《环境监测》开放实验指导书

《环境监测》开放实验指导书

BOD传感器微生物固定化膜制备

一、实验目的

（一）掌握微生物的培养方法

（二）了解微生物的固定化方法

（三）熟练掌握BOD测定的传感器方法

二、实验原理

生物化学需氧量（BiochemicalOxygenDemand,简称BOD）,是利用好氧微

生物在分解水中有机物的生物化学氧化过程中所消耗的溶解氧量来表示水体有

机污染程度的综合指标。

BOD微生物传感器一般使用固定化微生物膜作为敏感元件，并与氧电极紧密

组合而成。将此电极置于恒温流通测量池中，当氧饱和的磷酸盐缓冲液通过流通

池时，微生物的呼吸活性是恒定的即内源呼吸状态，溶液中的溶解氧扩散进入氧

电极表面的速率达恒定时，输出一个稳定电流值。加入样品后，有机物进入流通

池，膜上微生物在同化有机物的同时呼吸活性增强即外源呼吸状态，消耗溶解氧,

其扩散进入电极表面的速率减小，输出电流值降低，几分钟内达到新的动态平衡。

上述两种稳定电流之差，与进入流通池中的有机物浓度呈线性关系，借此间接计

算出BOD值⑸。原理示意图见图l-lo

a外源呼吸状态b内源呼吸状态

k,的极2.固定化微小物膜3.微牟物

图ITBOD微生物传感器原理示意图

三、仪器和试剂

（一）主要仪器

1.电热高压蒸汽灭菌锅上海宜川仪表厂

2.振荡培养箱江苏金坛新一佳仪器厂

3.离心分离机德国HERMLE-Z323

4.恒温水浴箱Barnstead/ThermolyncCorporationinU.S.A

5.C31/1-UA型电流表上海良标智能终端股份有限公司

6.3066-PEN记录仪四川仪表厂

7.SJG-203A溶解氧分析仪上海雷磁仪器厂

8.AB204-N电子天平Mettler-ToledoInstrumentsCorporation

9.FU.HUA快速混匀器金坛市富华电器有限公司

（二）试剂

1.牛肉浸膏生化试剂上海长阳生化制药厂

2.葡萄糖分析纯石家庄市试剂厂

3.谷氨酸分析纯湖州生物叱学厂

4.可溶性淀粉分析纯张家口市化学试剂厂

5.蛋白陈细菌培养基用大五容易化学株式会社

6.辅料A

7.磷酸二氢钾分析纯北京益利精细化学品有限公司

8.磷酸氢二钠分析纯天津市河东区红岩试剂厂

9.醋酸纤维素膜北京化工学校附属工厂

10.亲水性聚四氟乙烯膜华恒高科工程技术（北京）有限公司

11.蒸僧水

（三）主要试剂

（1）BODs标准溶液:葡萄糖溶液150mg/L和谷氨酸溶液150mg/L的混合溶液,

称GGA溶液,其BODs为（198土30.5）nig/Lo

（2）磷酸盐缓冲溶液:分别取Na2HP0,-1211.05.970g,KH2Poi0.4539g溶于1200ml

水中，终pH=7.78,含盐浓度为0.234%（w/v）o

四、实验步骤

（一）菌种及培养

菌种：菌种为河北科技大学环境学院生物检测技术实验室筛选、驯化的地衣芽狗

杆菌（Bacillus1icheniformis,）0

菌种的培养基:牛肉膏0.3乐蛋白陈0.5乐葡萄糖0.5乐可溶性淀粉0.5%加

入蒸锵水加热使之溶解，此时溶液呈澄清透明，放置使其冷却至常温，调节PH值

到7.0〜7.2之间。

灭菌：将盛有液体培养基的三角瓶放入电热高压蒸汽灭菌锅中，升温至压力

0.lMPa,3。分钟后灭菌完毕，静置至温度降低。

培养方法：将菌种用接种针在超净台上接到灭菌后的液体培养基的三角瓶中，在

35℃下培养24h,于离心分离机上离心分离得到湿菌体。用pH=7.76的磷酸盐缓

冲溶液洗涤两次，静置2分钟，倒去上清液，称取0.5g湿菌体加1ml人工模拟海

水配制成0.5g/ml的菌悬液。

（二）微生物的固定化及膜的制备

I、材料选择

膜原料：膜选用醋酸纤维素膜。

粘接剂：双面胶，辅料选用硅藻土。

2、微生物的固定化及膜的制备

在菌悬液中加入一定量的辅料硅藻土，振荡混合均匀。用微量取液器分别吸

取一定量含硅藻土的菌悬液滴在直径13mm,孔径0.45um的醋酸纤维素膜上，

然后用一个相同的膜覆盖上，用双面胶将两层膜边沿粘合起来。

3、传感器的组装

将微生物膜用磷酸盐缓冲溶液润湿，紧贴于氧电极的聚四氟乙烯膜表面上，

用塑料圈固定好，组成微生物传感器。

4、测试步骤

将膜放入盛有磷酸盐缓冲溶液和定量GGA的溶液，恒温（33±1℃）、不断曝

气以保证溶解氧充分，如此活化一天，就可以正常使用了。

测量时向测量池中加入50矶磷酸盐缓冲溶液中，恒温（33±1℃）、不断曝

气以保证溶解氧充分，传输其输出一恒定电流I。。此时，向测量池中加入一定体

积的GGA标准溶液（浓度为C）,由于微生物同化有机物的作用，传感器输出电

流下降;几分钟后,传感器重新输出一恒定电流L；于是便得到该BOD浓度下的传

感器输出电流的降低值在一定BOD浓度范围内，传感器输出电流降低

BODs测定

开放对象：环境科学、环境工程本科、硕士研究生。

开放时间：正常工作日每周2—5,提前一周到实验室预约。

开放地点：环境科学与工程学院环境科学系生物监测实验室(化环楼431)

