DB31∕T 1287-2021 实验东方田鼠病原学等级及监测

ICS65.020.30CCSB44DB31DB31/T1287—2021实验东方田鼠病原学等级及监测Laboratoryreedvolepathogenstandardsandmonitoring2021-02-01发布上海市市场监督管理局发布IDB31/T1287—2021前言 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 25东方田鼠病原学等级 26检测指标 36.1外观要求 36.2病原学检测项目 37检测程序 38检测方法 49监测规则 49.1检测频率 49.2采样要求 49.3样本采集 510结果判定 511报告 5附录A(规范性)实验东方田鼠病原体PCR检测方法 6Ⅱ本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由上海市科学技术委员会提出并组织实施。本文件由上海市实验动物标准化技术委员会归口。本文件起草单位：上海实验动物研究中心、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心。本文件主要起草人：谢建芸、魏晓锋、冯洁、熊炜、林金杏、薛俊欣、王胜昌、高诚。本文件为首次发布。1本文件规定了实验东方田鼠病原学等级及监测，包括实验东方田鼠病原学等级、检测指标、检测程序、检测方法、监测规则、结果判定和报告等要求。本文件适用于实验东方田鼠病原学等级、质量监测及管理。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本GB14922.1实验动物寄生虫学等级及监测GB14922.2实验动物微生物学等级及监测GB/T14926.1实验动物沙门菌检测方法GB/T14926.4实验动物皮肤病原真菌检测方法GB/T14926.6实验动物支气管鲍特杆菌检测方法GB/T14926.12实验动物嗜肺巴斯德杆菌检测方法GB/T14926.14实验动物金黄色葡萄球菌检测方法GB/T14926.41实验动物无菌动物生活环境及粪便标本的检测方法GB/T14926.42实验动物细菌学检测标本采集GB/T14926.43实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂GB/T14926.52实验动物免疫荧光试验GB/T14926.53实验动物血凝实验GB/T18448.1实验动物体外寄生虫检测方法GB/T18448.2实验动物弓形虫检测方法GB/T18448.3实验动物兔脑原虫检测方法GB/T18448.4实验动物卡氏肺孢子虫检测方法GB/T18448.6实验动物蠕虫检测方法GB/T18448.10实验动物肠道鞭毛虫和纤毛虫检测方法下列术语和定义适用于本文件。3.1实验东方田鼠laboratoryreedvole(Microtusfortis)经人工饲养，对其携带的微生物和寄生虫等病原进行控制，来源清楚或遗传背景明确，用于生产、科学研究以及实验教学的东方田鼠。3.2普通级东方田鼠conventional(CV)reedvole不携带所规定的人兽共患病病原和东方田鼠烈性传染病病原的东方田鼠。2DB31/T1287—20213.3无特定病原体级东方田鼠specificpathogenfree(SPF)reedvole除普通级东方田鼠应排除的病原外，不携带对实验东方田鼠健康有较大危害、主要潜在感染或条件致病病原以及对科学研究干扰大的病原的东方田鼠。3.4无菌级东方田鼠germfree(GF)reedvole无任何可检出的细菌、病毒和寄生虫等病原的东方田鼠。4缩略语下列缩略语适用于本文件。4.1PCR:聚合酶链反应(polymerasechainreaction)5东方田鼠病原学等级普通级东方田鼠、无特定病原体级东方田鼠、无菌级东方田鼠病原学具体控制指标见表1。