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文档简介

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(RealtimeQuantitativePCR)

提纲：

实时荧光定量PCR原理

数学原理化学原理实时荧光定量PCR的方法应用绝对定量相对定量定量PCR的实验要素平台定量PCR仪器介绍实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。

与普通PCR的区别

普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。

定量PCR的数学原理

斜率与扩增效率

荧光定量PCR化学原理

非特异性荧光标记：

1、SYBRGreen

特异性荧光标记：

2、TaqMan1、SYBRGreen法SYBRGreen熔解曲线分析

SYBRGreen法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA

使用方便--不必设计复杂探针非常灵敏便宜2、TaqMan探针法

TaqMan作用机理

TaqMan法优缺点

Real-timePCR方法应用•绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)

病原体检测转基因食品检测基因表达研究•相对定量(RelativeQuantification，RQ)

基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究

绝对定量与相对定量的定义

绝对定量通过标准品定量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：•含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒•含有和待测样品相同扩增片段的cDNA•PCR的产物绝对定量：从荧光到拷贝数

相对定量通过内标定量

内标（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量

相对定量：参照因子Calibrator

相对定量分析方法1-ΔΔCt

相对定量分析方法2：双标准曲线法

目标基因与内参基因扩增效率不同

定量PCR的实验要素

样品

●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之间●DNA用量：0.05ng–100ng●RNA纯度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng总RNA反转录的cDNA取1uL

标准品

标准品梯度稀释方法

复管测试●样品和标准品都要重复●重复次数须遵循统计学要求平台PCR仪介绍ABI7500fast特征：使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）Rn=Normalization=Reporter/ReferencRotorgene6500HRM特征：36孔(普通透明0.2mlPCR管)或者72孔(特殊

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