要求：遵守实验室规章、听从指导教师指导，爱护仪器设备'损坏设备照价赔偿。

说明：实验可按国家标准方法或国际标准方法进行。国家标准方法可在《水与废

水监测分析方法》找到，国际标准方法5210B见附件

5210BODs测定

1.概述

(1)原理：这种方法是指在一个特定型号不透气的瓶子里盛满样品，在恃定

温度下培养5天，分别测定培养前后的溶解氧，由二者之差即可计算出B0D值。

由于开始的溶解氧是在稀释之后确定的，所以B0D测试中应包括测试之后摄取的

所有的氧。

(2)取样和储藏：在储藏过程中BOD分析样品在收集和分析之间会有所下降，

导致BOD值降低。在储藏中可以通过迅速分析样品或将它冷却到接近零度将B0D

的降低减至最小。但是，即使在低温度下，也需要保持一定时间才能减到最小值。

分析之前加热冷却的样品至20±3℃o

①取样一如果分析在采样2小时之后开始，就没必要进行冷却储存。如果不

是，收集之后保持样品在4℃以下，6小时之后进行分析。如果取样地点离实验

室很远，就将其在4℃下保存，并随结论记录保存时间和温度。不能在取样24

小时之后再进行分析。当样品进行校准时，则应尽量在收集后6小时内送回样品

行分析。

②混合样品一混合时保持样品在4c以下，限制混合时间在24小时之内。

和取样时的储存原则一样，从混合阶段后期一直保持到测试，记录储存时间和条

件作为部分结论。

2.仪器

培养箱：使用60mL或更大容积的玻璃瓶(300mL,带有磨口玻璃塞和火炬嘴)。

用洗涤剂清洗玻璃瓶，充分漂洗，烘干后方能使用。为谨慎起见，不使空气进入

稀释瓶，采用水封。可以在水浴中倒置玻璃瓶或往瓶中加水至火炬嘴进行水封。

在火炬嘴上放置一张纸或塑料杯或衬纸来减少培养过程中水封的蒸发。

空气培养箱或水浴，温度控制在20±1℃。避光放置，阻止光合作用产生溶

解氧的可能。

3.试剂

事先准备试剂，如果储存瓶中出现任何沉淀或生物增长的现象必须遗弃。这

些试剂的工业等价物也是可以的，如果剂量按比例调配，不同储存浓度也可以使

用。

磷酸盐溶液：将8.5g磷酸一氢钾(KH3P04),21.75g磷酸二氢钾(K^POJ,

33.4g七水合磷酸氢二钠(Na2HpOJ和1.7g氯化铉(NH.C1)溶于500ML蒸储水

中，稀释至1L。如果没有进一步调整此溶液，PH值应为7.2。第二种做法，将

42.5g磷酸二氢钾(K2HP04)溶于700ML蒸储水中,用30%Na0H调节PH值到7.2

并稀释至ILo

硫酸镁溶液：将22.5g七水合硫酸镁(MgS047H20)溶于水中并稀释至1L

氯化钙溶液：将27.5g无水氯化钙(CaCL)溶于水中并稀释至1L。

氯化铁溶液：将0.25g六水合氯化铁(FeCl⑹IQ)溶于水并稀释至1L。

酸和碱溶液，1N,对于中和腐蚀性和酸性废水样品。

酸一一边摇动，一边将28mL浓硫酸缓慢加到蒸储水中，并稀释至1L。

碱一将40g氢氧化钠溶于蒸储水中并稀释至ILo

亚硫酸钠溶液:将1.575g亚硫酸钠溶于1000ML蒸循水中，这种溶液不稳定,

需每天配置。

硝化抑制剂：2一氯代一6一三氯甲酯叱咤。

葡萄糖一谷氨酸溶液：将葡萄糖和谷氨酸在103c下干燥1小时后，各称取

150g溶于蒸储水并稀释至1L。此溶液需临用前配置。

氯化镂溶液：将1.15g氯化铉溶于500mL蒸福水中，用氢氧化钠调节PH值

到7.2,然后稀释至1L溶液包含0.3Nmg/mL。

稀释水：使用非矿化水、蒸储水、自来水或天然水对样品进行稀释。

4.步骤

（1）稀释水的制备：在合适的玻璃瓶中装入一定量的水，每升水中加入1矶

磷酸盐溶液、硫酸镁溶液、氯化钙溶液、氯化铁溶液。

使用前将稀释水的温度调到20±3℃,然后搭动装满样品的玻璃瓶或用空气

压缩机曝气使溶解氧达到饱和。或者，放置在带有棉花塞的玻璃瓶中数小时使其

溶解氧接近饱和。为保证水质需使用干净的玻璃器皿、试管和玻璃瓶。

（2）稀释水的储存：只要制备的稀释水满足稀释水空白实验中的质量控制

要求，原水便可以储存。这样的储存会改善一些原水的水质，但也会引起生物生

长而导致其他原水的变质，制备的稀释水在加入营养物、矿物质和无机盐之后，

储存最好不要超过24小时，除非稀释水空白实验满足质量控制极限，如果稀释

水空白实验表明大于0.2mg/L的溶解氧在5d内耗尽，就必须丢弃储存的原水.

