质量控制制度、试剂有效期管理制度、化学药品安全使用制度、免疫组化操作制度等。5.5实验室环境要求应监测实验室温湿度环境，温度应保持在20℃~25℃的范围内，湿度应保持在20%～70%的相对湿度。6免疫组化检测组织的前处理6.1组织固定组织离体后应使用标本体积5～10倍量的10%中性缓冲福尔马林及时固定，一般不应超过1h，对于胃癌等有特殊要求的标本，应在30min内固定,细胞学及穿刺标本应立即固定。当组织较大时，应将其每隔5mm～10mm切开，并嵌入纱布或滤纸等物，以保障固定液的充分渗透和固定，依据组织大小，固定时间为6h～72h，对于活检小组织固定时间亦不应少于6h。6.2脱水、透明、浸蜡科室应根据实际情况，使用自动组织脱水机。根据处理组织的类型和大小以及脱水机的工作效率，通过严格的测试，制定标准化的组织脱水、透明、浸蜡流程及试剂更换程序。宜使用二甲苯作为组织透明剂。每日应监控组织脱水机中的石蜡温度和缸内的石蜡体积，及时补充或更换石蜡。6.3组织包埋宜参考免疫组化检测技术共识，将待检组织平放于包埋模具中，根据组织的类型决定包埋方向。6.4组织切片3免疫组化检测应使用免疫组化防脱玻片，对于自动化染色仪器，应使用亲水性玻片。切片厚度为2μm～4μm，确保石蜡切片与载玻片间无气泡。捞取的玻片于室温下垂直放于切片架中，沥干水分。捞片池应使用蒸馏水，并每天更换。在捞片过程中，应将液面漂浮的多余组织去除，避免组织交叉污染。6.5烤片烤片温度宜高于石蜡熔点2℃~3℃,通常在60℃~65℃烤箱中烤片60min～120min，保证后续染色操作不脱片。6.6切片保存对于暂时不进行检测的切片，应捞片后放置室温沥干水分，在烤箱中短时间烤片5min将蜡质融化，宜2周内使用，也可于4℃冰箱冷藏保存，一个月内完成检测。7操作流程7.1试剂准备7.1.1抗体选择7.1.1.1MLH1常见的克隆号有：ES05(Dako,Novocastro/Leica),M1(Ventana/Roche)，GM011(SakuraFineTek)。通过优化合适的修复条件及抗体孵育条件，实验室能够获得最佳染色结果。7.1.1.2MSH2常见的克隆号有：G219-1129(Ventana/Roche,Cellmarque),FE11(Dako,Biocare),79H11(Leica,BPM6143,RED2(SakuraFineTek),QR010,ZR260等。通过优化合适的修复条件及抗体孵育条件，实验室能够获得最佳染色结果。其中mAb克隆FE11和G219-1129在实验室自建方法检测中，宜采用基于碱性缓冲液的抗原修复方式。7.1.1.3MSH6常见的克隆号有：EP49(Dako,LeicaBiosystems),SP93(Ventana/Roche),44(Ventana/Roche,Diagnostic)等。通过优化合适的修复条件及抗体孵育条件，实验室能够获得最佳染色结果。无论采用何种克隆，准确的抗体稀释倍数（浓缩液），高效抗原修复方式（最好在高pH值下）和基于三步聚合物/多聚体的检测系统是获得最佳结果的先决条件。7.1.1.4PMS2目前常见的克隆号有：EP51(Dako,LeicaBiosystems),A16-4(Ventana/Roche)等。通过优化合适的修复条件及抗体孵育条件，实验室能够获得最佳染色结果。无论采用何种克隆，在高pH值下准确的抗体稀释倍数（浓缩液）和高效抗原修复方式是获得最佳结果的主要方案先决条件。通常采用3步法聚合物/多聚体的检测系统都可用于提供最佳结果。