第二章-蛋白质

第二章蛋白质

第一节概述第二节蛋白质的基本结构单位—氨基酸第三节蛋白质的分子结构第四节蛋白质分子结构与功能的关系第五节蛋白质的性质

第六节蛋白质的制备与测定

第七节贮藏和加工对蛋白质性质的影响本章主要内容教学目标1．了解蛋白质的化学组成、分类、主要生理功能;2．掌握蛋白质中常见的氨基酸的种类、名称、符号、结构和性质，及其制备与用途;3．掌握蛋白质空间结构的概念、特点、结构与功能的关系;4．掌握蛋白质的一些重要理化性质及其实践意义;5．了解蛋白质的制备方法，贮藏加工中蛋白质的变化第一节概述

由氨基酸通过肽键而形成的高分子化合物，具有一定的空间构象并执行一定的生物功能的生物大分子。概念一、蛋白质的生物学意义

蛋白质是生命的物质基础，是生命活动的体现者。其作用体现在：没有蛋白质，就谈不到生命。

①构成细胞和生物体——结构蛋白②催化、运动、运输、调节、免疫、生长、繁殖、遗传和变异作用——功能蛋白

二、蛋白质的元素组成与分类碳氢氧氮硫其他50％~55％6％~7％20％~23％15％~17％0~4％微量只要测定出样品中的含氮量即可测知其蛋白质的含量。即：每克样品中含N的克数×6.25×100=蛋白质的含量凯氏定氮法蛋白质的平均含氮量为16%,即1克N相当于6.25克蛋白质（100÷16=6.25），由此可估算蛋白质含量。第二节蛋白质的基本结构单位

—氨基酸

从各种生物体内发现的氨基酸已有180多种，但参与蛋白质组成的常见氨基酸只有20种，这20种氨基酸称为蛋白质氨基酸。实验证明氨基酸（Aa）是蛋白质的基本组成单位。

氨基酸是含有氨基的羧酸。即羧酸分子中α-碳原子上的一个氢原子被氨基取代而成的化合物。一、氨基酸的结构通式:HNH2COOHRCa不带电形式

NH3HCOORCa两性离子形式

不同AAR基不同

除脯氨酸外，其余氨基酸在结构上的共同点是与羧基相邻的a–碳原子上都有一个氨基，因而称为a–氨基酸。除甘氨酸（R=H）外，其它氨基酸所含的a-碳原子均为手性，均有旋光性。天然氨基酸均为L-型。二、氨基酸的分类

1）根据侧链R结构不同，可分为：2）根据侧链R的极性不同，可分为：

3）根据氨基酸在水溶液中的酸碱性不同可分为：

4）根据生物体能否合成可分为：氨基＝羧基氨基＜羧基氨基＞羧基脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸、杂环氨基酸。极性氨基酸、非极性氨基酸中性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸必需氨基酸、非必需氨基酸。几种氨基酸分子式举例甘氨酸丙氨酸CNH2COOHHCH3CNH2COOHHCH2COOH天冬氨酸HCNH2COOHHα几种氨基酸分子式举例半胱氨酸脯氨酸色氨酸精氨酸几种氨基酸分子式举例谷氨酸苯丙氨酸组氨酸三、氨基酸的重要理化性质（一）物理性质

1．物理性状和熔点：2．溶解度：

3．味感：4．旋光性：

除甘氨酸外，所有的氨基酸都有不对称碳原子，因此具有旋光性（二）两性解离及等电点负离子两性离子正离子

AA分子中既有酸性的-COOH，又有碱性的-NH2，在水溶液中既能解离出H+，又能接收H+，因此具有两性。在溶液中氨基酸所带正、负电荷数相等时，净电荷为零，在电场中不移动,此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。等电点时，氨基酸的溶解度最小，容易沉淀。pH>pIpH>pIpH<pI氨基酸的等电点氨基酸等电点（pI）的计算COOHH3NCHCH3COONH2CHCH3K1K2COOH2NCHCH3两性离子

氨基酸的等电点可由其解离基团的解离常数来确定：先写出氨基酸的解离方程，然后取两性离子两边的pK值的算术平均值，即可计算出等电点。

解离常数K1、K2的负对数分别用pK1和pK2表示，则pI=(pK1+pK2)/2例1、丙氨酸(Ala)例2、天冬氨酸（Asp）pI值的计算COOHCHNH3CH2COOHAsp+

