荧光假单胞菌RpoS调控子的转录组分析

荧光假单胞菌RpoS调控子的转录组分析摘要：【目的】微生物活动是引起水产品腐败的主要原因。荧光假单胞菌是多种水产品的特定腐败菌。本文旨在研究RpoS调控子在荧光假单胞菌致水产品腐败过程中的调控功能和机制。【方法】利用Illumina高通量测序平台对荧光假单胞菌分离菌株及rpoS缺失突变株进行转录组测序分析，鉴定差异表达基因，通过生物信息学方法确定RpoS调控的基因分布情况和主要功能。【结果】基因表达差异分析显示，突变株相对于分离株，有20个基因上调，352个基因下调，在突变株中下调表达的基因包括胁迫耐受相关基因、群体感应相关基因以及腐败活性等相关基因。【结论】RpoS是荧光假单胞菌重要的腐败调节因子，为靶向控制细菌腐败作用和探索高效水产品保鲜技术提供理论基础。关键词：rpoS，荧光假单胞菌，转录组测序，胁迫耐受TranscriptomeanalysisofRpoSregulatorsinPseudomonasfluorescensAbstract:[Objective]Microbialactivityisthemaincauseofspoilageofaquaticproducts.Pseudomonasfluorescensisaspecificspoilagebacteriumofvariousaquaticproducts.ThepurposeofthisstudywastoinvestigatetheregulatoryfunctionandmechanismofRpoSregulatorintheprocessofaquaticproductspoilagecausedbyPseudomonasfluorescens.[Methods]Illuminahigh-throughputsequencingplatformwasusedtoanalyzethetranscriptomesequencingofisolatedstrainsofPseudomonasfluorescensandrpoSdeletionmutantstrains,identifydifferentiallyexpressedgenes,anddeterminethedistributionandmainfunctionsofgenesregulatedbyRpoSbybioinformatics.[Results]Theanalysisofgeneexpressiondifferencesshowedthat20geneswereup-regulatedand352genesweredown-regulatedinmutantstrainscomparedwithisolatestrains.Thedown-regulatedgenesinmutantstrainsincludedgenesrelatedtostresstolerance,quorumsensingandspoilageactivity.[Conclusion]RpoSisanimportantcorruption-regulatingfactorofPseudomonasfluorescens,whichprovidesatheoreticalbasisfortargetedcontrolofbacterialspoilageandexplorationofefficientfresh-keepingtechnologyofaquaticproducts.Keywords:rpoS,Pseudomonasfluorescens,transcriptomesequencing,stresstolerance我国水产品总量十分丰富，约占世界的1/3以上。由于水产品捕获集中，且蕴含丰富的营养成分，利于微生物的生长繁殖，如果捕获后未经及时的保鲜处理，从而极易腐烂。微生物污染是引起水产品腐败的主要原因，有研究表明全世界约30%的捕获鱼类是由于微生物单因素腐败作用导致损失的。而能够适应水产品贮存条件和本身性质的微生物，并且生长繁殖快，产生腐败产物的活性强，被称为特定腐败菌[1]。其中荧光假单胞菌是假单胞菌中主要的有氧冷藏的水产品特定腐败菌[2-4]。荧光假单胞菌属于革兰氏阴性好氧或兼性厌氧杆菌，广泛存在于自然环境中，适应的温度范围广，在25-30℃能够正常生长，且4℃也能够快速增殖[4]。荧光假单胞菌能够克服各种不利条件，包括高温、低温、渗透压、饥饿、乙醇、酸碱、氧化剂和食品保鲜剂等，并产生蛋白酶、脂肪酶、嗜铁素、粘液、生物膜、色素、生物表面活性剂、群体感应信号分子及其他代谢产物，并使水产品的肌肉和脂肪成分进一步分解，生成胺（氨）、醛、酮、酯和有机酸等各种具有腐臭特征的产物，导致色泽改变，品质变劣，甚至产生毒性[5]。