7.1.2抗体验证7.1.2.1建立对照体系4新抗体在用于诊断前，宜参考抗体推荐的修复液类型，摸索其最佳反应条件，包括：抗体效价、阳性组织、阴性组织、染色定位等。对于同一时间送货的同批次同种试剂可选择其中一支进行验证，对于非同一时间送货的同批号试剂建议再次验证。应建立完善的对照体系验证新批次抗体的有效性。准备包含已知阳性（强、弱）和阴性表达的组织切片并确保实验流程、试剂（二抗、显色剂）正常工作。7.1.2.2梯度预实验新抗体到货后，不应直接使用说明书推荐的浓度进行大批量样本检测，应通过预实验确定该批次的最佳工作条件。首先查阅说明书与数据库，确认抗体的应用范围（IHC-P/IHC-F）、宿主物种、克隆号等信息。针对即用型抗体，使用复合对照蜡块，应用不同的抗原修复条件（如pH6.0柠檬酸vspH9.0EDTA）及一抗孵育时间进行组合测试。针对浓缩液抗体，在复合对照蜡块上，除应用不同的抗体浓度和抗原修复条件（如pH6.0柠檬酸vspH9.0EDTA）外，参考厂家推荐的起始浓度，应设置三至五个不同的稀释梯度，进行组合测试以确定合适的抗体染色条件。7.1.2.3结果评估染色测试片结果由经验丰富的病理医生或研究人员盲法阅片。观察阳性信号的定位是否正确（核、膜、浆），评估信噪比（特异性染色与背景染色的比值）。7.1.3确定标准操作程序选定最佳的抗体浓度和修复条件，并做好记录作为该批次抗体后续使用标准操作程序。在使用过程中，持续记录染色结果，一旦出现异常（如背景突然变深应及时排查是否为抗体失效或操作环节偏7.2染色程序推荐使用自动化的仪器进行免疫组化染色，表1、表2、表3为目前主流即用型抗体染色条件，以下条件均为样本在标准前处理前提下的实验结果，如前处理流程有改变，各实验室需要依据本科室情况进行调整。表1即用型抗体染色条件-Dako（仪器内置程序）抗体平台MLH1(ES05)MSH2(FE11)MSH6(EP49)PMS2(EP51)Dako/Autostainerlink48Dako/Omnis5表2即用型抗体染色条件-Roche/Ultra（MMR试剂盒程序）抗体平台MLH1(M1)MSH2(G219-1129)MSH6(SP93)PMS2(A16-4)Roche/Ultra表3即用型抗体染色条件-Leica/BondIII（Nordiqc推荐程序）抗体平台MLH1(ES05)MSH2(79H11)MSH6(EP49)PMS2(EP51)Leica/BondIII7.3免疫组化染色质量控制7.3.1基本要求6免疫组化的质量控制，包括室内质量控制和室间质量评价，贯穿于病理科免疫组化实验的全流程，任何一个环节的调整及试剂的更换均应记录在案，有据可查。每张免疫组化染色切片都含有相应对照，且受测组织与对照组织在同一载玻片上，在相同条件下进行染色。实验室应根据实际情况每年参加不同的室间质评。7.3.2MLH1细胞核表达组织包括以下两种情况，对照组织表见表4：——阳性表达组织：推荐阑尾和扁桃体作为MLH1阳性组织对照，见图1和图2。所有外套区B细胞都必须表现出至少弱到中度的核染色反应，而在增殖的生发中心B细胞中必须看到中度到强的核染色反应。——阴性表达组织：建议将MLH1表达缺失的结肠腺癌作为MLH1的阴性组织对照。在肿瘤细胞中不应看到核染色反应，而在基质细胞中必须看到核染色反应。MLH1表达缺失的结肠腺癌中分散的肿瘤细胞中可见核膜的弱染色反应。表4MLH1细胞核阳性对照组织表7图2扁桃体7.3.3MSH2细胞核表达组织包括以下两种情况，对照组织表见表5：——阳性表达组织：推荐阑尾和扁桃体，作为MSH2阳性组织对照见图3和图4。