COOHAsp+

NH3CHCH2COO

K1Asp—NH3CHCH2COO

COO

K2

Asp=

NH2CHCH2COO

COO

K3在溶液中氨基酸随pH升高而逐级解离，并总是pK小的基团先解离，对有三个解离基团的氨基酸，第三级解离可忽略不计，仍以靠近两性离子的两个pk计算其pI。

天冬氨酸两性离子两侧解离常数分别为K1和K2因此pI=(pK1+pK2)/2例3、赖氨酸（Lys）pI值的计算NH3COOHCH(CH2)4NH3Lys++

Lys+

CH(CH2)4COO

NH3NH3K1NH3NH2CH(CH2)4COO

Lys-

K3LysCH(CH2)4COO

NH3NH3K2+Lys两性离子两侧解离常数分别为K2和K3因此pI=(pK2+pK3)/2（三）氨基酸的化学性质

1．与亚硝酸反应2．与甲醛反应3．与茚三酮反应4．脱羧反应5．成盐反应6．与金属离子反应7．羰氨反应（美拉德反应）1．与亚硝酸反应a-羟基酸a-氨基a-氨基可与亚硝酸作用放出氮气（N2）

用气体分析仪测定生成氮气的体积，即可计算出氨基酸的含量，应注意放出的N2仅有一半来自氨基酸。这是范氏（VanSlyke）定氮法的基础。此法可用于氨基酸定量及蛋白质水解程度的测定。HNO22．与甲醛反应

氨基酸虽是两性电解质却不能用酸、碱滴定法测定，这是因为其等当点pH值或过高或过低，没有适当的指示剂。用甲醛处理氨基酸增强了氨基酸分子—+NH3基的酸性解离,从而可用酚酞作指示剂用NaOH滴定。

氨基酸的甲醛滴定是测定氨基酸的一种常用方法。3．与茚三酮的反应

在弱酸性溶液中，氨基酸与水合茚三酮溶液一起加热生成蓝紫色的物质并放出CO2。两个亚氨基酸——脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色化合物。氨基酸的电泳分析中，常用茚三酮作显色剂4．脱羧反应NH2COOHCHR脱羧酶

CHRNH2+CO2

氨基酸经氨基酸脱羧酶作用，生成相应的一级胺（伯胺）并放出CO2气体。测定出所释放CO2的量即可知溶液中氨基酸的含量。目前氨基酸发酵生产中普遍用此法进行生产检验。5．成盐反应+NaOHNH2COOHCHRCOONaNH2CHR味精即为谷氨酸的钠盐氨基酸分子中的羧基可与碱反应生成盐。6．与金属离子反应氨基酸可与一些金属离子如Zn2+、Ca2+、Ba2+等反应生成难溶于水的络合物。应用氨基酸此性质，可以分离提取某种氨基酸。7．美拉德反应（

Maillard反应）氨基酸或蛋白质中游离-NH2基与葡萄糖中的羰基能发生反应，生成一类黑色化合物，这一反应称为美拉德反应。

这种黑色物质有芳香味，呈酸性。可以使食物形成颜色（类黑色素）和独特的风味，如酱油的酱色、烤肉的颜色与香味。食品在制造、干燥及贮存时发生褐变现象，其原因之一就是有美拉德反应发生。

然而黑色素是一种不发酵性物质，它的形成意味着原料的浪费，该物质的形成对发酵利少弊多。四、氨基酸的制备和用途（一）制备方法

蛋白质水解法人工合成法微生物发酵法蛋白质经酸、碱或多种蛋白酶水解后，最终可得氨基酸产物。

用有机合成方法制备氨基酸。缺点是所得的氨基酸都是外消旋产物。如味精的生产，氨基酸的这一生产途径前景良好。（二）用途

1．科学研究：3．医药工业：氨基酸可用于治疗多种疾病；4．工业原料：2．食品工业：5．农业：用作饲料添加剂、制备氨基酸农药等。主要用作调味助鲜和营养添加剂，也可改善面包品质；可用于合成人造革、洗涤用品、化妆品等；五、肽与肽键COOHCHNR2HHR1CNH2CHOOHH2O肽肽键