全局转录调控蛋白RpoS是由细菌rpoS基因编码的RNA聚合酶的选择性sigma因子，也称作sigmaS或者sigma38，它能够协助RNA聚合酶识别启动子序列并启动下游相关基因的表达，起到基因转录调节的作用。RpoS调控子是目前发现的细菌应答多元胁迫反应最重要的全局调控蛋白，在细菌进入稳定生长阶段或应激条件下时，受到多种环境胁迫条件的强烈诱导，从而诱导抗胁迫相关基因的表达以提高胁迫条件的耐受力，如抗高渗胁迫相关基因osmY、otsAB，抗氧化相关基因sodC、katE，并且还能调控毒力相关基因的表达，包括胞外蛋白酶、生物膜、黏附因子（外膜蛋白、胞外多糖）、毒素及粘液等，如菌毛合成相关基因fapF等从而适应环境[6-8]。目前研究发现，RpoS调控子能够调控铜绿假单胞菌对氧化，饥饿，高温和渗透胁迫的耐受性[8]，调控铜绿假单胞菌中藻酸盐，外毒素A和分泌的蛋白酶的含量[9,10]，藻酸盐是胞外粘液的主要成分[8]；RpoS调控子能够调控解淀粉欧文氏菌及坂崎克罗诺杆菌对于氧化和酸胁迫的耐受性[11,12]；调控大肠杆菌中毒力因子curli的形成[13]；调控类鼻疽杆菌胞外蛋白酶和嗜铁素的分泌[14]；和调控假性耶尔森氏菌鞭毛，胞外多糖和生物膜的产生[15]；调控溶藻弧菌与毒力相关基因的表达，如胶原酶、酪蛋白酶、白蛋白酶和明胶酶等4种胞外蛋白酶的表达；调控荧光假单胞菌对不同胁迫条件下的耐受性，细胞外AHL水平，细胞外蛋白酶和TVB-N产生来影响腐败能力[16]。RpoS调控子在耐受性和毒力方面的调控作用不尽相同，为此我们推测RpoS调控子调控荧光假单胞菌与腐败相关的基因。但是，目前关于荧光假单胞菌尚不清楚有多少基因是由RpoS调控子调控，腐败作用调控机制研究报道较少。RpoS调控蛋白对下游基因的调控机制非常复杂，研究该蛋白对下游基因调节作用的传统方法主要有基因芯片、启动子融合等[17,18]，但是这些方法存在着检测程度不高或工作量过大等问题。RpoS调控子在铜绿假单胞菌和大肠杆菌的基因芯片鉴定结果如下：在铜绿假单胞菌中，772个基因在稳定期受RpoS调控子调控，但在对数生长期不受其调控，其中占总数的40％以上基因由群体感应调控[19]。RpoS调控子调控大肠杆菌K12菌株在稳定生长阶段和应激条件下10％的基因组[17,20]。近年来随着转录组测序技术的快速发展，新一代测序技术的出现，能够一次性全面快速地获取几乎所有转录本的序列情况和表达情况，转录本的结构以及结构变异情况，还可以发现稀有转录本和未知转录本，通过转录组测序从而准确地分析不同细菌或组织间基因表达情况、基因结构变异情况和基因调控功能，使得对调控蛋白的调控子进行细致的分析成为了可能。食源大肠杆菌0157:H7的低温转录组研究发现：DNA复制、蛋白合成、碳代谢相关基因的表达受到低温抑制，而RpoS调控子基因受到低温稳定诱导，其中包括多个耐低温相关基因[21]。玉米细菌性枯萎病菌的群体感应EsaR调控子的转录组测序研究发现：细菌群体感应EsaR调控子主要控制细菌荚膜和细胞壁合成、运动和粘附等基因的表达，并发现10个新的直接受EsaR调控的基因启动子，全面揭示了群体感应EsaR调控子的功能及调控机制[22]。本文通过采用Illumina高通量转录组测序技术分析荧光假单胞菌rpoS基因缺失突变株和野生型菌株的转录水平差异，能在较低成本下实现高通量，并能提供较详细的差异表达基因信息。之后通过生物信息学方法对差异表达基因进行功能注释及基因功能聚类分析，描述RpoS调控子基因的全景图，明确RpoS蛋白所调控的下游基因及功能，并通过采用qRT-PCR技术对转录组测序结果进一步验证。从而深入阐明RpoS在荧光假单胞菌致水产品腐败过程中的调控功能和机制，为靶向控制细菌腐败作用和探索高效水产品保鲜技术提供理论基础。1.材料与方法1.1细菌菌株与培养条件细菌菌株：荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）野生型UK4菌株和rpoS基因缺失突变株。培养条件：在LB或NB培养基中以220rpm，28℃下摇床上振荡培养。1.2Illumina文库构建和RNA测序将荧光假单胞菌野生型UK4菌株和rpoS基因缺失突变株一式三份分别接种到60mLNB液体培养基中。并置于28℃摇床，220rpm振摇培养过夜。检测过夜培养的野生型UK4菌株和rpoS基因缺失突变株菌液的吸光度，当OD600达到约1.5（细菌生长进入平台期）时，进行7000g，5分钟室温离心菌液，去净上清，用液氮进行速冻。之后按照TRIzol®PlusRNAPurificationKit（Invitrogen）试剂盒说明书提取样品总RNA，RNase-FreeDNaseSet（Qiagen）去除基因组DNA，最终RNA溶于40-100μLRNase-FreeWater。采用紫外分光光度计测定RNA纯度。