表1实验东方田鼠病原检测项目无菌级普通级●皮肤病原真菌PathogenicdermalfungiO●汉坦病毒Hantavirus(HV)●体外寄生虫(节肢动物)Ectoparasites●●无特定病原体级O●●●金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus●仙台病毒SendaiVirus(SV)●小鼠肺炎病毒PneumoniaVirusofMice(PVM)●●全部蠕虫AllHelminths●卡氏肺孢子虫PneumocystiscariniiO兔脑原虫EncephalitozooncuniculiO鞭毛虫Flagellates●纤毛虫Cilliates●●DB31/T1287—202136检测指标6.1外观要求外观健康、行为体征正常。6.2病原学检测项目东方田鼠病原学检测项目见表1。7检测程序对受检实验东方田鼠应在当日按细菌、真菌、病毒和寄生虫要求联合取样检测，检测程序见图1。实验东方田鼠外观检查编号麻醉采血皮肤取样无菌解剖，取脏器、气管分泌物、肠内容物(新鲜粪便)等检测检测报告真菌检测体外寄生虫检测图1检测程序48检测方法检测方法见表2。表2东方田鼠微生物检测方法病原检测项目检测方法沙门菌按照GB/T14926.1实验动物沙门菌检测方法皮肤病原真菌按照GB/T14926.4实验动物皮肤病原真菌检测方法支气管鲍特杆菌按照GB/T14926.6实验动物支气管鲍特杆菌检测方法嗜肺巴斯德杆菌按照GB/T14926.12实验动物嗜肺巴斯德杆菌检测方法金黄色葡萄球菌按照GB/T14926.14实验动物金黄色葡萄球菌检测方法体外寄生虫按照GB/T18448.1实验动物体外寄生虫检测方法弓形虫按照GB/T18448.2实验动物弓形虫检测方法兔脑原虫按照GB/T18448.3实验动物兔脑原虫检测方法卡氏肺孢子虫按照GB/T18448.4实验动物卡氏肺孢子虫检测方法全部蠕虫按照GB/T18448.6实验动物蠕虫检测方法鞭毛虫按照GB/T18448.10实验动物肠道鞭毛虫和纤毛虫检测方法纤毛虫按照GB/T18448.10实验动物肠道鞭毛虫和纤毛虫检测方法泰泽病原体按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法肺支原体按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法汉坦病毒按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法仙台病毒按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法小鼠肺炎病毒按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法呼肠孤病毒Ⅲ型按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法无菌动物按照GB/T14926.41实验动物无菌动物生活环境及粪便标本的检测方法9监测规则9.1检测频率每3个月至少检测一次。9.2采样要求选择8周龄以上实验东方田鼠用于检测。DB31/T1287—202159.2.2采样数量同一实验东方田鼠生产繁殖单元或种群，根据种群规模确定取样数量，具体见表3。表3实验东方田鼠不同繁殖单元或种群取样数量群体数量(只)取样数量(只，雌雄各半)小于100不少于6100～500不少于10大于500不少于209.3样本采集样本采集的部位取决于所检病原体在宿主体内、外的特定定植部位或病变部位：a)对于寄居于呼吸道的病原体，应采集气管分泌物或气管中段；b)定位于肠道的病原体，应采集回盲部内容物或粪便；c)定植于皮肤的病原体，应采集皮肤样品；d)在血液中可以检测到的病原体，应采集血液样品；e)对其他特定定植部位的病原体，应采集特定部位组织。9.3.2采样方法采样方法根据不同的采样部位按下列方法进行：a)血液、皮肤、气管分泌物、回盲部内容物、粪便：按GB/T14926.42进行；b)组织样品：采用安乐死术处死实验东方田鼠，将动物仰卧并固定于解剖板上，剪除胸部、腹部鼠毛，用酒精消毒皮肤后解剖，暴露胸腔和腹腔，剪取相应器官或组织，放于灭菌离心管中用于提取核酸，进行核酸检测。9.3.3样本保存样品应保持新鲜，采样后原则上应立即进行细菌接种或提取核酸用于病原体的PCR扩增。不能立即接种的组织、拭子样品等须置于无菌试管2-8℃保存或存于运输培养基中，24h内完成接种；不能立即提取核酸的标本，在2～8℃条件下保存不应超过24h,超过24h保存的用于提取DNA的样品应置于-20℃以下冰箱，用于提取RNA的样品应置于-80℃以下冰箱，于2周内完成核酸提取。