一个氨基酸的a-羧基和另一个氨基酸的a-氨基脱水缩合而成的化合物称肽。两者间所形成的键称肽键，又称酰胺键。肽键是蛋白质分子中氨基酸残基的主要连接方式。CR1NC

HOH二肽R3CNH2CHO

最简单的肽由两个氨基酸组成，称为二肽，两者间有一个肽键。由几个氨基酸缩合形成的肽就称为几肽，如含有三个、四个、五个氨基酸的肽分别称为三肽、四肽、五肽等。COOHCHNR2H三肽多肽每形成一个肽键失去一分子水。氨基酸残基、肽键的性质、肽平面肽键中-C-N-键的性质介于单、双键之间，具有部分双键的性质，因而不能旋转，使肽键周围六个原子基本上同处于一个平面，这就是肽平面。多肽链中的氨基酸由于参加肽键的形成已不是完整的氨基酸分子，称为氨基酸残基。COOHCHNR2HR1CNH2CHO肽的理化性质短肽的晶体熔点很高；其酸碱性质主要决定于肽链游离末端α-NH2、α-COOH及侧链R基上的可解离基团，具有两性性质。NH2末端的氨基酸残基也能与茚三酮反应，生成有色物质；肽和蛋白质能发生特有的双缩脲反应。活性肽是指生物体内存在着的一些天然肽，具有特殊的生物学功能。1．谷胱甘肽（GSH）由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，分子中有一个特殊的γ-肽键，由谷氨酸的γ-羧基与半胱氨酸的а-氨基缩合而成，在体内氧化还原过程中起重要的作用。2.催产素和加压素两者都是9肽，结构相似。催产素具有催产及使乳腺排乳作用；可促进遗忘。

加压素有升高血压，减少排尿的作用，也称抗利尿激素；参与学习记忆。3.脑啡肽

它们在中枢神经系统中形成，是体内自己产生的一类鸦片剂有镇痛作用。第三节蛋白质的分子结构一、蛋白质分子的一级结构二、蛋白质分子的空间结构（构象）

蛋白质是由氨基酸通过肽键组成的高分子化合物。其分子结构包括：蛋白质的空间结构又分为二级、三级、四级结构一、蛋白质分子的一级结构一级结构是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，是由氨基酸通过肽键和二硫键相连而成。

蛋白质一级结构是蛋白质作用的特异性、空间结构的差异性及生物功能多样性的基础。不同蛋白质单链数不同：

牛核糖核酸酶由一条链组成；胰岛素分子由两条链组成；血红蛋白由四条链组成。蛋白质测序的基本原理是重叠对比法，基本操作如下：（1）将已纯化的蛋白质各条链分开，每条链用至少两种方法切割成两套小的肽片段。（2）用肽链末端分析法，测定肽片段的氨基和羧基末端氨基酸，通过Edman法测定每个肽片段的氨基酸排列次序；（3）将两套片段的顺序进行对比分析，依靠片段之间序列的重叠建立相邻关系，最后得出每一条链的全部序列。一级结构举例SSSS719301SS711202116A链B链N-端C-端

牛胰岛素分子由51个氨基酸残基组成的两条链构成，两条链之间通过二硫键联接。

牛胰岛素最先被确定一级结构的蛋白质，主要调节糖代谢。

二、蛋白质分子的空间结构

蛋白质的空间结构即蛋白质的构象，也称高级结构，是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。

蛋白质构象是指因单键的旋转而形成的不同碳原子上各取代基或原子的空间排列，只需单键的旋转即可形成新的构象。理论上一条多肽主链可能有无限多种构象。然而，一种蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和pH下只有一种或很少几种构象，并为生物功能所必需。(一)维持蛋白质分子构象的化学键1．

氢键

5．酯键2．二硫键3．盐键4．疏水键(─S─S─)（―NH+3······-OOC―）蛋白质分子中次级键作用示意图(二)蛋白质分子的二级结构是指蛋白质分子的多肽链主链原子的局部空间排布，即构象，不涉及侧链部分的构象。氢键是维系二级结构的重要作用力。二级结构的类型α–螺旋β–折叠β-转角无规卷曲α–螺旋氨基酸残基的侧链伸向外侧。α–螺旋是蛋白质中最常见，含量最丰富的二级结构，蛋白质中的α–螺旋几乎都是右手的；多肽主键绕中心轴螺旋上升，每圈3.6个氨基酸残基，沿螺旋方向上升0.54nm;相邻两圈螺旋之间靠肽键中C＝O和-NH形成许多链内氢键，是稳定α－螺旋的主要作用力；主要存在于天然β–角蛋白，如蚕丝丝心蛋白；肽链高度伸展，肽链平面之间折叠成锯齿状；β–折叠可分为两种：一种是平行式，一种是反平行式。β–折叠两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的C＝O与-NH形成氢键，这样的多肽构象就是β–折叠。β-转角β-转角中，第一个氨基酸残基的C＝O与第四个残基的NH之间形成氢键，产生一种环状结构。蛋白质分子中肽链出现180°的回折，在这种回折角处的构象就是β－转角。无规卷曲

多肽链中部分肽链的排列没有规律性，肽键平面松散、不规则地排列，这部分结构称为无规卷曲。（三）超二级结构目前发现的超二级结构有三种基本形式：αα、βββ、βαβ，尤以βαβ组合最为常见。