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。当样品检测合格后，使用Ribo-Zero试剂盒来去除rRNA富集mRNA。之后加入fragmentationbuffer将mRNA裂解成短片段，使用六碱基随机引物(randomhexamers)以mRNA为模板，来合成第一链cDNA，随后加入缓冲液、dNTPs和DNApolymeraseI和RNaseH合成第二链cDNA，再用AMPureXPbeads纯化双链cDNA，之后用USER酶降解含有dUTP的cDNA链。对纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头，再用AMPureXPbeads进行片段大小选择。最后进行PCR扩增，并用AMPureXPbeads纯化PCR产物，得到最终的文库。使用Qubit2.0对所得文库进行初步定量，稀释至1ng/ul。之后使用Agilent2100进行验证后，Q-PCR进行准确定量，最后cDNA文库在IlluminaHiSeq4000平台（Illumina，USA）上进行测序。1.3测序数据质量评估从原始数据（rawreads）去除含接头（adapter）的读段，去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10%的reads，去除低质量reads(质量值Qpred≤5的碱基数占整个read的50％以上的reads)，最终得到cleandata（cleanreads）。同时计算了cleanreads的Q20，Q30和GC的含量（表1）。用Bowtie2与参考基因组序列比对（表2），进行基因组定位分析（软件中设置mismatch为2，其余均为默认参数）。Totalmapped均接近100%。1.4差异表达基因分析使用FPKM（每百万fragments中来自某一基因每千碱基长度的fragments数目）方法来分析基因表达水平（转录本丰度）[23]。FPKM值是目前常用的基因表达水平估算方法，因为该方法消除了由于基因长度不同和测序深度差异对基因表达水平计算的影响。FPKM>1的被认为基因是有表达的。通过软件DEGseq计算出转录本的foldchange并筛选所有差异表达基因。差异表达基因的标准是|log2foldchange|≥1且padj≤0.05，并制作差异基因火山图（图1）。1.5差异表达基因GO富集分析采用软件GOseq[24]对差异表达基因从分子功能，生物过程，细胞组分三个方面进行GeneOntology（简称GO）富集分析。GO是基因本体联合会建立的数据库。基因或蛋白质可以通过ID对应或者序列注释的方法找到与之对应的GO编号，而GO编号可用于对应到Term，即功能类别或者细胞定位。当GO的p<0.05被认为有意义，其中选取了富集最显著的30个GOterm进行展示（图2）。1.6使用qRT-PCR进行差异表达基因验证为了验证转录组测序的结果，从差异表达基因中选取31个基因进行qRT-PCR验证。qRT-PCR是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析的技术。Ct值是指在PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。当起始模板的DNA含量越高，荧光达到阈值的循环数就越少，即Ct值越小，通过结合标准曲线从而实现目的DNA的定量。首先同样按照上述方法对荧光假单胞菌野生型UK4菌株和rpoS基因缺失突变株进行振荡培养，按照说明书提取RNA（各三个平行样本），并用紫外分光光度计测定RNA含量、纯度及质量（表3），琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性（图3）。之后使用SuperScript™IIIFirst-StrandSynthesisSuperMixforqRT-PCR（Invitrogen，USA）试剂盒逆转录合成cDNA的第一条链1st-StrandcDNA。然后将所得的cDNA作为qRT-PCR的模板。采用软件设计31个差异表达基因的qRT-PCR引物，并送往引物合成公司合成。引物合成之后进行如下操作，使用PowerSYBR®GreenPCRMasterMix（ABI，USA）试剂盒进行qRT-PCR，实验操作按照说明书进行。配制qPCR体系（20μL）：SDW试剂8μL，PowerSYBR®GreenMasterMix10μL，引物（10μM）各0.5μL，cDNA1μL，冰上，避光，配制于qRT-PCR专用8联管内。各样品复孔3次。设置qRT-PCR程序：95℃，1min；40个循环（95℃，15sec，63℃，25sec，收集荧光），55to95℃熔解曲线。