（3）葡萄糖一谷酸氨的检验：因为BOD测试是一个生物测定，所以一些有

毒物的出现或一些接种材料的使用都会对它的测量结果造成很大的影响。蒸溜水

经常被铜污染，一些污水接种液也相对不活跃。利用这些接种溶液和污水得到的

结果经常偏低。利用各含150mg的葡萄糖和谷氨酸的标准溶液测试BOD来定期检

验稀释水质、接种液效果和分析技术。葡萄糖的氧化率极高且变化多样，但它和

谷氨酸混合使用时，氧化率便会稳定且接近于含有大量市政废水的污水。换一种

说法，如果一种特定的污水含有可识别的关于BOD的主要成分，那么就可以使用

这种化合物代替葡萄糖一谷氨酸。

调节工业混合物的浓度使之在每个GGA测试瓶中达到葡萄糖和谷氨酸

3mg/Lo

（5）接种

接种源：有必要确定一个微生物种群，即能够氧化样品中可进行分解和氧化

处理的有机物质、生活污水、来自生物废水处理厂的未被氯化或其它未经消毒的

污水、接受污水排放的地表水都满足条件的微生物种群。一些样品不含足够的微

生物种群（例如，一些未经处理的工业废物、消毒后的废物、高温废物或PH值

偏高偏低的废物），对于这些废物，可通过增加一个微生物种群来接种稀释水或

样品。最好使用污水或来自加工废物的生物处理系统的混合液。如果这种接种不

合适，可以使用来自生活污水的浮在表层的东西，而其必须在室温下保存1到6

小时之间。当使用污水或生物处理加工的混合液时，应进行硝化抑制。

在某些生活污水中，有些样品可能包含难于被微生物以正常速度降解的有机

物。接种这些样品则需用与未经消毒的污水或生物加工处理废物的混合液的相适

合的微生物种群。如果没有，可以从接收污水排放点的下游(最好3-8km)获得

接种液。当这种接种液源仍旧不适用，可以在实验室通过对某些生活污水进行连

续曝气或少量增加日废物增值量来获取合适的接种液。如无这种水源，可以在实

验室取某种生活污水进行连续曝气，每天加入该废水。任取一种土壤悬浮液或活

性污泥或工业废水来获得最初的微生物种群。在对样品进行BOD测试中通过检查

接种液的变化来确定适用的微生物已经存在，BOU值随适应时间增加到一个稳定

的高值时表明接种液适用。

接种控制-即确定其它样品接种液的ROD.由接种控制值和接种稀释水确定

接种溶解氧的摄取，理想状况下，接种稀释至最大量会导致至少50%溶解氧被消

耗。在溶解氧消耗中，以mg/L计，与每血，接种液相比，凡消耗溶解氧大于2mg/L

和剩余溶解氧大于lmg/L应做一条直线，其倾斜度表明每mL接种液所消耗的溶

解氧。此溶解氧曲线的截距是由稀释水引起的氧消耗，而且其值应小于0.lmg/Lo

或者，对每一个消耗溶解氧2mg/L和剩余溶解氧1.Omg/L的接种控制瓶划分溶解

氧消耗，其依据是以每mL计的接种容积。把满足最低溶解氧消耗和剩余溶解氧

标准的所有瓶子的结果取平均值。溶解氧的摄取可归因于加入到每个瓶子的接

种，其值应在0.6到1.Omg/L,但是增加的接种数量应在这个范围进行调节，使

其满足提供的葡萄糖-谷氨酸检验引起的范围：198±30.5mg/L。测试瓶中的溶解

氧就是从总的溶解氧生减去由于接种摄取的溶解氧。

在稀释水中添加接种液的技术包括两种样品稀释法。

(6)水样的预处理：测试之前检验水样的PH值，除非先前经验表明PH值

在可接受的范围内。

水样含有腐蚀性碱性(PH>8.5)或酸性(PHV6.0,可用H2s0,或NaOH溶液

调节PH至6.5到7.5,但用量不要超过水样体积的0.5%0稀释水的PH值不应受

最低样品稀释的影响，接种样品应经常调节PH值。

若水样中含有游离氯，可在氯化之前取样。如果水样被氯化但无游离氯可接

种稀释水，若游离氯存在，对水样脱氯然后接种稀释水。在没有接种稀释水前不

能测试氯化或脱氯水样。一些水样在光线下放置l-2h氯即可消失。这样的情况

在样品运输和处理过程中经常会出现。对于游离氯在短时间不能消散的水样，可

加入NaSOj溶液以除去之，其加入量由下述方法确定：取已中和好的水样100至

1000mL,加入1+1乙酸或14-50H2S0410ml,10%Kl溶液(lOg/100mL)10mL,

以淀粉溶液为指示剂，用NES()3溶液滴定游离碘。将由上述试验确定的Na2s洛

液加入到中和的水样，混合，10-20分钟后检验水样中的游离氯(注:过量的Na2S03

会影响氧量，而且会和氯化后水样中存在的某些有机氯化合物缓慢反应)