是指在多肽链内相邻的二级结构单元在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的二级结构聚集体。超二级结构示意图βαββββαα（四）纤维状蛋白质

胶原蛋白由原胶原蛋白分子组成，每一个原胶原蛋白分子又是由3股具有左手螺旋结构的多肽链相互作用而成的右手螺旋即三股螺旋。

胶原蛋白

纤维状蛋白质外形呈纤维状或细棒状，分子轴比（长轴/短轴）大于10.（小于10的为球状蛋白质）毛、发、动物的角、爪等由α–角蛋白构成，它是α–螺旋的典型实例。丝心蛋白是天然的β–角蛋白，它是典型的反平行式β–折叠片。角蛋白（五）球状蛋白的三级结构蛋白质三级结构的稳定主要靠次级键，包括疏水键、氢键、盐键以及范德华力。蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的三维空间结构。1．三级结构构象的共同特点：（5）三级结构的形成意味着蛋白质分子的生物活性部位的形成。（1）三级结构构象近似球形。（2）一般情况下，亲水基团相对集中在球形分子的表面，疏水基团相对集中在分子内部，形成所谓“亲水表面，疏水核”。（3）疏水键在维持三级结构构象方面起重要作用。（4）整个分子较为紧凑地束缚在一起，内部只有能容纳几个水分子的小空腔或完全缺乏这种小腔。2．活性部位是指三级结构构象中由少数必需基团组成的，负责完成生物功能的一个空间小区域。球蛋白质分子的活性部位，又叫活性中心。三级结构是球状蛋白质分子生物活性所必须具备的结构形式。

肌红蛋白三级结构示意图（六）蛋白质分子的四级结构

许多球蛋白是由两条或多条肽链构成的，这些肽鲢间并无共价键连接，每条肽链都有各自的一、二、三级结构，这些肽链称为亚基。

两个或两个以上亚基通过次级键相互作用而形成蛋白质的复杂空间结构称为四级结构。

含有亚基的蛋白质称为寡聚蛋白质。若各亚基相同称均一寡聚蛋白；若各亚基结构不同则称非均一寡聚蛋白。

亚基寡聚蛋白质四级结构的涵义氨基酸亚基蛋白质分子四级结构的形成过程相互作用四级结构多个亚基多肽链脱水缩合螺旋、折迭、盘曲成复杂的空间结构蛋白质四级结构特点：（3）亚基单独存在时无生物活性或活性很小，只有通过亚基相互聚合成四级结构时，蛋白质才具有完整的生物活性。（1）有多个亚基；（2）稳定性主要靠亚基间的疏水键相互作用维持，盐键、氢键、范德华力等次级键也有不同程度的作用。（4）构成更大分子的聚合体。血红蛋白四级结构示意图第四节蛋白质分子结构与功能的关系

一、蛋白质分子一级结构与功能的关系二、蛋白质分子构象与功能的关系①不同肽链中氨基酸种类不同；②氨基酸数目不同；③氨基酸排列顺序不同；④肽链空间结构不同。蛋白质分子结构多样性的原因本节内容一、蛋白质分子一级结构与功能的关系在蛋白质的一级结构中，有少数残基参与功能活性部位的构成或处于特定构象的关键部位，这部分残基对于蛋白质正常发挥功能至关重要。仅一个残基发生变化就导致血红蛋白生物学功能异常，被称为“分子病”。β–链镰刀状红细胞性贫血症就是典型例子：一级结构与空间结构（构象）的关系蛋白质一级结构是空间结构的基础，特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成的次级键来维持。在生物体内，蛋白质的多肽链一旦被合成后，即可根据一级结构的特点自然折叠和盘曲，形成一定的空间构象。二、蛋白质分子构象与功能的关系

蛋白质的构象是其功能活性的基础，构象发生变化，其功能活性也随之改变。蛋白质变性时，由于其空间构象被破坏，故引起功能活性丧失，变性蛋白质在复性后，构象复原，活性即能恢复。