运行qRT-PCR仪并收集数据，运用相应软件分析整理相关数据，以16S基因rDNA序列作为内标基因，采用2-ΔΔCt法分析基因的表达差异，将其结果与转录组测序结果进行比较（图4）。结果与讨论2.1数据产出质量情况一览表通过对荧光假单胞菌野生型UK4菌株和rpoS基因缺失突变株一式三份进行转录组测序，所得数据如下：表1.数据产出质量情况一览表Table1.ListofdataoutputqualitySamplenameRawreadsCleanreadscleanbasesErrorrate(%)Q20(%)Q30(%)GCcontent(%)UK4_123377532226771183.4G0.0198.059554.52UK4_214873996147413942.21G0.0198.4495.7854.89UK4_315034976149099742.24G0.0198.3695.5954.65AverageofUK417762168174428292.62G0.0198.2895.4654.69RpoS_116885484163943582.46G0.0198.1395.1355.11RpoS_219948546193731342.91G0.0198.3495.5655.07RpoS_321280570209389463.14G0.0198.1295.2254.99AverageofRpoS19371533189021462.84G0.0198.295.355.06Q20、Q30：分别计算Phred数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比。该数据质量表格得出，通过对rawreads进行过滤后，UK4平均有17442829个cleanreads，突变株平均有18902146个cleanreads，平均得到2.62G和2.84G的总cleanbases。在cleanreads中，Q20和Q30值分别>98％和95％，表明数据质量良好。后续分析均基于高质量的cleandata。2.2Reads与参考基因组比对情况一览表表2.Reads与参考基因组比对情况一览表Table2.AlistofReadsversusreferencegenomesSamplenameUK4_1UK4_2UK4_3RpoS_1RpoS_2RpoS_3Totalreads226771181474139414909974163943581937313420938946Totalmapped22300840(98.34%)14703955(99.75%)14871881(99.74%)16322636(99.56%)19272599(99.48%)20861124(99.63%)Multiplemapped142188(0.63%)76510(0.52%)74008(0.5%)142330(0.87%)159555(0.82%)174854(0.84%)Uniquelymapped22158652(97.71%)14627445(99.23%)14797873(99.25%)16180306(98.69%)19113044(98.66%)20686270(98.79%)Read-111082240(48.87%)7314706(49.62%)7399911(49.63%)8093049(49.36%)9559261(49.34%)10346045(49.41%)Read-211076412(48.84%)7312739(49.61%)7397962(49.62%)8087257(49.33%)9553783(49.31%)10340225(49.38%)Readsmapto'+'11081461(48.87%)7314411(49.62%)7399626(49.63%)8091818(49.36%)9558030(49.34%)10344864(49.4%)Readsmapto'-'11077191(48.85%)7313034(49.61%)7398247(49.62%)8088488(49.34%)9555014(49.32%)10341406(49.39%)从表中可以看出，通过将荧光假单胞菌转录组的cleanreads映射到UK4的参考基因组序列。在所有样本中，基因组的唯一映射率至少为97.7%。2.3差异表达基因分析利用差异统计标准（|log2foldchange|≥1，padj≤0.05）对荧光假单胞菌野生型UK4菌株和rpoS基因缺失突变株进行转录本丰度分析，共鉴定出372个差异表达基因（DifferentialExpressedGenes）。在这些差异表达基因中，与野生型UK4菌株相比，rpoS基因突变株有352个显著下调，20个显著上调，155个差异表达基因被认为是由50个操纵子组成。图1.