所有外套区B细胞都必须表现出至少弱到中度的核染色反应，而在增殖的生发中心B细胞中必须看到中度到强的核染色反应。——阴性表达组织：建议将MSH2表达缺失的结肠腺癌作为MSH2的阴性组织对照，见表4。在肿瘤细胞中不应看到核染色反应，而在基质细胞中必须看到核染色反应。表5MSH2细胞核阳性对照组织表8图4扁桃体7.3.4MSH6细胞核表达组织包括以下两种情况，对照组织表见表6：——阳性表达组织：推荐阑尾和扁桃体，作为MSH6阳性组织对照，见图5和图6。所有外套区B细胞必须显示出至少弱到中度的核染色反应，而在增殖的生发中心B细胞中必须看到中度到强的核染色反应。——阴性表达组织：建议将MSH6表达缺失的结肠腺癌建议作为阴性组织对照。在肿瘤细胞中不应看到核染色反应，而在作为内部阳性组织对照的基质细胞中必须看到核染色反应。表6MSH6细胞核阳性对照组织表9图6扁桃体7.3.5PMS2细胞核表达组织包括以下两种情况，对照组织表见表7：——阳性表达组织：推荐阑尾和扁桃体，作为PMS2阳性组织对照，见图7和图8。所有外套区B细胞都必须表现出至少弱到中度的核染色反应，而在增殖的生发中心B细胞中必须看到中度到强的核染色反应。——阴性表达组织：建议将PMS2表达缺失的结肠腺癌作为PMS2的阴性组织对照。在肿瘤细胞中不应看到核染色反应，而在基质细胞中必须看到核染色反应。表7PMS2细胞核阳性对照组织表图8扁桃体7.4检测结果判读参照表8进行检测结果判读。表8错配修复蛋白免疫组化检测结果解读简表MMR标志物常见表达模式罕见表达模式MLH1+-+++-+-PMS2+-+-+++-MSH2++-+++--MSH6++-+-++-MMR表型MMR完整MMR缺陷（dMMR）dMMRdMMRdMMRdMMRdMMRdMMR解读性结直肠癌;奇综合征的其他遗传性结直肠癌dMMR结直肠癌;或PMS2（罕见）胚系致病突变dMMR结直肠癌;EPCAM或MSH6（罕见）胚系致病突变dMMR结直肠癌;或PMS2胚系致病突变dMMR结直肠癌（少数病例与化疗反应相关）;或MSH2胚系致病突变dMMR结直肠癌;胚系致病突变dMMR结直肠癌;EPCAM胚系致病突变dMMR结直肠癌;MMR基因PMS2、MSH、MSH6、系致病突变备注：1.当IHC显示出不确定/模棱两可的结果时；2.可能存在前处理组织如固定不佳导致IHC结果假阴性或假阳性时；3.当IHC显示出异常模式或异质性表达时（例如细胞浆、点状和核周染色、局部缺失或局部减弱）时；4.当IHC仅显示一个异二聚体亚单位缺失（如仅MLH1，而不是两者都缺失）时。建议进一步行PCR和NGS方法检测MSI基因状态或是否存在MLH1甲基化等进行验证对比。8验证体系病理科实验室应整合“人机料法环”方法体系（见表9）进行全流程的质量控制及验证。表9“人机料法环”方法体系序号类型验证方法1科室应每半年进行一次岗位技能考评，参考5.1对操作人员的岗位要求，评估其业务能力，定期开展异常标本处理演练，通过案例学习强化差错预防意识；实施分层授权制度。2机（Machine）参考5.2要求，对免疫组化相关仪器如切片机、染色机、显微镜等需定期校准与性能验证并做好每日运行检查、月度深度保养，记录维护日志等。如失控，需联系相应售后人员对机器进行检修，并对检修后的机器再进行性能验证确认仪器符合要求。3料(Material)参考5.3要求，对于免疫组化所用到的抗体、缓冲液、玻片、水等材料进行监测。例如，选用来源明确、质量可靠的供应商，建立验收标准（如抗体效