在被检样品中，如有1个样品1项指标不符合该等级要求，则判定该批次实验东方田鼠不合格；如所有被检样品所有指标均符合该等级要求，则判定该批次实验东方田鼠合格。根据检测结果，出具检测报告。报告应包括但不限于：被检动物批次、检测时间、检测项目、检测方法、检测结果、检测结论等内容。DB31/T1287—20216附录A(规范性)实验东方田鼠病原体PCR检测方法A.1材料A.1.1主要试剂除特别说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。核酸抽提试剂：核酸提取试剂盒或其他等效方法。反转录试剂：PrimeScriptRTreagent试剂盒或其他等效方法。PCR试剂：2×TaqPlusMasterMix(DyePlus)试剂盒或其他等效产品。扩增引物序列见表A.1,引物加灭菌去离子水配制成10μmol/L,-20℃以下保存。表A.1PCR引物序列、产物长度、扩增部位及扩增条件病原体名称引物序列扩增部位产物长度扩增条件泰泽病原体P1:5'-AACAGGATTAGATACCC-3'P2:5'-TGACGGGCGGTGTGTACAA-3'容物62595℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,20个循环P3:5'-GTGCTAGGTGTTGGGAAG-3'P4:5'-TACTTTACGTAGCCTGTCAA-3'95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,20个循环肺支原体P1:5'-AGCGTTTGCTTCACTTTGAA-3'P2:5'-GGGCATTTCCTCCCTAAGCT-3'气管中段26595℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒P1:5'-AGTGATGAGTCCTTCACATCCCA-3'P2:5'-GGATCCTAGGCATTTGATTGCGC-3'肝脏95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环汉坦病毒P1:5'-ACGAGGGGCAGCTTGTGATAGCAC-3'P2:5'-GACATCCTCATATGAGCTGTCATC-3肺、脾464仙台病毒P1:5'-CCACATTGGTCTCGTGTCAGATTC-3'P2:5'-CATCATTCACGAAATCCTGGAGTGTC-3'肺组织呼肠孤病毒Ⅲ型P1:5'-CAGTCGACACATTTGTGGTC-3'P2:5'-GCGTACTGACGTGGATCATA-3肝、心、脾小鼠肺炎病毒P1:5'-GGATCTTTCTAGTCCTTCTGGTG-3'P2:5'-CATCTCTAATCAATGCAATCTCAC-3'肺脏A.1.2主要仪器PCR仪、高速离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像仪。A.2方法A.2.1采样及标本处理7剖检动物，根据不同病原体特定定植部位采集0.2g病变组织、回盲部内容物或粪便，放于无菌离心管中，加入1mLPBS(pH7.4)充分匀浆，备用。A.2.2样品保存不能立即提取核酸的标本，在2~8℃条件下保存不应超过24h,超过24h保存的用于提取DNA的样品应置于-20℃以下冰箱，用于提取RNA的样品应置于-80℃以下冰箱，于2周内完成核酸提取。A.2.2核酸提取核酸提取按说明书进行。核酸样品经紫外分光光度计测定浓度，通过OD260/280比值判断质量，OD260/280比值在1.6～1.8之间为合格。制备好的核酸应尽快进行下一步PCR反应，若暂时不能进行PCR反应，DNA样品应置于-20℃以下冰箱保存，RNA样品应置于-80℃以下冰箱保存，2周内完成PCR扩增。A.2.3逆转录(仅限RNA病毒适用)RNA逆转录体系见表A.2。反应体系的配制应在冰浴上进行，反应条件为：37℃反转录反应15min,85℃反转录酶失活反应5s。反应产物即为cDNA,应立即进行下一步PCR反应，若不能立即进行PCR,cDNA样品应置于-20℃以下冰箱保存。表A.2RNA逆转录反应体