差异基因火山图Figure1.Volcanomapofdifferentialgenes有显著性差异表达的基因用红色点（上调）和绿色点（下调）表示，无显著性差异表达的基因用蓝色点表示；横坐标代表基因在不同样本中表达倍数变化；纵坐标代表基因表达量变化差异的统计学显著性2.4差异表达基因GO富集对荧光假单胞菌野生型UK4菌株和rpoS基因缺失突变株的差异表达基因从生物过程(biologicalprocess)、细胞组分(cellularcomponent)和分子功能(molecularfunction)三个方面进行GO富集分析。在生物过程方面上，差异表达基因主要参与了磷酸化信号转导系统、细胞通讯、应激反应、多糖代谢过程等。在分子功能方面上，差异表达基因主要富集在水解O-糖基化合物的水解酶活性、传递己糖基的转移酶活性、和以过氧化物为受体的氧化还原酶活性等。其中选取了富集最显著的30个GOterm。图2.GO富集柱状图Figure2.GOenrichmenthistogram纵坐标为富集的GOterm，横坐标为该term中差异基因个数。不同颜色用来区分生物过程、细胞组分和分子功能2.5qRT-PCR验证2.5.1通过紫外分光光度计测得提取的6个RNA样品的含量及纯度如下。表3.样品RNA含量及纯度Table3.RNAcontentandpurityofsamples样品编号260/280ng/μL体积（μL）总量（μg）UK411.93208.41408.34UK421.92187.86407.51UK431.91198.17407.93Δrpos11.94170.61406.82Δrpos21.97186.22407.45Δrpos31.95155.06406.20通过该表看出荧光假单胞菌野生型UK4菌株和rpoS基因缺失突变株的RNA样品OD260/OD280均位于正常范围之内，表明RNA纯度较高。样品浓度较高，可以用于荧光定量PCR检测。2.5.2荧光假单胞菌野生型UK4菌株和rpoS基因缺失突变株的6个RNA样品的琼脂糖凝胶电泳检测结果如下。图3.总RNA电泳检测Figure3.TotalRNAelectrophoresisdetection电泳结果显示26S及16S条带清晰，无明显拖尾，26S/16S≥1，证明提取的RNA完整性较好，无降解。2.5.3为了验证转录组测序实验所得的数据，从差异表达基因中随机选择31个基因进行qRT-PCR验证。将检测合格的荧光假单胞菌野生型UK4菌株和rpoS基因缺失突变株的RNA样品进行逆转录合成cDNA，并作为qRT-PCR的模板。下图是qRT-PCR与转录组测序的结果比较显示：除了RS02950外，其它与转录组测序结果数据一致，表明我们的测序结果是可靠。图4.qRT-PCR对转录组测序数据进行验证的结果图Figure4.ResultsofqRT-PCRverificationoftranscriptomesequencingdata白色条表示转录组测序数据，黑色条表示rpoS突变株与野生型菌株相比的log2(foldchange)平均值。qRT-PCR结果是每个基因3个生物重复和3个技术重复的平均值。误差条代表标准差。结论在本研究中，以荧光假单胞菌野生型UK4菌株和rpoS基因缺失突变株为研究对象，采用转录组测序技术分析RpoS调控子的功能。结果表明，RpoS调控子调控细胞通讯、多糖代谢、胞内分泌和胞外结构、应激反应、氨和生物胺代谢等。这些细胞过程可能与荧光假单胞菌的群体感应、胁迫耐受性和腐败活性相关。这一发现拓展了我们对细菌腐败调节机制的认识。RpoS调控子及其调控相关基因可作为食品防腐剂筛选的潜在靶点，也可作为微生物食品安全和食品质量评价的分子标记，以及为靶向控制细菌腐败作用和探索高效水产品保鲜技术提供理论基础。参考文献DalgaardP.ModelingofMicrobialActivityandPredictionofShelf-LifeforPackedFreshFish[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,1995,26(3):305.郭全友,许钟,杨宪时.冷藏罗非鱼特定腐败菌的鉴定和生长动力学[J].渔业科学进展,2009,30(4):117-123.蓝蔚青,谢晶.冷藏带鱼贮藏期问主要微生物动态变化的PCR-DGGE分析[J].食品工业科技,2012,33(17):118-122.ShenQ,YangQ,CheungHY.Hydrophilicinteractionchromatographybasedsolid-phaseextractionandMALDITOFmassspectrometryforrevealingtheinfluenceofPseudo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