有些蛋白质分子在发挥其生物功能时，构象会改变，从而改变整个分子的性质，这种现象就称为别构现象。如：血红蛋白第五节蛋白质的性质一、蛋白质的相对分子量大二、蛋白质的两性解离及等电点三、蛋白质的胶体性质四、蛋白质的沉淀作用五、蛋白质的变性作用六、蛋白质的颜色反应一、蛋白质的分子量蛋白质是由氨基酸聚合而成的高分子化合物，相对分子量较大，一般在一万到一百万道尔顿之间。测定分子量的方法有多种，如渗透压法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、超离心法等，其中最准确而可靠的方法是超离心法。二、蛋白质的两性解离及等电点蛋白质分子中具有可解离基团，分别可以使其带上正、负电荷，因此蛋白质也具有两性，在电场中也可以电泳。也可以利用等电点对蛋白质进行分离提纯。蛋白质电泳的方向主要决定于它所带电荷的性质；而泳动速度则取决于所带电荷的量及分子颗粒大小。实践中常利用电泳来分析、分离蛋白质混合物或作为蛋白质纯度鉴定的手段。三、蛋白质的胶体性质蛋白质分子颗粒直径在1～100nm之间，恰好在胶体粒子的直径范围。又由于蛋白质分子表面有许多极性基团亲水性极强，易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液。

蛋白质亲水胶体具有稳定性，是由于：蛋白质胶体不易透过半透膜，因此可用透析法纯化蛋白质。一、水化膜二、表面电荷四、蛋白质的沉淀作用1.概念蛋白质颗粒表面的水化膜和电荷使其胶体溶液保持稳定，当这两个因素遭到破坏后，蛋白质溶液就发生凝聚而沉淀析出，这种作用称为蛋白质的沉淀作用。

第一，分离制备有活性的天然蛋白制品。第二，从制品中除去杂蛋白，或者制备失去活性的蛋白质制品。对蛋白质沉淀作用的实践应用：蛋白质胶体溶液沉淀作用2.沉淀方法1)中性盐法2)水溶性有机溶剂法3)重金属盐法5)热凝固法4)生物碱试剂法盐析五、蛋白质的变性作用天然蛋白质分子由于受各种物理、化学因素的影响，空间结构被破坏，理化性质和生物学性质改变，但一级结构不破坏，这种现象称为蛋白质的变性作用。

1．物理因素2．化学因素（一）概念（二）变性因素五、蛋白质的变性作用1．蛋白质分子的次级键被破坏，使其空间结构发生变化。2．蛋白质的结构发生扭转，使疏水基团暴露在分子表面。3．活泼基团如-COOH、-OH、-NH2等与某些化学试剂反应。1．理化性质发生了变化，易发生凝集、沉淀。2．生化性质发生了变化，更容易被蛋白酶水解。3．生物活性丧失，这是蛋白质变性的最重要标志之一。（四）变性蛋白质的性质（三）变性的原因五、蛋白质的变性作用当蛋白质变性程度较轻时，如果去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，这种变化称为复性。（五）变性的可逆性许多蛋白质变性时被破坏严重，不能恢复，称为不可逆性变性。五、蛋白质的变性作用4高温消毒的本质也是使杂菌的菌体蛋白质变性失活，以达到灭菌的目的。（六）蛋白质变性作用的实践意义举例：1豆腐制作过程中利用加热、点入少量的盐卤（含MgCl2）使蛋白质凝固。2临床分析化验血清中的非蛋白质成分，常用加三氯醋酸或钨酸使血液中蛋白质变性沉淀而去掉。3为鉴定尿中是否含有蛋白质常用加热法来检验。蛋白质盐析与变性的区别是在热、酸、碱、重金属盐（Hg2+、Ag+、Pb2+、Cu2+）、紫外线等作用下，蛋白质发生发性质的改变而凝结。是化学变化，不可逆。是无机盐溶液如Na2SO4、(NH4)2SO4等使蛋白质的溶解度降低而从溶液中析出。是物理变化，可逆。盐析变性六、蛋白质的颜色反应（一）双缩脲反应

蛋白质中有大量α-氨基酸，可与茚三酮作用生成蓝紫色物质。（二）茚三酮反应：双缩脲（NH3CONHCONH3）是两分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。所有蛋白质都能与双缩脲试剂反应。六、蛋白质的颜色反应（三）黄色反应

蛋白质与浓硝酸反应产生橙黄色物质，这是由于蛋白质中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的苯环与浓硝酸作用的结果。皮肤接触到硝酸变成黄色，也是这个道理。（四）乙醛酸反应

蛋白质溶液中加入乙醛酸，混匀后，缓慢地加入浓硫酸，硫酸沉在底部，液体分为两层，在两层界面处出现紫色环，这是蛋白质中的色氨酸与乙醛酸反应引起的颜色反应。六、蛋白质的颜色反应（五）米伦反应蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混和液)后加热即出现砖红色沉淀，此为酪氨酸的酚环所特有的反应。含有酪氨酸的蛋白质均可发和米伦反应。第六节蛋白质的制备与测定分离蛋白质