水样含有其他有毒物质一某些工业废水，例如印染废水含有有毒金属，这

样的样品需特定研究和处理。

水样含有过饱和溶解氧一从水温较低或发生光合作用的水域采集的水样在

20℃溶解氧会超过9mg/Lc在培养这些样品时为防止氧的损耗，应将水样升温至

20℃,在不使满瓶的情况下，充分振摇搅拌或用纯净过滤压缩空气进行曝气，将

溶解氧减至饱和。

水样温度调节一稀释之前将水样调至20±l℃o

硝化抑制剂一如果需要抑制剂，可以在水封之前在每个300mL瓶子里加3mg

2一氯代一6三氯甲酯哦咤(TCMP),或往稀释水中加入足量使得最后浓度为

10mg/L(注：纯的TCMP溶解很慢且会悬浮在水样之上。一些工业方法溶解较稳

定但不足100%TCMP,可酌情调节剂量)。需要硝化抑制剂的水样包括生物处理污

水、由生物处理污水做接种液的水样和河水，但乜不仅限于此。记录结果时应注

意硝化抑制剂的使用。

(7)稀释技术：做几个稀释水样，培养5天后它会使溶解氧大于lmg/L,

以及摄取的溶解氧大于2mg/L。建议5倍稀释，除非某种样品的经验表明一个较

小的稀移数字就可以产生至少两瓶可接受的溶解氧消耗和剩余极限。种快速分

析方法，如COD,与BOD大致相关，并且作为稀释倍数的基准。若知识不足，使

用下列稀释倍数：工业废水0.1到L0%,未经处理的某种污水1到5.0%,生物

处理污水5-25%,被污染的河水25T00%。在量筒或容量瓶中制备稀释水，然后

转移到BOD瓶或直接在BOD瓶中制备，任何一种稀释方法都与溶解氧测定技术有

关。溶解氧技术和所需的平行测定次数决定了每次稀释制备所需的瓶子的次数。

当用量筒或容量瓶制备稀释水，而且需要接种时，将接种液直接加入稀释水中或

在稀释前加到量筒或容量瓶中，单个量筒或容量瓶接种避免了样品接种率随稀释

倍数增加而降低的情况。当直接在BOD瓶中制备稀释水，且需要接种时，直接对

稀释水或BOD瓶进行接种。当稀释后瓶中仍含有大于水样的67%,营养物就会受

到限制，并由此降低生物活性。在这些水样中，直接往每个BOD瓶中以ImL/L

（0.33mL/300mL瓶子）的速率加入营养物、矿物质和缓冲溶液或使用根据合适

瓶号设计的工业制剂。

在量筒或容量瓶中制备稀释水一如果使用碘量法的叠氮化钠改良法且需要

接种，用虹吸法引入稀释水于1到2L量筒或容量瓶中。装一半满且不要进入空

气。加入一定量的混合样品，用稀释水把它稀释至一个合适的比例。用带胶板

的玻璃棒搅拌，使之混合均匀，避免进入空气。用虹吸法将混合稀释水引到两个

ROD瓶，确定其中一瓶的溶解氧，另一瓶水封后，放入培养箱，在20T下培养5

天。如果用薄膜电极法测定溶解氧，用虹吸法将稀释混合物转移到BOD瓶，确定

这个瓶子的溶解氧，来代替其它盛有稀释水样的瓶子。轻轻地盖上塞子，20c下

培养5天。

直接在BOD瓶的制备稀释水一使用顶端较宽的吸管，将所需容量样品加到每

个已知容积的BOD瓶中。将一定量接种液加到每个BOD瓶或稀释水中。若需要接

种，瓶子里装满稀释水，以便插入胶塞堵住空气，且不产生气泡。在最后稀释之

前量筒里的主要稀释倍数大于1：100。当使用碘量法测试溶解氧时，每次稀释

时准备两个瓶子。确定其中一个瓶子的溶解氧。第二个瓶子轻轻地盖上胶塞，水

封，20C下培养5天。如果用薄膜电极法测定溶解氧，每次稀释只需准备一个

BOD瓶，确定这个瓶子的溶解氧来代替其他盛有稀释水样瓶子，然后盖上胶塞，

水封，20℃下培养5天。每次测定要清洗溶解氧电极，避免水样的交叉污染。用

碘量法的叠氮化钠改良法或薄膜电极法确定最初的溶解氧，包括所有的稀稀水

样，稀释水空白和接种控制适当的地方。如果使月薄膜电极法，那么碘量法可作

为溶解氧测定的标准。

开始溶解氧的确定：如果水样含有•能与溶解氧迅速反应的成分，在BOD瓶装

满稀释水样后应立即测定溶解氧，如果溶解氧的快速摄取是可以忽略的，那么从

稀释制备到溶解氧测试这段时间就不是很关键，但也不应该超过30分钟。

稀释水空白：用一个稀释水空白可以粗略检验未接种稀释水的质量和培养瓶

的清洁程度。每组水样有一瓶未接种稀释水。溶解氧摄取不应超过0.2mg/L,最

好不要超过0.Img/L丢弃所有的溶解氧摄取超过0.2mg/L的稀释水，消灭污

染源或重新选择一个稀释水源。

培养：在20±1℃下培养，BOD瓶中有所需稀释水、接种控制、稀释水空白

溶液和GGA标准溶液。

最后溶解氧的测定：5天培养后，像4g一样在水样稀释空白和检验方面确

定溶解氧。

5.计算

在每一个测试瓶中满足2.0mg/L的最小溶解氧消耗和1.0mg/L的剩余溶解

氧,按下列方法计算BOI值：

未接种的稀释水：B0D5,mg/l=l)-I)2

接种稀释水：B0D5,mg/L=[(D-D2)-(B-B2)f]/P

式中：Di一制备之后立即测定的稀释水样的溶解氧，mg/L；

D2—20C下培养5天后稀释水样的溶解氧，mg/L；

P一水样在培养液中所占的比例；

Bi一培养前接种稀释水的溶解氧，mg/L；

Bz一培养后接种稀释水的溶解氧，mg/L；

f一接种稀释水在培养液中所占比例，即稀释水样中接种%/培养液

中接种%;如果直接将接种液加到水样或接种控制瓶；

f二稀释水样中接种容积/接种控制瓶中接种容积

如果硝化作庄被抑制，记录结果作为CB0工值。

如果不止一个水样稀释满足此基准，即剩余溶解氧至少1mg/L和溶解

氧消耗至少2i%/L,而且水样较高浓度时无毒性特征或任何明显的异常反应,

平均值即在可接受的范围内。